方法論記事

出生後右心室容積過負荷マウスモデルの確立と確認

DOI：

10.3791/65372

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2023年6月9日

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1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、腹部動静脈瘻(AVF)のマウスにおける出生後の右心室容積過負荷(VO)モデルの確立と確認を示しており、VOが出生後の心臓の発達にどのように寄与するかを調査するために適用できます。

要約

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右心室(RV)容積過負荷(VO)は、先天性心疾患の子供によく見られます。発達段階が異なることから、RV心筋は、成人と比較して小児のVOに対して異なる反応を示す可能性がある。本研究は、修正された腹部動静脈瘻を用いたマウスの出生後RVモデルを確立することを目的としています。VOの作成とRVの以下の形態学的および血行動態的変化を確認するために、腹部超音波検査、心エコー検査、および組織化学的染色を3か月間実施しました。その結果、出生後マウスの処置は、許容可能な生存率と瘻孔の成功率を示しました。VOマウスでは、RV腔を肥厚した自由壁で拡大し、手術後2か月以内にストローク量が約30%〜40%増加しました。その後、RV収縮期血圧が上昇し、対応する肺動脈弁逆流が観察され、小肺動脈リモデリングが現れた。結論として、修正動静脈瘻(AVF)手術は、出生後のマウスでRVVOモデルを確立するために実行可能です。瘻孔閉鎖や肺動脈抵抗の上昇の可能性を考慮し、適用前に腹部超音波検査と心エコー検査を行い、モデルの状態を確認する必要があります。

概要

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右心室(RV)容積過負荷(VO)は、先天性心疾患(CHD)の子供によく見られ、病的な心筋リモデリングと長期予後不良につながります1,2,3。RVリモデリングと関連する早期標的介入の深い理解は、CHDの子供で良好な結果を得るために不可欠です。大人と子供の心臓の分子構造、生理学的機能、および刺激に対する応答にはいくつかの違いがあります1,4,5,6。例えば、圧力過負荷の影響下では、心筋細胞の増殖が新生児の心臓の主な反応であるのに対し、線維化は成人の心臓で起こります5,6。さらに、成人の心不全の治療に有効な多くの薬は、小児の心不全には治療効果がなく、さらなる損傷を引き起こす可能性さえあります7,8。したがって、成体動物から導き出された結論は、若い動物に直接適用することはできません。

動静脈瘻(AVF)モデルは、さまざまな種の成体動物において、何十年にもわたって慢性心VOおよび対応する心機能障害を誘発するために使用されてきました9,10,11,12,13。しかし、出生後のマウスのモデルについてはほとんど知られていない。これまでの研究では、腹部AVFの作製により、出生後VOマウスモデルの作成に成功しました。出生後の心臓におけるRVの発達経路の変化も実証された14,15,16,17。

根底にある修正された外科的プロセスと現在のモデルの特徴を調査するために、詳細なプロトコルが提示されます。この研究では、モデルを 3 か月間評価します。

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プロトコル

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ここで紹介するすべての手順は、ヘルシンキ宣言に概説されている原則に準拠しており、上海小児医療センターの動物福祉および人間研究委員会(SCMC-LAWEC-2023-003)によって承認されました。本研究では、C57BL/6マウスの仔マウス(P7、雄、3-4 g)を使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。仔マウスとその授乳中の母親(仔:母親=6:1)を、22〜2°Cで12時間の明暗サイクルで、特定の病原体を含まない実験室条件下で飼育し±水と栄養食を自由に使用しました。仔犬は、VO群と偽手術(偽)群の2つのグループに無作為に割り付けられました。

1.機器と手術器具の準備

注:すべての材料/機器の商業的詳細は、 材料表に記載されています。

  1. 手術台(発泡プラスチックパネル)、吸入麻酔器、垂直照明と内蔵カメラを備えた顕微鏡、24 MHzトランスデューサーを備えた超音波装置、およびサーモスタット加熱プラットフォーム。
  2. 手術器具(マイクロニードルホルダー、先端の細い鉗子、丸い柄のバンナススプリングハサミなど)を滅菌します。
  3. 次の消耗品を組み立てます:糸付き11-0および9-0外科用縫合針(テーパーポイント)、テープストリップ、5 mLシリンジ針、2-0シルク(外科的固定)、滅菌綿棒、および超音波ジェル。
  4. ベタジン、70%エタノール、通常の滅菌生理食塩水、イソフルラン、アセトアミノフェン、眼科用軟膏、脱毛クリームの試薬があることを確認してください。

