Agrobacterium tumefaciens-緑色微細藻類Chlorella vulgarisの遺伝子工学

アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、グラム陰性土壌伝染性細菌であり、独自の王国間遺伝子導入能力を有しており、「天然遺伝子工学者^」1の称号を得ています。この細菌は、腫瘍誘導プラスミド(Ti-プラスミド)からIV型分泌系を介して宿主細胞にDNA(T-DNA)を移し、宿主ゲノム1,2,3,4内にT-DNAを統合して発現させることができます。自然界では、このプロセスは植物の腫瘍形成につながり、一般にクラウンゴール病として知られています。しかし、アグロバクテリウムは、実験室条件下で酵母、真菌、藻類、ウニ胚、さらにはヒト細胞など、他のさまざまな生物にT-DNAを転写することもできます5,6,7,8。

この自然システムを利用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、TiプラスミドのT-DNA領域を修飾することにより、目的の遺伝子を宿主細胞の核ゲノムにランダムに組み込むことができます。この目的のために、広く用いられているAMT植物発現ベクターは、pCAMBIA1302⁹である。研究者は、目的のベクターをA. tumefaciensに移植し、その後目的の宿主に移植する前に、大腸菌で簡単なクローニングワークフローを採用することができます。

緑色微細藻類は、陸上植物と多くの類似点を共有する真核生物ですが、遺伝子組み換えに対して非常に抵抗性があります。しかし、遺伝子組み換えは、微細藻類の基礎研究とバイオテクノロジー研究の両方において重要な役割を果たしています。いくつかの微細藻類種、特にクラミドモナス・ラインハルトティでは、AMTによる遺伝子組み換えにより、ヒトインターロイキン-2(hIL-2)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2受容体結合ドメイン(SARS-CoV-2 RBD)、および2つの抗菌ペプチド(AMP)などの導入遺伝子の導入に成功しています^10,11,12,13。これらのうち、尋常性クロレラ(Chlorella vulgaris)は、あまり気難しくなく、成長の早い緑藻類種であり、炭水化物、タンパク質、栄養補助食品、色素、およびその他の高価値化合物の持続可能な生産に大きな可能性を秘めています¹⁴。しかし、C. vulgarisのトランスジェニック株を作製するための信頼できるツールの欠如が、その商業的進歩を妨げている。C. vulgaris¹⁵ で AMT を利用した研究が発表されているのは限られているため、植物と微細藻類の培養には大きな違いがあるため、AMT プロトコルの最適化が不可欠になります。

この研究では、研究者らは、カリフラワーモザイクウイルス(CamV)35Sプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(mGFP5)を挿入し、ヒスチジンタグを付加して、タンパク質発現のレポーター遺伝子として使用しました。形質転換体はハイグロマイシンBを用いて選別され、20世代以上にわたって継代培養された後、形質転換は安定していました。この研究で用いたpCAMBIA1302プラスミドは、任意の目的遺伝子を含むように容易に適合させることができます。さらに、提示された方法および材料は、活性CamV35Sプロモーターを有する他の緑藻種について調整することができ、このプロモーターはハイグロマイシンの選択に使用される。

すべての培地および溶液は、特に明記されていない限り、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。すべての遠心分離管、ピペットチップなどは、使用前に滅菌またはオートクレーブ滅菌する必要があります。簡単に参照できるように、このプロトコルで使用される培地レシピを 表1にリストします。

1. A. tumefaciensの 電気コンピテントセルの作製

1. アグロバクテリウム(AGL-1)を凍結グリセロールストックからLB培地(リファンピシン、20 mg/^L-1を添加)の25 mL滅菌シェーカーフラスコに接種し、28〜30°C、150rpmで一晩増殖させます。
   注: アグロバクテリウム 株AGL-1は、リファンピシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびストレプトマイシンに耐性があり( 材料表を参照)、いくつかのサプライヤーから入手できます。
2. 翌日、オートクレーブ滅菌した超純水50mLに一晩培養液0.5μLを加えて培養液を1,00,000倍に希釈し、この希釈培養液10μLをLBプレート上に広げた後、28〜30°Cで1〜3日間インキュベートします。
3. コロニーを選び、28〜30°Cのリファンピシンを含むLBで20 mLの一晩培養を開始します。
4. 翌日、シェーカーフラスコに500 mLのLB培地(抗生物質なし)に9 mLの一晩培養液を接種し、OD₆₀₀ が0.5に達するまで28〜30°Cで増殖させます。
5. 培養液を10本の50 mL遠心チューブに均等に分割し、氷上で30分間冷却します。遠心分離機を4°Cに予冷します。
6. チューブを4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。続いて、ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去し、各チューブ内のペレットを50 mLの氷冷水に再懸濁します。
7. 細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を取り除き、各チューブの25 mLの氷冷水にペレットを再懸濁します。
8. 細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを氷冷10%(w/v)グリセロール1 mLに再懸濁します。
9. すべてのチューブを1本の50 mLチューブに混ぜ合わせ、細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを氷冷10%(w/v)グリセロール400 μLに再懸濁します。細胞濃度は約1-3 x 10¹⁰ cells/mLです。
10. 細胞を50 μLのアリコートとして、滅菌済みの冷却済みマイクロチューブに分配します。液体窒素で凍結し、-80°Cの冷凍庫で保存してください。

