方法論記事

Trypanosoma cruziの3つのIn Vitroライフサイクルステージにおける超微細構造拡大顕微鏡

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DOI：

10.3791/65381

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2023年5月12日

 ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、シャーガス病の原因となる病原体であるTrypanosoma cruziの3つのin vitroライフサイクルステージで超微細構造拡大顕微鏡法を実施するための詳細なプロトコルを示しています。細胞骨格タンパク質と汎プロテオーム標識に最適化された技術が含まれています。

要約

ここでは、顕微鏡イメージングのために細胞または組織の空間分解能を向上させる技術である Trypanosoma cruziにおける超微細構造拡大顕微鏡(U-ExM)の応用について説明します。これは、既製の化学物質と一般的なラボ機器を使用してサンプルを物理的に膨張させることによって実行されます。

シャーガス病は、 T. cruziによって引き起こされる広範かつ差し迫った公衆衛生上の懸念事項です。この病気はラテンアメリカで蔓延しており、移住の増加により非流行地域で重大な問題となっています。 T. cruzi の伝染は、Reduviidae科とHemphoptera科に属する食性昆虫ベクターを介して起こります。感染後、 T. cruzi amastigotesは哺乳類の宿主内で増殖し、非複製的な血流形態であるトリポマスティゴテスに分化します。昆虫ベクターでは、トリポマスティゴテスがエピマスティゴテスに変化し、二元分裂を通じて増殖します。ライフサイクルステージ間の分化には、細胞骨格の広範な再配置が必要であり、さまざまな細胞培養技術を使用してラボで完全に再現できます。

ここでは、Trypanosoma cruziの3つのin vitroライフサイクルステージにおけるU-ExMの適用に関する詳細なプロトコールについて、細胞骨格タンパク質の免疫局在の最適化に焦点を当てています。また、汎プロテオーム標識であるN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)の使用を最適化し、さまざまな寄生虫構造をマークすることを可能にしました。

概要

拡大顕微鏡(ExM)は、2015年にBoydenらによって初めて報告されました1。これは、従来の顕微鏡が回折限界を下回る空間分解能を達成できるイメージングプロトコルです。この高い分解能は、サンプルの物理的な拡大によって得られます。これを達成するために、蛍光標識された分子をハイドロゲルに架橋し、その後、ヒドロゲルを水で等方的に膨張させます。この拡張の結果として、信号は3次元すべてでほぼ等方的に分離されます。この方法は、低コストの薬品を使用し、従来の(共焦点)顕微鏡で約65nmの空間分解能を実現しており、これは共焦点顕微鏡の標準分解能(約250nm)の約4倍です1。

多くの生物学的分野で拡大顕微鏡の使用を可能にした次のマイルストーンは、従来の抗体2による免疫蛍光標識の適応でした。最初に公開されたExMプロトコルからの別の適応は、プロテオーム(MAP)3の拡大分析です。この方法では、サンプルハイドロゲルを浸す前に高濃度のアクリルアミドとパラホルムアルデヒドを使用して、タンパク質内およびタンパク質間の架橋を防ぎ、サンプルのタンパク質含有量と細胞内構造をよりよく保存することにつながりました。この代替プロトコルは、低濃度の固定剤(ホルムアルデヒド/パラホルムアルデヒドおよびアクリルアミド)を利用することにより、単離されたオルガネラの全体的な超微細構造の保存を強化するように最適化されました。このアプローチは、超微細構造拡大顕微鏡(U-ExM)4と呼ばれていました。

さらに分解能を高めるために、ExMと誘導放出枯渇顕微鏡法や単一分子局在顕微鏡などの超解像顕微鏡法との組み合わせも報告されており、20 nm5未満の分解能を達成しています。

ExMの使用は、神経科学や細胞骨格研究の分野で広く報告されていますが6、寄生原生生物に関する研究はごくわずかです。当研究室は、T. cruzi7におけるU-ExMの適用を最初に報告しました。この基礎プロトコルは、主にToxoplasma gondii、Plasmodium ssp.、およびTrypanosoma brucei 8,9,10,11の以前のU-ExM報告に基づいています。

ExMの最大の利点の1つは、そのモジュール性により、さまざまな生物学的サンプルに柔軟に適応できることです。プロトコールは、ユーザーが実験要件を満たすように簡単に調整できるステップ(固定、架橋防止、ゲル化など)に分けることができます。さらに、このパイプラインを変更して、モデル生物との互換性を強化したり、特定の解像度を達成したりできます。その結果、ExMは、高度な光学システムと非高度な光学システムの両方に大きな可能性を提供し、将来的にはより広範なアプリケーションを保証します。