2.外科的処置

注:瘻孔手術手順は、前述の方法11に従って修正された。図1に、出生後のマウスにおけるAVF操作の概略 図 を示す。

  1. 麻酔と拘束
    1. マウスの仔マウスを、2%イソフルラン/酸素が供給された麻酔誘導ボックスに、流量を1 L / minに設定して2分間入れます。結核シリンジを使用してアセトアミノフェン(80 mg / 2.5 mlの0.1 ml PO)を投与します。.
    2. 麻酔を維持するために、1.5%イソフルランを0.8 L / minの流量で鼻から吸い込み、手術台の上で子犬を仰臥位に置きます。.固定された注射針に足を結び、子犬の位置を調整します。角膜の乾燥を防ぐために、子犬の目に眼科用軟膏を塗ります。
    3. 麻酔をかけられた子犬の尻尾をつまんで、痛みの反応を確認します。明らかな体の動きは、適切な麻酔を示しています。
  2. 瘻孔手術
    1. ベタジンと70%エタノールを交互に3回スクラブして皮膚を消毒し、手術部位をドレープします。腹壁と腹膜を下腹部から剣状体下まで切断し、腹腔を完全に露出させ、腹部の臓器を傷つけないように注意します。通常の滅菌生理食塩水を滴下して、外部化された臓器を湿らせます。
    2. 綿棒を使用して消化管と膀胱を手術部位からそっと引き離し、後腹膜の下の垂直腹部大動脈(AA)と下大静脈(IVC)を視覚化します。手術台を反時計回りに90°回転させ、顕微鏡の倍率を調整して、2つの水平血管をはっきりと視覚化します。
    3. 11-0縫合針(直径= 0.07 mm)を使用して、腎動脈から1cm遠位の斜め方向にAAからIVCに瘻孔を穿刺します。IVC内の静脈血と動脈血の腫れと混合に基づいて、瘻孔の作成が成功することを確認します。
    4. 次に、乾いた綿棒で適切な力を加えて15秒間、出血点をすばやく圧縮します。腹腔内の胃、腸、膀胱をできるだけ早く交換して、止血圧迫を促進します。.
    5. 腹壁と腹膜を9-0縫合糸を使用してブランケットステッチで縫合します。麻酔を中止し、子犬に100%酸素を1分間供給します。
  3. 麻酔蘇生法
    1. 子犬を38°Cの加熱プラットフォームに置きます。活力で完全に目覚めた後、子犬を授乳中の母親に戻します。施術時間は約15分です。
      注:本研究では、偽グループは、穿刺ステップを除いて同じ手順を受けます。

3.瘻孔の超音波確認

注:超音波装置の一般的な操作は、以前のレポート18、19と同じでした。

  1. 腹部超音波検査による瘻孔の確認
    1. 麻酔導入後(ステップ2.1.1)、マウスをテープストリップで温かいプラットフォームの仰臥位に固定します。次に、マウスを超音波ゲルで心電図(ECG)モニターに接続します。1.5%イソフルランを0.8 L/minの流量で使用して麻酔を維持します。
    2. 胸と腹部の皮膚に脱毛クリームを塗って整えます。数秒後、ぬるま湯に浸した綿の先端でクリームを取り除きます。トランスデューサー(24 MHz)を腹部中央ラインに置き、トランスデューサーマーカーをマウスの頭に回転させます。
    3. プラットホームをマウスの左側または右側に下に移動し、Bモードおよびカラードップラーモードを使用して、血管および血液信号の長軸ビューを視覚化する18,19。AA、IVC、瘻孔の血流速度を測定し、パルス波ドップラーモードでAVF開存性を確認します。
      注:超音波での瘻孔の作成が成功したことは、AAとIVCの間に見える乱流信号によって示されました(図2C)。AVF部位のドップラー血流速度は、AAの収縮期速度が比較的低いのと比較して有意に高かった(図2A、C)。さらに、IVCの正常な流れパターン(図2B)とは対照的に、AVFの近位のIVC血流の拍動波形も瘻孔の形成に成功したことを確認しました(図2D)。
  2. 心エコー検査によるVOの確認
    1. プラットフォームのテールエンド部分を下に動かし、トランスデューサー(24 MHz)を胸に置き、トランスデューサーマーカーをマウスの右肩に回転させます。肺動脈 (PA) の修正された胸骨傍長軸ビューを B モードとカラー ドップラー モードを使用して可視化します。
    2. パルス波ドップラーモードを使用して、速度時間積分(PA-VTI)、PA弁の直径(PAD)、肺動脈加速時間(PAT)、RV排出時間(RVET)など、PAの血流信号を測定します(図2E、Fおよび図3A、B)。
    3. 3つの連続した測定の平均から超音波パラメータを測定します。次の式20を使用して、RVストローク量(RVSV、mL)およびRV収縮期血圧(RVSP、mmHg)を計算します。
      RVSV [mL] =1/4 × πD2 × VTIPA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - 指数 + 63.7
      注:超音波測定バイアスを考慮すると、偽群のマウスと比較して、VOマウスのRVSVまたはVTIPA が>15%増加したことがRVのVOと見なされました(図2E、F)。