2. A. tumefaciensのエレクトロポレーション

1. 50 μLのAGL-1 A. tumefaciens電気 コンピテントセルをプレチルドした0.1 mmキュベットに加え、2 μLのpCAMBIA1302または類似のプラスミド(濃度15 ng/μL)を加えます( 材料表を参照)。
2. エレクトロポレーター(200 Ω、静電容量エクステンダー250 μFD、静電容量25 μFD、指数関数的減衰、 材料表を参照)を使用して2400 Vでエレクトロポレーションします。指数関数的減衰を伴うエレクトロポレーションを成功させるには、時定数を >4.5 ミリ秒にする必要があります。
3. ただちに1 mLのLB培地をキュベットに加え、ピペットで静かに上下させて混合します。再懸濁した細胞1mLを1.5mLのマイクロチューブに移し、28〜30°Cで少なくとも1時間インキュベートして回収します。
4. 適切な抗生物質(すなわち、原核生物選択のためのpCAMBIA1302に対して50 mg/Lのカナマイシン)を含むLB寒天培地に細胞をプレーティングします。
5. 28〜30°Cで2〜3日間インキュベートします。
6. コロニーを1つ選択し、適切な選択(pCAMBIA1302では50 mg/Lのカナマイシン)を使用してLBで一晩増殖させ、将来の使用のために50%グリセロールを使用してプラスミド含有株を-80°Cで凍結保存します。

3. C. vulgarisのAMT

注:C. vulgaris(UTEX 395、材料表を参照)とA. tumefaciensの培養を並行して調製し、共同培養を行います。C. vulgariの培養は、A. tumefaciens の培養を調製する 3 日前に開始する必要があります。プロトコルは、Kumarらによって公開されたプロトコルに基づいて修正^{されました7。}

1. C. vulgaris 培養の準備
   1. C. vulgaris は、伝統的に斜めに保管されるか、照明条件で対数相培養に維持されます。OD₆₀₀ = 1.0 の対数相培養から、0.5 mL を Tris-Acetate-Phosphate (TAP、表 1 を参照) 寒天プレート ( 1.2% w/v 寒天 A) に広げ、照明 (50 μE/m²s) で 25 °C で 5 日間増殖させます。これにより、約 5 x 10⁶ 個のセルが生成されます。
2. A. tumefaciens培養の準備
   1. 15 mMグルコース、20 mg/Lのリファンピシン、および50 mg/Lのカナマイシン(材料表を参照)を添加したLB培地10 mLをグリセロールストックを用いて接種することにより、シェーカーフラスコ内でA. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302株を増殖させます。28〜30°C、250rpmで一晩インキュベートします。
   2. 15 mMグルコース、20 mg/Lリファンピシン、および50 mg/Lカナマイシンを含む50 mLのLBに1 mLの一晩培養を接種し、OD₆₀₀ が1.0に達するまで28〜30°Cおよび250rpmでインキュベートします。
3. C. vulgaris と A. tumefaciens を共培養する
   1. A. tumefaciens培養物を共培養用に調製するには、増殖させた培養物を50 mLチューブに移し、室温で4000 x gで30分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を除去し、誘導培地で細胞を2回洗浄します。
      注:使用する誘導担体は、pH 5.5 に調整された TAP 培地で、F/2 培地微量金属およびビタミンと 200 μM アセトシリンゴン(AS、 材料表を参照)を添加しています。細胞を誘導媒体に再懸濁し、OD₆₀₀ = 0.5 になるようにします。
   2. C. vulgaris 培養物を共培養用に調製するには、25 mL の誘導培地を C. vulgaris プレートに添加し、~5 x 10⁶ 個の細胞を含有します。50 mLチューブに移します。細胞を室温で4000 x gで15分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   3. 藻類細胞ペレットを200μLの細菌懸濁液(OD₆₀₀:0.5)と混合し、ロータリーシェーカーで21〜25°C、150rpmで1時間インキュベートします。
   4. 混合培養液(200 μL)を15 mMグルコースを添加した誘導培地プレートに広げ、暗所で21〜25°Cで3日間インキュベートします。
   5. 3日後、400 mg/Lのセフォタキシムまたは20 mg/Lのテトラサイクリン( 材料表を参照)を添加した10 mLのTAP培地を使用して微細藻類を採取し、21〜25°Cの暗所で2日間インキュベートして、 A. tumefaciensを 培養物から除去します。
   6. 20-70 mg/LのハイグロマイシンB(pCAMBIA1302使用時)および400 mg/^L-1 セフォタキシムまたは20 mg/Lのテトラサイクリンを添加したTAP培地など、選択的培地に培養物500 μLを播種します。暗所で21〜25°Cで2日間インキュベートしてから、照明付きのチャンバーに入れます。
      注:耐性コロニーは、光曝露の5〜7日後に現れます。
   7. 形質転換プレートから単一のコロニーを選択し、400 mg / Lのセフォタキシムまたは20 mg / Lのテトラサイクリンと20〜70 mg / LのハイグロマイシンBを添加したTAP寒天プレートでそれらを再ストリークします。