シャーガス病は、アメリカトリパノソーマ症とも呼ばれ、原虫である トリパノソーマ・クルージによって引き起こされるラテンアメリカの風土病です。この寄生虫のライフサイクルは複雑で、哺乳類では2つの発生段階、この病気の生物学的ベクターである昆虫宿主(トリアトミナ科のメンバー)では2つの発生段階が関与しています。シャーガス病は、世界保健機関(WHO)がリストアップした顧みられない熱帯病のグループに属し、ラテンアメリカにおける重大な経済的・社会的問題となっています。疫学研究では、世界中で800万人がシャーガス病に罹患し、年間1万人以上が死亡していると推定されています。これらの数字は、シャーガス病が世界中の公衆衛生問題として重要であることを実証しています。シャーガス病の地理的分布はここ数十年で変化しており、当初発見されたラテンアメリカの主に農村部とは対照的に、移住の増加により、多くの感染者が世界の大都市部に居住するようになりました12。

T. cruziの発生段階は、そのライフサイクルを通じて異なり、これは完全にin vitroで再現できます。エピマスティゴテスは昆虫ベクターの複製型であり、細胞体の中央領域に球状の核を持ち、核に対して前部に棒状のキネトプラスト(キネトプラストに特有のミトコンドリアDNA含有構造)を持ち、遊離鞭毛を持っています。トリポマスチゴテは感染性で非複製性の形態であり、細長い核、丸みを帯びた後部運動細胞形成体、および寄生虫の全長に沿って原形質膜に付着した鞭毛を持っています。アマスチゴテスは細胞内複製型です。それらは、中央領域に核を持ち、細胞体の前部に棒状の運動細胞形成体を持ち、そして減少した鞭毛を有する。寄生虫のさまざまな環境への適応性は、これらの形態学的変化を反映しています。また、このライフサイクルには対称的な分割と異なる移行発達段階が含まれていることも言及する価値があります13。分化時には、トリパノソーマ科の細胞骨格が重要な役割を果たします。この構造は、原形質膜の下に安定な微小管が規則正しく配列された膜下微小管のコルセットによって形成されます。また、これらの生物には傍鞭毛桿体が存在し、これは平行に走る格子状の構造であり、べん毛軸索14に付着している。細胞周期段階に沿った正確な細胞骨格組織と核構造の変化には、トリパノソーマチドに固有の遺伝子制御メカニズムが関与しており、細胞生物学研究の興味深いモデルとなっています。

T. cruziやその他の原虫寄生虫のサイズが小さいことを考えると、U-ExMはこれらの重要な病原体の構造的特徴を分析するための優れたツールを提供します。前述のように、この技術のT.cruziへの適用性は、Alonso 7博士によって初めて検証されました。このレポートでは、T. cruziのさまざまなライフサイクル段階における細胞骨格タンパク質の免疫局在に重点を置いた、完全なU-ExMプロトコルについて詳しく説明します。また、さまざまな寄生虫構造をマークすることを可能にする汎プロテオーム標識であるN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)の使用を最適化しました。さらに、寄生虫の3つの段階を取得するためのin vitro方法論が記載されている。

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プロトコル

注: 図1 は、完全な実験計画を示しています。

トリパノソーマ症のライフサイクル図;顕微鏡の準備;膨張顕微鏡;免疫蛍光。
図1:T. cruziの3つのin vitroライフサイクルステージのU-ExMワークフロー この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. ポリ-D-リジンコーティングされたカバースリップの調製

  1. 10 cm x 10 cm四方のシーリングフィルムをペトリ皿に入れます。カバースリップを無水エタノールに浸して、35mmのガラスシャーレで洗います。
  2. エタノールバスからピンセットでカバースリップを取り外し、余分な液体をティッシュペーパーで排出します。カバースリップをシーリングフィルムの上に置きます。
  3. 残りのエタノールを顕微鏡グレードの紙で吸収します。カバーガラスの中央にポリ-D-リジンの0.1% v/v溶液を加え、先端で広げて表面の約80%を覆います。ペトリ皿を閉じ、37°Cで1時間インキュベートします。
    注:22 mm2 カバースリップの場合、200 μLのポリ-D-リジン溶液を使用してください。12 mmの丸型カバースリップには、100 μLのポリ-D-リジン溶液を使用します。
  4. カバーガラスを超純水で3回洗います。真空で吸引して、各洗浄の間に水分を取り除きます。4°Cで最大1週間保管します。

