多相高分子系を探索するためのナノスケール赤外分光法の進歩

サマリー

このプロトコルは三次元多重分子サンプルの性格描写の光熱ナノスケールの赤外分光法の性能を評価するために原子間力顕微鏡検査およびナノスケールの赤外線分光法の適用を記述する。

要約

多相ポリマー系は、数十ナノメートルから数マイクロメートルまで変化する寸法の局所ドメインを包含しています。それらの組成は、通常、赤外分光法を使用して評価され、プローブされたボリュームに含まれるさまざまな材料の平均フィンガープリントを提供します。ただし、このアプローチでは、材料内の相の配置に関する詳細は提供されません。また、2つのポリマー相間の界面領域は、多くの場合、ナノスケールの範囲にあり、アクセスが困難です。光熱ナノスケール赤外分光法は、原子間力顕微鏡(AFM)の高感度プローブを使用して、赤外光によって励起された物質の局所応答を監視します。この手法は、純金表面の個々のタンパク質などの小さな特徴を調べるのに適していますが、3次元多成分材料の特性評価はより困難です。これは、AFMティップでプローブされたナノスケール領域と比較して、サンプルへのレーザー焦点化とポリマー成分の熱特性によって定義される、光熱膨張を受ける材料の量が比較的多いためです。ポリスチレン(PS)ビーズとポリビニルアルコール(PVA)フィルムを用いて、表面分析のための光熱ナノスケール赤外分光法の空間フットプリントを、PVAフィルム中のPSの位置の関数として評価します。ナノスケールの赤外画像に対する特徴位置の影響を調べ、スペクトルを取得します。高分子構造が埋め込まれた複雑なシステムの特性評価を考慮して、光熱ナノスケール赤外分光法の分野における将来の進歩に関するいくつかの展望を提供します。

概要

原子間力顕微鏡(AFM)は、ナノスケール^{の分解能1,2,3}でさまざまなサンプルの形態を画像化し、特性評価するために不可欠になっています。鋭い先端と試料表面との相互作用に起因するAFMカンチレバーのたわみを測定することにより、局所的な剛性測定と探針と試料の接着のためのナノスケールの機能的イメージング^{プロトコルが開発}されました^4,5。軟質凝縮系およびポリマー分析では、局所ドメインのナノ機械的およびナノ化学的特性を探るAFM測定が非常に求められています^6,7,8。ナノスケールの赤外(nanoIR)分光法が登場する前は、AFMティップを化学的に修飾して、AFMの力曲線から異なるドメインの存在を評価し、ティップとサンプルの相互作用の性質を推測していました。例えば、このアプローチは、シクロヘキサン処理ポリスチレン-ブロック-ポリ(tert-ブチルアクリレート)ブロック共重合体薄膜の表面におけるポリ(tert-ブチルアクリレート)のミクロドメインの50 nm^{以下のレベルでの}変換を明らかにするために使用されました9。

赤外光とAFMの組み合わせは、高分子科学の分野に大きな影響を与えました⁶。従来の赤外分光法は、高分子材料の化学構造を研究するために広く使用されている技術である^10,11が、サンプルのプローブに使用される赤外ビームのサイズに比べて領域が小さすぎるため、個々の相および相間挙動に関する情報を提供することができません。赤外顕微分光法は、光学回折限界⁶によって制限されるため、この問題が発生します。このような測定は、IR光によって励起された領域全体の寄与を平均化します。プローブ領域内にナノスケールの相が存在することに起因するシグナルは、後処理中にデコンボリューションする必要がある複雑なフィンガープリントを示すか、検出可能なレベルを下回るシグナルレベルのために失われます。したがって、複雑な媒体中のナノスケールの化学的特徴を探索するためには、ナノスケールの空間分解能と高いIR感度が可能なツールの開発が不可欠です。