4. C. vulgaris 形質転換体の遺伝子組み分入を確認するためのコロニーPCR(cPCR)

1. 植物ゲノムDNA抽出キットを使用して、1つのコロニーから少なくとも2回継代培養した後、C. vulgaris形質転換体からゲノムDNAを抽出します(材料表を参照)。これをPCRの鋳型として用いて、T-DNAのmgfp5領域(mgfp5-Fwd:5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3'、およびM13-Rev:5' CAGGAAACAGCTATGAC 3')のプライマーを設計します。
   1. Q5ハイフィデリティDNAポリメラーゼマスターミックスキット( 材料表を参照)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、導入遺伝子の組み込みを検証します。
      注:本研究では、次の条件を使用しました:98°Cで3分間。35サイクル(98°Cで10秒、57°Cで30秒、72°Cで1分);72°Cで5分間pCAMBIA1302をポジティブコントロールとして使用し、野生型C .尋常性 ゲノムDNAをネガティブコントロールとして使用します。
2. A. tumefaciensによる残留汚染により、サンプル中にpCAMBIA1302が存在しないことを確認するには、コロニーPCRを使用します。10μLの滅菌水に少量の形質転換細胞を加え、98°Cで15分間煮沸します。これをPCRのテンプレートとして使用してください。
   1. pCAMBIA1302(B1-Fwd:5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3'およびB1-Rev:5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3')のT-DNA以外の領域のプライマーを設計します。
      注:本研究では、94°Cで3分間の条件を使用しました。30サイクル(94°Cで30秒、48°Cで30秒、68°Cで5分);68°Cで7分間ポジティブコントロールとして A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) のゆでコロニーを使用し、ネガティブコントロールとして野生型 C. vulgaris のゆでコロニーを使用します。
3. サンプル中に A. tumerfaciens コンタミネーションがないことを確認するには、コロニー PCR を使用します。10μLの滅菌水に少量の形質転換細胞を加え、98°Cで15分間煮沸します。これをPCRのテンプレートとして使用してください。
   1. AGL-1病原性プラスミド(virE2-Fwd:5' AGGGAGCCCTACCCG 3'およびvirE2-Rev:5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3')に含まれるvirE2遺伝子のプライマーを設計します。
      注:本研究では、94°Cで3分間の条件を使用しました。30サイクル(94°Cで30秒、53°Cで30秒、68°Cで3分);68°Cで7分間ポジティブコントロールとして A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) のゆでコロニーを使用し、ネガティブコントロールとして野生型 C. vulgaris のゆでコロニーを使用します。
4. ラダー(1 Kbp DNAラダー、 材料表を参照)とともにDNAアガロースゲル上でPCRサンプルを実行し、得られたフラグメントのサイズを確認します¹⁶。

5. 形質転換体の蛍光測定

1. 対数相維持培養または TAP 寒天培地からの各形質転換体を、開始 OD 600 = 0.1 になるように、₂₀₀ mg/^L-1 セフォタキシムと 25 mg/^L-1 ハイグロマイシン B を添加した 50 mL の TAP に接種します。1つの培養物に野生型C.尋常性菌を接種し、ネガティブコントロールとして200 mg/^L-1セフォタキシムのみを接種します。25°C、150rpm、150μmol/^m2sの光合成活性光でインキュベートします(材料表を参照)。
2. 24時間ごとに300 μLのサンプルを採取し、96ウェルプレートリーダーまたはUV/Vis分光計および蛍光光度計で吸光度と蛍光(励起488 nm、発光526 nm)を測定します( 材料表を参照)。同時測定には底が透明な黒いプレートを使用してください。

