電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

サマリー

電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に適応させた場合、測定された_O2消費量は、以前の研究によって野生型D.melanogasterについて報告された範囲内であった。CASK変異体によるハエ当たりの_O2消費量は、より小さく、活性が低く、野生型よりも有意に低かった。

要約

電量マイクロレスピロメトリーは、安定した環境を維持しながら、小さな生物の_O2消費量を測定するための簡単で安価な方法です。電量マイクロレスピロメーターは、O₂が消費され、生物によって生成された_CO2が吸収媒体によって除去される気密チャンバーで構成されています。 得られた圧力低下は電解O2生成を誘発し、生成に使用された電荷量を記録することにより、生成した_O2の量を測定する。本研究では、この方法を小グループで試験したショウジョウバエのメラノガスターに適合させ、装置の感度と環境条件を高い安定性のために最適化しました。この装置で野生型ハエが消費する_O2の量は、以前の研究によって測定された量と一致しています。CASK変異体による質量特異的_O2消費は、より小さく、活性が低いことが知られており、コンジェニックコントロールと変わらなかった。しかし、CASK変異体のサイズが小さいため、ハエ当たりの_O2消費量が大幅に減少しました。したがって、マイクロレスピロメーターは、D. melanogasterの_O2消費量を測定することができ、遺伝子型間のわずかな違いを区別することができ、代謝率を測定するための汎用性の高いツールを追加します。

概要

代謝率を測定する能力は、環境的文脈における生物を完全に理解するために重要です。例えば、寿命¹における食事の役割、代謝における食事の役割²、低酸素ストレスの閾値³を理解するためには、代謝率を測定する必要があります。

代謝^率の測定には、2つの一般的なアプローチがあります4。直接熱量測定は、熱産生を測定することにより、エネルギー消費量を直接測定します。間接熱量測定は、他の手段、多くの場合、O₂ 消費量(V_O2)、_CO2 生産、またはその両方の呼吸測定を介してエネルギー生産を測定します。直接熱量測定は、 ショウジョウバエのmelanogaster⁵を含む小さな外温動物に適用されていますが、スピロメトリーは技術的により単純で、より一般的に使用されています。

野生型および変異体D. melanogasterの代謝率を測定するために、いくつかの形態のスピロメトリーが成功裏に使用され、体温⁶、社会環境3、食事

プロトコル

1.ハエの飼育と収集

1. 標準的な ショウジョウバ エの餌が入った狭いバイアルでハエを25°Cに維持します。
   注:各遺伝子型のサンプルサイズは、少なくとも9回の反復で構成され、それぞれが15〜25匹のハエを含む単一の呼吸計チャンバーで構成され、以下に説明するように設定する必要があります。
2. 2〜3日ごとにハエを移します。
3. CO2でハエを麻酔し、各遺伝子型の15〜25人の男性のグループを収集し、各グループを新鮮な酵母のない食品バイアルに入れます。
   注:男性は、生殖状態による変動を減らすために使用されました。この方法は男女ともに適用されます。
4. ハエを25°Cで少なくとも24時間回復させます。
   注:実験時までに、ハエは1〜4日齢になっているはずです。ステップ1.3で説明した収集頻度は、ハエの年齢範囲を狭めるために設定できます。

2.呼吸計チャンバーのセットアップと組み立て

1. ウォーターバスをオンにして、実験に必要な温度に設定します。
   注:以下の実験は、50 mLのシュレンクチューブをチャンバーとして使用して25°Cで行いました。コンポーネントは、 図1A、1B、および1C

結果

呼吸計コントローラの圧力と電流の出力は、1つの実験における1つのチャンバーについて図3Aに示されています。最初の長電流パルスは、チャンバーを周囲圧力(約992hPa)から事前に設定されたOFFしきい値の1017hPaまで加圧しました。ハエがO2を消費し、_CO2が吸収されると、圧力はゆっくりと低下し、ON閾値の1016hPaに達すると、_O2発生器を通る電流が活性化されました。示されている例では、各パルスの平均振幅は50.1mA、持続時間は16.1秒で、パルスあたり約0.81クーロン(C)の電荷移動が得られます。このチャンバーの総電荷移動は、合計時間240.0分で3.28°Cでした。ハエの質量と数(合計14.9 mgの重さのハエ23匹)の手順に記載されている計算を使用すると、このチャンバー内のグループの_O2消費量は3.19 mL h-1 g-1または2.07 μL h-1 ^fly-1でした。