ナノIR分光法を達成するためのスキームが開発されており、最初は金属AFMチップをナノアンテナとして使用し^12,13、最近ではAFMカンチレバーの能力を利用して、サンプルのIR照明中に発生する光熱膨張の変化を監視しています12,14,15。後者は、プローブされた材料の吸収帯に調整されたパルス状の調整可能なIR光源を使用しており、サンプルが放射線を吸収して光熱膨張を起こします。このアプローチは、有機材料や高分子材料に適しています。パルス励起により、サンプル表面に接触したAFMカンチレバーが振動の形で効果を検出できます。次いで、周波数スペクトルにおいて観察される系の接触共振の1つの振幅は、照明波長の関数としてモニターされ、これは、AFM探針¹⁵の下の材料のnanoIR吸収スペクトルを構成する。ナノIRイメージングと分光法の空間分解能は、材料の光熱膨張のさまざまな影響によって制限されます。コンタクトモードAFMを用いた光熱ナノ赤外分光法は、50nm以下の空間分解能で物質の振動吸収スペクトル特性を取得できることが評価されており¹⁴、最近の研究では、α-シヌクレインのモノマーと二量体の検出が実証されています^16,17。しかし、様々な高分子フィルムの体積に埋め込まれた有限次元の吸収体の場合など、様々な構成で組み立てられた不均一な高分子材料のナノIR測定の性能に関する定量的研究は、依然として限界があります。

本稿では、表面分析中の光熱膨張の感度とナノIRの空間分解能を評価するために、既知の寸法の特徴が埋め込まれたポリマーアセンブリを作成することを目的としています。このプロトコルは、シリコン基板上にポリビニルアルコール(PVA)ポリマー薄膜を作製し、PVAフィルム上またはPVAフィルムに埋め込まれた3次元ポリスチレン(PS)ビーズの配置をカバーしています。NanoIRイメージングおよび分光法測定は、PVAフィルム上またはPVAフィルムの下に配置された同じPSビーズによって生成されたシグナルを評価するという文脈で説明されています。ビーズ位置がナノIRシグナルに及ぼす影響を評価します。nanoIRマップにおけるビーズの空間フットプリントを評価する方法について説明し、いくつかのパラメータの影響について検討します。

プロトコル

1. ポリビニルアルコール(PVA)溶液の製造

1. 水とPVAポリマーペレット( 材料表を参照)を測定して、PVAと水の重量比が20%になるように10 mLの溶液を調製します。
2. 100°Cに設定したホットプレートでガラス器具の水を加熱します。
3. PVAポリマーペレットを加熱水に入れます。マグネット式攪拌子を挿入します。
4. 火を80°Cに下げ、PVAが完全に溶けるまで攪拌します。
5. 汚染を防ぐためにガラス器具の上部を覆います。
6. 完全に溶解したら、20%PVA溶液を適切な保存容器に入れ、室温で保存します。

2. PVAコーティングシリコン(Si)ウェーハの準備

1. シリコン(Si)ウェーハ( 材料表を参照)を~10 x 10 mm² の正方形に切断します。
2. イソプロピルアルコールを使用してSi基板を洗浄し、乾燥させます。
3. クリーンなSiウェーハをスピンコーターのチャックに置きます( 材料表を参照)。
   1. 約10μLのPVA溶液をSi基板の中心に滴下します。気泡の発生を避けてください。
   2. 毎分1,500回転(rpm)で30秒間スピンコートすることにより、Si基板を均一なPVA膜でコーティングします。
      注:指定された量の液体とスピンコーティングのパラメータにより、スピンコーティングと次のステップでPSビーズをPVA表面に配置するまでの間の急速な乾燥を防ぐのに十分な厚さで、基板の表面全体にPVAの均一な層が作成されます。
4. スピンコーターからサンプルを取り出し、汚染を防ぐために清潔なサンプル容器に入れてから、PSビーズを移し替えてください。