6. 粗タンパク質抽出、タンパク質精製、SDS-PAGE電気泳動

1. 形質転換体(#50)を対数相維持培養から 300 mL の TAP に接種し、200 mg/L-1 セフォタキシムと 25 mg/^L-1 ハイグロマイシン B を添加して、OD₆₈₀ = ^0.1 にします。1つの培養物に野生型C.尋常性菌を接種し、ネガティブコントロールとして200 mg/^L-1セフォタキシムのみを接種します。25°C、150rpm、150μmol/^m2sの光合成活性光でインキュベートします。
2. 5 mLの溶解緩衝液( 表1を参照)を使用して形質転換体(#50)および野生型株から粗タンパク質サンプルを抽出し、続いて4分間超音波処理します。
3. 粗タンパク質サンプルを Ni-NTA 樹脂で 5 mL ポリプロピレンカラムで精製します( 材料表を参照)。
4. 15 mLの精製タンパク質サンプルを凍結乾燥し、SDS-PAGE分析のために1 mLの溶解バッファーに再懸濁します¹⁷。

上記の方法を用いて形質転換の成功を示すために、 C. vulgaris をpCAMBIA1302プラスミドを含むAGL-1と共培養するか、プラスミドを含まない(野生型で、ハイグロマイシンBとセフォタキシムを添加したTAP寒天培地に播種した)(図1A)。左端のプレートは、ハイグロマイシンB/セフォタキシムプレート上で増殖可能な形質転換コロニーを示し、中央のプレートは、野生型AGL-1がハイグロマイシンB/セフォタキシムプレート上で増殖できないことを示しています。右端のプレートは、選択を使用しない場合(セフォタキシムのみ)、 C. vulgaris 形質転換体および野生型が増殖できることを示しています。単一コロニーは、ハイグロマイシンBとセフォタキシムとともにTAP寒天上にストリークしました(図1B)。右端のプレート(図1B)から脱出したコロニーをTAP液にハイグロマイシンBとセフォタキシム(図1C)を接種しました。T-DNAのランダムな組み込み後の発現レベルが異なるため、形質転換体は当初、ハイグロマイシンBの濃度が25〜70 mg / Lの範囲で増加したプレート上で回収されました。各プレートから1つのコロニーを、同濃度のハイグロマイシンBと野生型 C.vulgaris を最低濃度で含む液体TAP培地で増殖させました(図1D)。野生型の C.vulgaris はハイグロマイシンの存在下では増殖できませんが、最大70 mg / Lの耐性コロニーが得られました。

T−DNAカセットが 尋常性菌のゲノムに安定して組み込まれていることを確認するために、20、25、30、50、および70mg/LのハイグロマイシンBプレートのそれぞれから選択された1つのコロニーを、TAP寒天プレート上で2回選択してストリーキングを繰り返して継代培養し、次いでTAP培地で10回以上定期的に継代培養し、 それぞれトランスフォーマント#20、#25、#30、#50、#50、#70と名付けられました。これらの培養物を用いて、AGL1におけるpCAMBIA1302によるコンタミネーションを除外するために両方のコロニーPCRを行い、ゲノムDNAを抽出して、mGFP5遺伝子が C. vulgaris ゲノムに存在することを確認しました。 図2Aでは、T-DNAの左右境界の外側の5 kbp領域を標的とするプライマーを使用してコロニーPCRを行い、ポジティブコントロールとしてpCAMBIA1302プラスミドからこの領域を増幅することができましたが、この領域は C. vulgaris サンプルのいずれにも存在せず、pCAMBIA1302 DNAがどの培養にも存在しなかったことを示しています。野生型 C. vulgaris サンプルをネガティブコントロールとして使用し、増幅は見られませんでした。