2. 溶液の調製

  1. 38%(w / w)のアクリル酸ナトリウム(SA)のストック溶液を調製します。
    1. 攪拌しながら、19 gのSAを31 mLのヌクレアーゼフリー水にゆっくりと加えます。
      注:このソリューションは非常に粘性があります。ピペッティングの際はご注意ください。
    2. SAが完全に溶解したら、滅菌容器に保管します。4°Cに保ち、6か月ごとに交換してください。
      注:SAは、ブランドによってはポリアクリル酸ナトリウムによる汚染の兆候を示すことがあり、これはストック溶液を調製するときに黄色がかった濁りに変わるときに目立ちます。その場合は慎重に使用してください。
  2. 40%(w / v)アクリルアミド(AA)の原液と2%(w / v)N、N'-メチレンビスアクリルアミド(BIS)の原液を準備します。各化合物を超純水に溶解し、0.22μmの滅菌シリンジフィルターでろ過します。滅菌容器に入れて4°Cで保存してください。
    注意:AAとBISは非常に有毒な物質です。ドラフトの下で作業し、適切な保護要素(手袋、防護服、マスク、安全メガネ)を使用してください。
  3. 37%ホルムアルデヒド(FA)溶液38μLと40%アクリルアミドストック溶液50μL(ステップ2.2)を912μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 表1)1.4%ホルムアルデヒドと2%アクリルアミドの最終濃度を得るため。
    注:CP溶液は常に新鮮に調製し、ピペッティングするときは非常に正確です。例えば、P1000ピペットを使用して900μLのPBSを採取し、P20ピペットを使用して残りの12μLのPBSを採取します。
  4. モノマー溶液を調製します
    注意: 調製後すぐに溶液を使用しないでください。使用する前に少なくとも24時間-20°Cで保管してください。
    1. 38% SA溶液500 μL(ステップ2.1)、40% AA溶液250 μL、BIS溶液50 μL(ステップ2.2)、10x PBS100 μLを混合します(表1)。
    2. この最終容量900 μLを1.5 mL microcentrifuge tubesに10x 1.5 mL入りで分注し、それぞれ90 μLのモノマー溶液を添加します。-20°Cで最大2週間保存してください。
      注:SA溶液は粘性が高いため、ピペッティング時にチップに留まる場合があります。注意して、すべてを分配してください。
  5. 変性液を調製します
    1. 超純水で調製した350 mMドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液114.3 mLと、超純水で調製した4 M塩化ナトリウム溶液10 mLを混合します。250mLのビーカーで攪拌しながらトリス12gを加えます。
      注意:SDSは非常に有毒です。手袋、防護服、マスク、安全メガネを着用してドラフトの下で使用してください。
    2. 塩酸の濃縮溶液でpHを9に調整します。超純水で最大200mLを調製し、4°Cの滅菌フラスコで保存します。
  6. 10%過硫酸アンモニウム(APS)溶液と10%TEMED溶液を調製します。
    1. 0.1gのAPSを1mLの超純水に溶解します。
    2. 10% TEMED溶液1 mLを超純水で調製します。
    3. 1.5 mLの微量遠心分離用滅菌チューブに両溶液のアリコート100 μLを調製し、-20°Cで最大1か月間保存します。
  7. パラホルムアルデヒド溶液を調製します。
    1. パラホルムアルデヒド2gをPBS40mLに溶解し、60°Cで撹拌します。 溶液が白色から無色に変わるまで、1 M NaOHを滴下します。
      注意:ホルムアルデヒドは非常に有毒です。手袋、防護服、マスク、安全メガネを着用してドラフトの下で使用してください。
    2. 溶液を室温で冷却し、NaOHを含むpHを最終容量50mLで7.2に調整します。0.22 μm滅菌シリンジフィルターでろ過し、滅菌容器で保存します。
    3. 1.5 mLの滅菌微量遠心チューブに1 mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
  8. パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド溶液を調製します。
    1. 0.2 gのパラホルムアルデヒドを3.5 mLの超純水と50 μLの16 M NaOH溶液に加えます。溶液を60°Cに加熱して、パラホルムアルデヒドを溶解します。
    2. 冷まして、70%グルタルアルデヒドを300μL加えます。超純水で5mLまで、PBSで10mLまで容量を上げます。
      注意:パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは非常に有毒です。手袋、防護服、マスク、安全メガネを着用してドラフトの下で使用してください。
    3. 1.5 mLの滅菌微量遠心チューブに1 mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。