3. PSビーズをPVAコーティング面に塗布する

1. イソプロピルアルコールを使用してSi基板を洗浄し、乾燥させます。
2. ピペットを使用して、水に懸濁したPSビーズ1μLを基板の中央に配置します。
3. ベントナイト粘土乾燥剤を含む保管コンパートメントにサンプルを入れて、水を蒸発させます。
   注意: このステップでは、湿気への暴露を減らすことでサンプルを保存します。
4. PVAコーティングされた基板(ステップ2.4)と乾燥したPSビーズを含む基板(ステップ3.3)を光学顕微鏡下に置きます。サイズに応じて、単純な双眼鏡を使用して単一のビーズが見えるか、より高い光学倍率が必要になります。
5. 極細ピンセットを使用してビーズをそっと緩めます( 材料表を参照)。細いヘアペイントブラシを使用していくつかの緩いビーズを集め、PVAコーティングしたばかりのウェーハ上でペイントブラシの毛を軽くたたきます。複数回スイープすると、ビーズがブラシの毛の中に溜まるようになります。絵筆の毛の上部をタップしてPSビーズの粉を乱し、粘着性のあるPVA表面にビーズを放出します。
   注意: PVAフィルムの表面に繊維や汚染物質が放出されないように、絵筆が高品質で清潔であることが重要です。PVAが完全に乾燥しないように、このステップですばやく移動することが不可欠です。
6. 光学顕微鏡検査で個々のPSビーズがPVA表面に付着していることが確認されるまで、この手順を繰り返します。
7. サンプルは清潔な容器に保管してください。サンプルを完全に乾かします。
   注意: さらに分析を試みる前に、サンプルを完全に冷まして乾燥させる必要があります。AFMの高さ測定または表面プロファイラー測定により、連続するPVAフィルムの厚さを評価できます。

4. AFM特性評価のためのサンプルのロード

注:記載されているプロトコルは、nanoIR2( 材料表を参照)プラットフォームの標準操作手順に基づいていますが、測定に使用するAFMモデルに従って適合させる必要があります。

1. 金属製のAFMディスクと粘着タブを使用して、PVAおよびPSビーズサンプルをAFMステージに取り付け、サンプルがサンプルホルダーにしっかりと取り付けられるようにします。
2. nanoIRプローブ(FORTGGなど)をAFMプローブホルダーに取り付けます。
   注:AFMカンチレバーは、長さ225 μm、幅27 μm、厚さ2.7 μmで、先端半径は10 nm未満です。カンチレバーは、サンプルの上面IR照明に対する反応を制限するために、両面に厚さ45 nmの金膜でコーティングされています( 材料表を参照)。ナノ赤外分光法測定には、使用前にポリジメチルシロキサンフリーの環境で保管されたカンチレバーを使用することが望ましいです。
3. レーザーアライメントノブを回して、読み出したレーザーを片持ち梁の自由端に位置合わせします(レーザー位置のxとyの調整と検出器位置の垂直調整)。
   1. 検出器のSUM信号を最大化します。
   2. 偏向ノブを回して検出器の位置を調整し、レーザーがAFM読み出しシステムの位置感応型検出器の中心に揃うようにし、~0 Vの垂直偏向信号に対応します。
4. AFMの「プローブ」コントロールパネルの ロード アイコンをクリックします。
   1. ウィザード画面のプロンプトに従います。 フォーカス矢印 を使用して、nanoIRカンチレバーの焦点面を決定します。XY 変位コントロールを使用して、カンチレバーを画面の中央(白い十字に揃える)に配置します。
   2. 次に、 フォーカス矢印 をクリックして、サンプルの表面の焦点面を見つけます。
   3. システムの光学ビューとXY変位コントロールを使用して、カンチレバーの先端を目的のビードの上に配置して、 Nextをクリックします。
   4. エンゲージ画面で、「スタンドオフ」を 50μm に設定し、 アプローチのみをクリックします。
5. エンゲージ手順を開始して、イメージング用のチップに近づきます。