形質転換体#25、#50、および#70からゲノムDNAを抽出し、PCRを行い、T-DNAの mgfp5 遺伝子を含む1763 bp領域を増幅して、形質転換体への組み込みを確認しました(図2B)。pCAMBIA1302をポジティブコントロールとして使用したところ、すべての形質転換体で増幅が検出され、 mgfp5 遺伝子がすべての形質転換体のゲノムDNAに存在することが示されました。野生型 C. vulgaris をネガティブコントロールとして使用し、増幅は見られませんでした。 図2C は、AGl1株の腫瘍誘導プラスミド(Tiプラスミド)に見られる病原性タンパク質E2(VirE2)の600 bpフラグメントの増幅を示しています。pCAMIA1302 を含む AGl1 株からなるポジティブコントロールは、プライマーで増幅に成功し、サンプル中に A. tumefaciens が存在することが示されました。しかし、 C. vulgaris のサンプルはすべてこの領域で陰性であり、セフォタキシムの継代培養を繰り返すことで、培養物からAGL1の汚染を排除することに成功したことが示されました。野生型 C. vulgaris サンプルをネガティブコントロールとして使用し、増幅は観察されませんでした。これら3つの試験を総合すると、mgpf5を含むT-DNAが 尋常性ブドウ球菌 のゲノムに挿入されたことが確認され、これらの結果はサンプル中のAGL1の汚染によるものでも、細胞内のpCAMBIA1302の存在によるものでもありません。これらの結果は、形質転換体の20回および約100回の継代培養後に繰り返され、T-DNAのゲノムへの長期的な統合が確認されました。

最後に、TAP培地中の形質転換体を選別して増殖させ、蛍光を測定することで表現型を確認しました。これを野生型の C. vulgarisと比較した。クロロフィルのバックグラウンド吸光度/自家蛍光のため、データを野生型株に正規化して蛍光を比較しました。 図3Aでは、形質転換体と野生型 C.vulgarisとの間に顕著な成長の違いがあることが観察できます。これは、T-DNAがゲノムにランダムに複数組み込まれていることに起因している可能性があり、他の細胞プロセスに影響を与え、成長を遅らせている可能性があります。それにもかかわらず、 図3B は、増殖が遅いにもかかわらず、細胞密度を正規化すると、選択されたすべての菌株がより高い蛍光レベルを示すことを強調しています。注目すべきは、菌株#70が他の菌株よりも有意に高い蛍光レベルを示し、 p値が<0.01であったことです。これは、全体的な増殖挙動に悪影響を与えることなく目的のタンパク質を発現する形質転換体を同定するために、多数のコロニーをスクリーニングすることの重要性を強調しています。

mGFP5-6xHisの発現を確認するために、SDS-PAGEを使用して、C. vulgaris(WT)およびC. vulgaris形質転換体(#50)の両方からの粗タンパク質抽出物およびhisタグ精製タンパク質を分析しました。続いて、メーカーのプロトコル18に従って、Ni-NTA樹脂重力流キットを使用してhisタグタンパク質の精製を行いました。図4は、形質転換体サンプル#50にmGFP5-6xHisタンパク質(~30 kDa)が存在し、ネガティブコントロール(WT C. vulgaris)にタンパク質がないことを示しています。

図1:AMT後のC. vulgaris形質転換体の回収率(A)C. vulgarisの共培養後、形質転換体は、pCAMBIAプラスミドを含むAGL-1、または選択的プレート上のプラスミドを含まないAGL-1(AGL-1のみ)です。(B)選択的TAP寒天培地上のハイグロマイシンB(20 mg/L)プレートから選択された再縞模様の単一コロニー。(C)脱出したコロニーは、ハイグロマイシンB(20 mg/L)液体培地のAGL1のみのプレートでは増殖しません。(D)ハイグロマイシン培地では増殖できないハイグロマイシンおよび野生型C.尋常性菌を含む液体TAP培地で増殖したハイグロマイシン選択プレートからの単一コロニー#25、#50、および#50の増殖。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:pCAMBIA1302コンタミネーションの検出。 (A)形質転換体へのT-DNAの組み込み(B)とA. tumefaciensコンタミネーションの検出(C)。WTは野生型C.尋常性、PCはポジティブコントロール(pCAMBIA1302)、AGL1はA. tumefaciens AGL1株を示す。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:接種後3日目の形質転換体の増殖と蛍光。 (A)680nmの吸光度で測定した成長。(B)野生型株に正規化された蛍光。3〜4回の生物学的反復の平均、エラーバーは1 σを表します。 *p < 0.05、**p < 0.01 野生型 (WT)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4: C. vulgaris (WT)および形質転換 C. vulgaris サンプル#50におけるmGFP5-6xHis発現のSDS-PAGE解析。 抽出物は、C . vulgaris (WT)のレーン1〜4から、それぞれ精製(第1洗浄)、精製(希釈)、精製(濃縮)した粗精製から調製した。 C. vulgaris (WT) から粗精製 (第 1 洗浄)、精製 (溶出)、精製 (凍結乾燥) のレーン 5-8 をそれぞれ。赤色のボックスは、形質転換体#70から精製されたGFP-6xHisタンパク質を示しています。タンパク質はポリアクリルアミド12%ゲル上で分離した。タンパク質標準試料(Std.)の分子量(MW)を右に示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:培地とバッファーのレシピ。

利益相反は宣言されていません。