3.寄生虫培養物の調製

  1. T. cruzi epimastigotesを育てます。
    1. T-25フラスコ(成長領域25 cm2 )で無菌培養を使用し、10%の子牛胎児血清(FCS; 表 1)。
    2. キャップがしっかりと閉まっていることを確認し、培養フラスコを垂直に28°Cに保ち、インキュベーションします。各継代培養中にノイバウアーチャンバー内で細胞計数することにより、寄生虫の増殖をモニターします。
      注:この研究で使用したDm28c株の場合、対数期培養物中のエピマスティゴテスの濃度は1〜5 x 107 寄生虫/ mLです。
    3. 10% FCSを添加したLIT培地中の対数期培養液から、2 x 106 エピマスティゴート/mLの懸濁液を調製します。懸濁液を5,000 x g で室温(RT)で10分間遠心分離します。PBSで1〜2回洗浄し、200μLのPBSに再懸濁します。
    4. ポリ-D-リジンで以前にコーティングされた丸い12mmカバーガラス(セクション1)に接着します。室温で15〜20分間インキュベートします。架橋防止手順(セクション4)に進みます。
      注:あるいは、寄生虫をカバースリップに付着する前に、冷たいメタノールで7分間、またはパラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド溶液(ステップ2.8)でRTで10分間エピマスティゴテスを固定します。固定寄生虫は4°Cで最大1週間保存することができます。
  2. 感染したVero細胞からアマスチゴテスを取得します。
    1. 滅菌済みの12 mm丸型カバースリップを24ウェル組織培養プレートの底に置きます。2% ウシ胎児血清(FCS)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に 2 x 105 Vero 細胞/mL の懸濁液を調製します。懸濁液500μLをウェルあたり播種します。








ゲル中の細胞カプセル化;A-B:氷上のシャーレ。C:ゲル下の細胞の図、カバーガラスのセットアップ。











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結果

プロトコールが適切に実施されている場合(図1)、サンプルは平面的で半透明のゲルとして表示され、水中で最大4〜4.5倍まで拡張できます(図3A)。この膨張により、約70nmの有効分解能が得られましたが、これは最終的な膨張係数と使用するイメージングシステムによって異なる場合があります。2回目の拡大プロセスと共焦点顕微鏡での画像取得の後、約4.5の拡張係数を観察することができました。この膨張を定量化するために、ステップ7.1の前後でゲルを測定しました。また、非拡大寄生虫および拡大寄生虫のα-チューブリン抗体でエピマチゴテを標識しました(図3B)。

抗チューブリン抗体のような細胞骨格マーカーで染色したところ、エピマスティゴート、トリポマスティゴート、アマスチゴートにおいて、微小管の膜下コルセットとべん毛軸索におけるこのタンパク質の正しい局在が観察され、T. cruziの3つのin vit...

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ディスカッション

超微細構造拡大顕微鏡は、生体試料を物理的に元のサイズの数倍に拡大することで、生体試料の高解像度画像を取得できる技術です。U-ExMプロトコルには、最適な結果を得るために慎重に実行しなければならないいくつかの重要なステップが含まれています4。まず、サンプルをCP剤で固定し、膨潤性ヒドロゲルマトリックスに包埋する必要があります。CP溶液中に存在するホルムアルデヒドは、アクリルアミドの遊離共有結合と相互作用して、サンプルとの望ましくない結合の形成を防ぎます。このプロトコルでは、CPステップの前に細胞を固定しないことを推奨します。これは、CPステップによって拡張因子が減少するためです。ただし、膜ベースのオルガネラ15など、一部のオルガネラには必要です。化学固定に関連することがあるアーティファクトの形成を回避するための代替手段は、膨張16の前にサンプルを凍結固定することであると報告されていることは言及する価値があります。