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結果

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3ヶ月以内の生存率とAVF開存性
VO群では合計30匹(75%)のマウス、偽群では19匹(95%)のマウスがAVF手術を生き延びた(図4A)。VO群では、8匹のマウスが手術後1日以内に過度の出血(n = 5)または共食い(n = 3)により死亡したのに対し、2匹のマウスは1か月後に原因不明で死亡した。

生存したVOマウス(n = 30)のうち、術後21匹のマウスで瘻孔の確立に成功したことが超音波で確認され、術後1週間で特許を取得し(P14)、術後2週間まで維持されたことが示されました(P21)。しかし、瘻孔は7匹のマウスでは1ヶ月で、2匹のマウスでは2ヶ月で閉じました。3カ月の追跡調査で持続性AVFを有していたマウスはわずか12匹であった。AVF開存率は、術後1週間、2週間、1か月、2か月でそれぞれ70%、70%、46.7%、40%でした(図4B)。

右...

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ディスカッション

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以前は、従来のRVVOモデルは弁逆流21を使用して作成されていました。しかし、AVFと比較して、開心弁手術はより高度な技術を必要とする可能性があり、特に出生後のマウスでは、死亡率が有意に高くなる可能性があります。動物実験では、VOの同じ効果がAVF22によって達成されたことが示されているため、この研究では、外傷の少ない修正腹部瘻手術が使用されました。

瘻孔を正常に確立するための手順中に特定の要因が考慮されました。まず、この手順は、気管内挿管と補助換気なしで出生後のマウスで実施されました。そのため、呼吸不全による死亡を避けるためには、仔犬の動態に応じた麻酔設定の迅速な調整が不可欠でした。第二に、子犬の胃と膀胱は、手術中に頻繁に完全な状態でした。したがって、後腹膜血管構造を適切に露出させるには、脆弱な腹部臓器の損傷を避けるために、穏やかで繊細な手術が必要でした。第三に、重度の動脈出血を防ぐためのAAの結紮は、仔犬では実行が困難でした。そのため、穿刺直後の綿棒による止血圧迫が必要でした。その後...

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開示事項

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申告する利益相反はありません。

謝辞

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この研究は、中国国家科学基金会(第82200309号)と寧波の著名な医療チームのイノベーションプロジェクト(第2022020405号)の支援を受けました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70%エタノールTiandz、Chia
ACETAMINOPHEN経口溶液VistaPharm、Inc. Largo、FL 33771、米国NDC 66689-054-01
麻酔器RWDライフサイエンス、中国R550IP
麻酔マスクRWDライフサイエンス、中国68680
C57BL / 6マウスXipu'er-bikai Experimental Animal Co., Ltd(中国・上海)
ト脱毛クリームVT-200
ヘマトキシリン・エオシンキット Beyotimeバイオテクノロジー C0105M 
イソフルランRWDライフサイエンス、中国R510-22-10
顕微鏡 Yuyan Instruments、中国SM-301
外科用縫合針NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.、LTD、中国
サーモスタット加熱プラットフォーム青島Juchuang環境保護グループ有限公司、中国
超音波装置FUJIFILM VisualSonics、Inc.Vevo 2100イメージ モードには、B モード、カラー ドップラー モード、パルス波ドップラー モードが含まれます
超音波ゲルParker Laboratories,United StatesREF 01-08
超音波トランスデューサFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS 400
フランス・ヴィー

参考文献

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