5. マルチポリマー試料のトポグラフィー画像およびナノIR画像の作成

1. 標準の「コンタクトモード」でトポグラフィー画像を取得します。PSビーズに対するカンチレバーの位置を設定したら、AFMの「プローブ」コントロールパネルの 噛み合い アイコンをクリックしてアプローチを開始します。ここでは、0.2 Vのたわみ差の噛み合い設定値が研究全体に使用され、~100 nNの力に相当します。
   AFMの「スキャン」コントロールパネルで、 スキャンレート を0.8Hz、 スキャンサイズ (高さと幅)、イメージングに使用する ラインあたりのポイント数と画像あたりのライン数 (ここでは512 x 512を使用)を設定します。[スキャン]をクリックして、トポグラフィー画像を取得します。
   注:カンチレ^バー18 の較正は、カンチレバーがサファイア基板と相互作用して得られたたわみ距離曲線の傾きからたわみ感度(nm / V)を決定することによって行われます(補足図1A)。カンチレバーの剛性は、熱チューニング¹⁹ (補足図1B)から決定される。カンチレバーの共振は、ローレンツ関数を使用して取り付けられます。カンチレバー剛性(N/m)は等分割定理 を用いて決定され、 K_Bはボルツマン定数、Tは温度(T = 295K)、Pは熱同調データのローレンツ近似積分によって決定されるカンチレバーの熱揺らぎのパワースペクトルの面積である²⁰。
2. nanoIR測定では、トポグラフィー画像から特定された対象の特徴にAFMティップを配置します。
   1. nanoIRコントロールパネルの 音叉 アイコンを選択して、カンチレバーの接触共振周波数を決定します。材料に光熱膨張を励起させる照明波数を設定します。掃引するレーザーパルス周波数の範囲を設定し、nanoIRレーザーのデューティサイクルを設定します。「Laser Pulse Tune Window」内の 「Acquire 」を選択します。
   2. マーカーバー(緑色の縦線)を 2 番目の接触共振のピークに配置することで、nanoIR 測定用のチップサンプルシステムの 2 番目の接触共振を選択します。
      注:接触共振モードの選択は、カンチレバーとサンプルの種類によって異なります。
   3. [最適化]をクリックして、IRレーザー焦点領域の中心をカンチレバー先端の位置に合わせます。アライメントは、プローブされた材料の吸収帯に対応する、選択されたIR照明波数で行われます。カンチレバーは、レーザーフットプリントの中央に配置されています(補足図2)。
      注意: アライメントは、レーザーモデルによって波数が異なる場合があります。
   4. IRレーザー照明の背景を取得します。これは、選択したパルス周波数で発光する波長範囲の赤外量子カスケードレーザー(QCL)の出力を測定することで構成されます(補足図3)。これは、nanoIRスペクトルのバックグラウンド補正に重要です。
   5. 波数範囲(ここでは、 Start と Stop をそれぞれ1,530 ^cm-1 と1,800 ^cm-1に設定)、 ステップサイズ (2 ^cm-1)、および測定に使用する 平均の数 を選択して、nanoIRスペクトルを取得します。ステップ5.2.4で収集したバックグラウンドに、測定用に選択したパワーのパーセンテージを乗じた減衰バックグラウンドで測定した光熱振幅で割ることにより、表示されるスペクトルのバックグラウンド補正を実行します。
3. nanoIRイメージングの場合は、イメージングの対象 領域 を選択します。
   1. 「Laser Pulse Tune Window」(音叉アイコンからアクセス)でフェーズロックループ(PLL)の自動調整を有効にします。
   2. 最小周波数と最大周波数を調整して、一般コントロールパネルの2番目の共振モードを中心とする掃引範囲を作成します。
   3. PLLコントロールパネルで ゼロ をクリックして位相をゼロにし、[Laser Pulse Tune]ウィンドウで[ OK ]をクリックします。
   4. nanoIRコントロールパネル内のボックスにチェックマークを付けて、 IRイメージング有効を選択します 。
   5. 「イメージングビュー」コントロールパネルで、高さ(イメージングビュー1)、振幅2(イメージングビュー2)、フェーズ2(イメージングビュー3)を選択して、サンプルのトポグラフィー画像と化学画像を取得します。取得方向をトレース(またはリトレース)に設定します。ラインフィットラインは、取得するサンプルのトポグラフィー画像を観察するためにしばしば必要になります。キャプチャのフィットは [なし] に設定する必要があります。
      メモ: スキャンする方向や使用するカラーパレットなどのスキャン設定は、必要に応じて調整できます。
   6. AFMの「スキャン」コントロールパネルで、 スキャン アイコンを選択します。
   7. 画像を保存するには、「キャプチャ」コントロールパネルの 「今すぐ 」または 「フレームの終了 」アイコンを選択します。
4. データをエクスポートするには、データリスト内の画像またはスペクトルのファイル名を右クリックします。[ エクスポート ] を選択し、エクスポートするファイルの形式を選択します。目的のコンピューター フォルダーの場所にファイルを保存します。