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

Vero細胞培養を支援してくださったDolores Campos氏と、 T. cruzi 培養を支援してくださったRomina Manarin氏に感謝します。この研究は、Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica、アルゼンチンのMinisterio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2019-0526)、Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242)、Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22マイクロメートル滅菌シリンジフィルター PESメンブレン溶液SFPES030022S
1 Lビーカーショット・デュラン10005227
1.5 mL SPINWIN マイクロ遠心分離チューブターソンT38-500010
10 mL 使い捨て滅菌セリンジNP66-32
10 mL 血清学的ピペット 滅菌ジェット バイオフィルGSP211010
12 mm カバースリップMerienfeld GmbH01 115 20ラウンド カバースリップ
12 ウェルプレートジェット バイオフィルTCP011012
22 mm カバースリップコーニング2845-22スクエア カバースリップ
24 ウェルプレートジェット バイオフィルTCP-011-024
250 mL ビーカーショット デュランC108.1
3 mL パスツールピペットDeltalab200037
35 mm ガラス底皿松波ガラス indD11130H
4′,6-ジアミジン-2′-フェニルインドール二塩酸塩Sigma AldrichD9542DAPI
5 ml 血清ピペット滅菌 Jet BiofilGSP010005
6-well platesSarstedt83.3920
アクリルアミドBioRad1610101
過硫酸アンモニウムSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS エステルBOC SciencesF10-0107汎プロテオームラベリング用
BiosaftyキャビネットTelstarBio II A/P
ウシ アルブミンナトリウムSigmaAldrich A7906BSA
CO2 インキュベーター三洋電機MCO-15A
共焦点顕微鏡ツァイスLSM 880
ディスポーザブル ペトリディッシュターソン460095直径 90 mm
DMEM、高グルコースサーモフィッシャー Cientific12100046パウダー
電子デジタルノギスレーダーレーダー レーダー
エタノール アブソリュートSupelco1,00,98,31,000
Fetal Calf SerumInternegocios SAFCS FRA 500Sterile and heat-inactivated
Fiji image processing packageImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
ホルムアルデヒド 37%Sigma AldrichF8775FA
Glass PetridishMarienfeld SuperiorPM-340030060 mm diameter
Glucosa D(+)Cicarelli
グルタルアルデヒド 70%Sigma AldrichG7776
ヤギ抗マウスIgG 二次抗体 Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
ヤギ抗ウサギIgG 二次抗体 FICTJackson Immunoresearch115-095-003
メスシリンダーNalgene3663-1000
目盛り付きガラスフラスコGlasscoGL-274.202.01100 mL
ヒーティング ブロックIBR自社製
HeminFrontier ScientificH651-9
塩酸 36.8-38.0%Ciccarelli918110
アイス バケツCorning1167U68
インキュベーターTecno DalvoTOC130
肝臓注入Difco226920
マグネティックスターラー&ヒーターラボコンパニオンHP-3000
金属ヘラSALTTECH200MM
金属ピンセットマリエンフェルド スーペリアPM-6633002
メタノール絶対Cicarelli897110
微量遠心チューブ 1.5mLターソン500010-N
顕微鏡グレードの紙 KimWipesKimtech ScienceB0013HT2QW
Milli-Q water sistemMerk MilliporeIQ-7003
マウス抗αチューブリンクローン DM1ASigma AldrichT9026
マウス抗PFR精製抗体Ariel Silber博士(USP)
N,N´-methylenbisacrilamideICN193997ビス
Na2HPO4Cicarelli834214
ノイバウアーチャンバーBoecoBOE 01
p1000 ピペットギルソンピペットマン P1000
p1000 ピペットチップターソンTAR-521020B
p20 ピペットギルソンピペットマン P20
p20 ピペットチップターソン TAR-527108
p200ピペットGilsonPIPETMAN P200
p200 ピペットチップTarsonTAR-521010Y
パラホルムアルデヒドSigma AldrichP6148PFA
pH / ORP / °CメートルHANNA InstrumentsHI 2211
Poly-D-Lysine 0.1%Sigma AldrichP8920
塩化カリウムCicarelli867212KCl
Razor bladePrintexBS 2982:1992
シーリングフィルム "Parafilm M"BemisPM996
アクリル酸ナトリウムSigma Aldrich408220-25GSA
重炭酸Cicarelli929211NaHCO3
塩化ナトリウムCicarelli750214NaCl
Dodecyl SulfateBioRad1610302SDS
Hidroxideナトリウム Merk1-06498NaOH
Sorvall ST 16 遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック 75004380
T-25 フラスコCorning430639
TEMEDInvitrogen15524-010
ティッシュペーパーエリート
トリプトースメルク1106760500
TrisBioRad1610719
Tween-20Biopack2003-07ポリソルベート 20
真空ポンプSilfabN33-A
Vero細胞ATCCCRL-1587
Vortex MIxerDragon LabMX-S
716214ナトリウム

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