このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。
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この記事について
サマリー
要約
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。運動ニューロンは感覚運動行動を実行する最後のユニットであるため、SCSによる運動ニューロンの電気的応答を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にあるロジックを理解するのに役立ちます。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、この目標を達成するには、細胞の生存率を維持すること、脊髄を骨構造から迅速に分離すること、SCSを使用して活動電位をうまく誘導することなど、まだいくつかの複雑な困難があります。本稿では、運動ニューロンのSCSに対する電気的応答を高い時空間分解能で研究し、脊髄の分離と細胞生存率の維持を同時に行う技術を向上させ、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムを円滑に研究し、無駄な試行錯誤を避けるための詳細なプロトコールを提示する。
概要
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。Andreas Rowaldらは、SCSが下肢の自発運動と体幹機能を1日で可能にすることを報告しました1。自発運動回復のためのSCSの生物学的メカニズムを探ることは、より正確なSCS戦略を開発するための重要かつトレンドの研究分野です。例えば、Grégoire Courtineのチームは、脊髄の興奮性Vsx2介在ニューロンとHoxa10ニューロンがSCSに応答する重要なニューロンであり、細胞特異的なニューロモデュレーションがSCI2後のラットの歩行能力を回復するために実行可能であることを実証しました。しかし、単一細胞スケールでのSCSの電気的メカニズムに焦点を当てた研究はほとんどありません。古典的なイカ実験3,4,5では、閾値超の直流刺激が活動電位(AP)を誘発できることはよく知られていますが、SCSなどのパルス交流電気刺激が運動信号の生成にどのように影響するかはまだ不明です。
脊髄内神経回路の複雑さを考えると、SCSの電気的メカニズムを調べるためには、細胞集団の適切な選択が重要です。SCSは固有受容経路
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プロトコル
施設動物実験委員会は、すべての動物実験を承認し、研究は関連する動物福祉規則に従って実施されました。
1.動物の調製
- 動物
- 住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。
注:室内条件は20°C±2°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は食べ物と水を自由に入手できました。 - 運動ニューロンを逆行性に標識する:フルオロゴールド(FG)を両側脛骨筋前部および腓腹筋に注射して(滅菌生理食塩水で2%、筋肉あたり50μL)、犠牲の2日前に運動ニューロンを逆行性標識します。
- 住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。
- ソリューション
- 切断液を調製する:120 mM 塩化コリン、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO4、0.5 mM CaCl 2、7 mM MgCl2、1.3 mM アスコルビン酸、15 mM グルコースを混合します。解剖およびスライスの前に、95% O 2および5% CO2で溶液を30分間プレバブル化します(KOHでpH 7.4に調整します)。砕いた氷で溶液を冷....
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結果
微細な操作中の厳格な低温維持(補足図1、補足図2、および図1)のおかげで、細胞生存率はその後の電気生理学的記録を実行するのに十分良好でした。臨床シナリオを可能な限りシミュレートするために、マイクロマニピュレーションを使用して、SCS陰極と陽極をそれぞれ背側正中線とDREZの近くに配置し(図2)、後角の神経信号を開始して、運動柱の背外側領域の運動ニューロンに伝播できるようにしました。本研究では、FGを用いて直径20-50μmの運動ニューロンの位置を特定しました。図2D,Gに示すように、脊髄回路の末端である運動ニューロンとして健康なFG+ニューロンを自信を持って確認しました。この標識法は、SCSが焼成パターンにどのように影響するかを研究する道を開きました。遅延発火および即時発火運動ニューロンの電気生理学的特性を補足表1および補足表2
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ディスカッション
SCSによって変調された運動情報は、最終的に運動ニューロンに収束されます。したがって、運動ニューロンを研究対象とすることで、研究デザインが簡素化され、SCSの神経調節メカニズムがより直接的に明らかになる可能性があります。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、細胞の生存率を維持する方法、脊髄を骨構造から迅速に分離する方法、SCSを使用してAPをうまく誘導する方法など、いくつかの困難がまだあります。したがって、この研究は、研究者が重要な操作スキルをすばやく把握し、起こりうる落とし穴を回避し、方法論ではなく研究デザインにできるだけ早く集中できるようにすることを目的としています。
良好な細胞生存率を得るためには、常に次の詳細に注意を払う必要があります:(1)低温は細胞死を阻害し、代謝速度を遅くする可能性があるため、脊髄を氷のように冷たい温度に保つことは非常に重要です。(2)硬膜をマイクロハサミで繊細に除去することで、周囲の溶液からの神経栄養素の取り.......
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謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会の若手研究者(52207254および82301657)および中国ポスドク科学基金(2022M711833)から資金提供を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アデノシン5'-三リン酸マグネシウム塩 | シグマ | A9187 | |
| アスコルビン酸 | シグマ | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Σ | C5080 | |
| 塩化コリン | Σ | C7527 | |
| カバースライドピンセット | VETUS | 36A-SA | クリップでスライス |
| D-グルコース | Σ | G8270 | |
| EGTA | シグマ | E4378 | |
| 細ハサミ | RWD ライフサイエンス | S12006-10 | 横隔膜 |
| 蛍光光源 | リンパス | U-HGLGPS | |
| フルオロゴールド | フルオロクロー | ラベル | 運動ニューロン |
| グアノシン5′-三リン酸ナトリウム塩水和物 | グマ | G8877 | |
| HEPES | シグマ | H3375 | |
| 赤外線CCDカメラ | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | シグマ | P5405 | |
| K-グルコン酸 | シグマ | P1847 | |
| 融点アガロー | シグマ | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| マイクロマニピュレーター | サッターインストゥルメント | MP-200 | |
| マイクロピペットプーラー | サッター装置 | P1000 | |
| マイクロハサミ | Jinzhong | wa1020 | |
| 解剖学用 | Olympus | SZX10 | |
| 核病学用顕微鏡 | BX51WI | ||
| マイクロツーリング | RWD ライフサイエンス | F11008-09 | 切開した椎体を持ち上げる |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-ホスホクレアチン | Σ | P7936 | |
| 骨折学用対物レンズ | LUMPLFLN60XW | 作動距離 2 mm | |
| 浸透圧計 | 上級者向け | FISKE 210 | |
| パッチクランプアンプ | 軸索 | マルチクランプ700B | |
| パッチクランプデジタイ | ザーAxon | Digidata 1550B | |
| pHメータ | メトラー・トレド | FE28 | |
| スライスアンカー | マルチチャンネルシステム | SHD-27H | |
| 脊髄刺激装置 | PINS | T901 | |
| 歯付きピン | RWD ライフサイエンス | F13030-10 | 剣状 |
| ビブラトーム | ライカ | VT1200S | |
| 広帯域紫外線励起フィルター | オリンパス | U-MF2 |
参考文献
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after....
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