結果

PS((C₈H₈)_n)ビーズを、クリーンなSi基板(図1A)およびPVA((CH₂CHOH)_n)上に堆積しました(図1B、C)。Siへのビーズの密着性が悪いため、このサンプルではコンタクトモードでのnanoIRイメージングを取得できませんでした。代わりに、nanoIRでサンプルの光学的ビューを使用して、金でコーティングされたAFMプローブを接触モードでPSビーズの上部に係合させ、約100 nNの推定力で結合させました(図2A)。パルス赤外レーザーは、PSとPVAの両方がこの波数で吸収すると予想されるため、1,730 ^cm-1でサンプルを励起するように設定しました。レーザーのパルス周波数を掃引して、nanoIRスペクトル測定用のカンチレバーの接触共振を決定しました。接触共振周波数でパルスを流すと、カ...

ディスカッション

AFMとnanoIR分光法を組み合わせると、接触モードのカンチレバーとパルスチューナブルIR光源を使用して、ナノスケールの化学情報を提供できます。高分子材料の体積に有限の次元を持つ吸収体を埋め込むなどのモデルシステムは、画像形成メカニズムの理解を深め、ツールの性能を決定するために重要です。ここで紹介したPS/PVA構成の場合、PVAフィルムの表面の上または下に配置された安定したPSビーズが得られるように最適化を行いました。その結果、スピンコーターから塗布されたSi基板を取り外した直後にPSビーズを堆積させると、密着性が向上することがわかった。PVA層の粘度は、PVAフィルム表面に対するビードの位置決めに影響を与える可能性があります。サンプルを~200°Cで約15分間加熱すると、ビーズのより深い注入が可能になりました。

PSビーズのサイズ(ここでは5μm)により、nanoIRシステムに内蔵された光学顕微鏡を使用して、カンチレバー先端とビーズの中心を迅速に位置合わせすることができます。PVA中のPSビーズやマイクロバブルは光学的にほとんど区別できませんが、ナノIR分析ではサンプルの組成...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10|0 2200 ゴールデンタクロンラウンド	ゼム
5357-8NMピンセットペル	コ
粘着タブ	テッドペラ	16079
AFM金属試料ディスク	テッドペラ	16208
双眼	AmScope
カンチレバーAppNano			FORTGG
細胞培養皿	Greiner bio-one GmbH
デシケーター
フローティング光学テーブル	ニューポート	RS 4000
ホットプレート	VWR
イソプロパノール
Kimwipes	KIMTECH
マグネチックスターバー
ポリスチレンをベースにした微粒子 サイズ:5 & マイクロ;m	SIGMA-ALDRICH	79633
nanoIR2 顕微鏡	ブルカー		コンタクトモード NanoIR2
窒素タンク	エアガス
ペトリ皿	グライナー バイオワン GmbH
ポリビニルアルコール	SIGMA-ALDRICH	363170	このポリマーは87%-89%の加水分解しかなく、1730cm-1
Quantum Cascade Laser	Daylight Solutions		1550-1800 cm-1 レンジ
シリコンウェーハ	MEMC St. Peters	#901319343000
スピンコーター	オシラ