ディスカッション

上記の手順は、電子電量マイクロレスピロメーターを使用したD.メラノガスターにおける_O2消費量の測定を示しています。野生型D.melanogasterにおける_O2消費の結果のデータは^{、他の研究者}によって報告されたものよりやや低いものの、多様な方法(表1)を用いた以前のほとんどの出版物に記載されている範囲内であった^3,6。

重要なステップは、気密シールと環境安定性というこの方法の2つの絶対的な要件に対処しました。気密環境を維持するのは簡単ですが、注意が必要です。シュレンクフラスコとチューブは、蒸着薬室として理想的です。ガラス構造は、多くの種類のプラスチック¹⁹に存在するガス透過性を回避し、これは長時間の実験で特に重要である。標準ジョイントにより、センサーと電子接続を含むプラグとの気密接続が可能です。活栓は信頼性.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
19/22 温度計アダプター	Wilmad-Labglass	ML-280-702	センサー プラグ
2 ml スクリューキャップ チューブ	フィッシャー	3464	O2 ジェネレーター
2 ピン コネクタ	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 ジェネレーター: 2 ピン
4 ピン メス コネクタ	TE Connectivity	215299-4	センサー プラグ
5 mlポリプロピレンチューブ	ファルコン	352063	5.5cmにカットして穴あき
50 ml シュレンク チューブ 19/22 ジョイント	ラボイ	HMF050804	チャンバー
6 導体ケーブル	ゼニス	6 導体 26 ga	ケーブル
6 ピン メス バルクヘッド コネクタ	スイッチクラフト	17982-6SG-300	コントローラー
6 ピン メス コネクタ	スイッチクラフト	18982-6SG-522	センサー プラグ
6 ピン オス コネクタ	スイッチクラフト	16982-6PG-522
800ul遠心分離管	フィ	ッシャー05-408-120	ソーダライムカートリッジ
ABSプラスチックエンクロージャ	バドインダストリー	ズPS-11533-G
コントローラーArduinoナノエブリ	ビルLLC	ABX00028
コントローラーBME280	センサーDIYMallFZ1639-BME280		センサープラグ
回路基板Lheng		5 X 7 cm	コントローラー
硫酸銅	BioPharm	BC2045	O2
ジェネレーター コンピューター	Azulle	Byte4	データ収集
コットン ロール	カジュカジュド	#2	フライ チューブを差し込むために半分にカット 湿度のために四分の一にカット
環境チャンバー	パーシバル	I30 VLC8	フライケア
エポキシ	JB溶接	プラスチックボンダーO	2ジェネレーター
フライフード	ラボエクスプレス	タイプR	フライケア
ケッククランプuxcell		a20092300ux0418	差し込むためにチャンバーのガラスジョイントを固定します
粘度エポキシ	ロックタイト	E-30CL	センサープラグ
OLEDディスプレイ	IZOKEE IZKE31-IIC-WH-3		コントローラー
プラチナワイヤー 24 ga	uGems	14349	O2 ジェネレーター
シリコーングリース	ダウコーニング	高真空グリース	シール チャンバープラグ接続
ソーダ ライム	ジョルベット	JO553	CO2 吸収
トグルスイッチ	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	コントローラー
USB ケーブル	Sabrent	CB-UM63	コントローラーUSB
ハブ	アトラ	ハブ3.0	コントローラーをコンピューターに接続する
ウォーターバス	アマシャム	56-1165-33	温度制御
ウォーターバスタンク	ガラスケージ	15リットルリムレスアクリル	バス呼吸器用

にカット ケーブルイーを低