自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

サマリー

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。

要約

多光子顕微鏡と分子技術の進歩により、蛍光イメージングは急速に成長し、生きた脳組織の構造、機能、可塑性を研究するための強力なアプローチとなっています。従来の電気生理学と比較して、蛍光顕微鏡法は細胞の形態だけでなく神経活動も捉えることができ、同定されたニューロン集団を単一細胞または細胞内の分解能で長期間記録することができます。しかし、高解像度のイメージングには、通常、動物の動きを制限する安定した頭部固定セットアップが必要であり、透明なガラスの平らな表面を調製することで、1つ以上の水平面でニューロンを視覚化できますが、異なる深さを横断する垂直プロセスの研究には制限があります。ここでは、ヘッドプレート固定とマイクロプリズムを組み合わせて、多層およびマルチモーダルイメージングを行う手順について説明します。この外科的準備により、マウスの視覚野の柱全体にアクセスできるだけでなく、頭部固定位置での2光子イメージングと、自由に動くパラダイムでの1光子イメージングが可能になります。このアプローチを用いることで、異なる皮質層で同定された細胞集団をサンプリングし、頭を固定した状態で自由に動く状態での反応を記録し、数ヶ月にわたる長期的な変化を追跡することができます。したがって、この方法は、マイクロ回路の包括的なアッセイを提供し、適切に制御された刺激によって誘発された神経活動と自然な行動パラダイムの下での神経活動の直接比較を可能にします。

概要

光学系の新技術と遺伝子改変蛍光インジケーターを組み合わせたin vivo二光子蛍光イメージング^1,2の出現は、生きた脳の複雑な構造、機能、可塑性を研究するための神経科学における強力な技術として浮上しています^3,4。.特に、このイメージングモダリティは、ニューロンの形態と動的活動の両方を捉えることにより、従来の電気生理学に比べて比類のない利点を提供し、それによって特定されたニューロンの長期的な追跡を容易にします^5,6,7,8。

その注目すべき長所にもかかわらず、高解像度蛍光イメージングの適用は、動物の運動性を制限する静的な頭部固定セットアップを必要とすることがよくあります^9,10,11。さらに、ニューロンを可視化するために透明なガラス表面を使用すると、観察が1つ以上の水平面に制限され、異なる皮質の深さにまたがって広がる垂直プロセスのダイナミクスの探索が制限されます¹²。

これらの制限に対処して、本研究では、ヘッドプレート固定、マイクロプリズム、およびミニスコープを統合して、多層およびマルチモーダル機能を備えたイメージングモダリティを作成する革新的な外科的手順の概要を説明します。マイクロプリズムは、皮質柱^13,14,15,16に沿った垂直処理の観察を可能にし、これは、情報が皮質の異なる層を通過するときに情報がどのように処理され、変換されるか、およびプラスチック変化中に垂直処理がどのように変化するかを理解する上で重要である。さらに、それは、頭部固定パラダイムと自由に動く設定で、同じ神経集団のイメージングを可能にし、汎用性の高い実験設定^17,18,19を包含します:例えば、頭部固定は、感覚知覚評価や2光子パラダイム下での安定した記録などの適切に制御されたパラダイムにしばしば必要であり、自由に動くことは、行動研究のためのより自然で柔軟な環境を提供します。したがって、両方のモードで直接比較を行う能力は、柔軟で機能的な応答を可能にするマイクロ回路の理解を深めるために重要です。

要するに、ヘッドプレート固定、マイクロプリズム、ミニスコープを蛍光イメージングに統合することで、脳の構造と機能の複雑さを精査するための有望なプラットフォームを提供するのです。研究者は、すべての皮質層にまたがるさまざまな深さで同定された細胞集団をサンプリングし、適切に制御されたパラダイムと自然なパラダイムの両方でそれらの応答を直接比較し、²⁰か月にわたる長期的な変化を監視できます。このアプローチは、これらの神経集団がさまざまな実験条件下でどのように相互作用し、時間の経過とともに変化するかについての貴重な洞察を提供し、神経回路の動的な性質への窓を提供します。

プロトコル

すべての実験は、1986年英国動物(科学的手順)法(UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986)に基づき、適切な倫理審査を経て英国内務省が承認・発行した個人ライセンスおよびプロジェクトライセンスの下で実施されました。成人トランスジェニック株CaMKII-TTA;GCaMP6S-TRE²¹ を育種し、その子孫を実験に用いた。実験者の安全と無菌状態の維持のために、すべての手順は無菌条件下で、完全な個人用保護具を使用して行われました。

1.術前の準備

1. 浮腫を最小限に抑えるために、手術の12〜24時間前にデキサメタゾン(0.2 mg / kg)を皮下投与します。.
2. すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、手術前に蒸留水と70%エタノールで安定化次亜塩素酸で手術部位を滅菌します。すべての手術器具がオンになっていることを確認します。
3. 動物(24週齢、体重31 gの男性)にイソフルランを使用して麻酔をかけ、マウスを脳定位固定装置フレームに乗せると1%〜2%に減少し、O₂ は1〜2 L / minに保たれます。NSAIDs(カルプロフェン、2.5 mg / kg)を皮下に注射します。.
4. つま先つまみ反射がないことを確認して、麻酔の深さを評価します(反射が見られる場合は、イソフルラン濃度を0.5%刻みで増やします)。
5. トリマーを使用して、耳の後ろから目の少し上まで動物の頭を剃ります。この部分をアルコールワイプとポビドンヨード溶液で洗浄し、動物の目に接触しないようにします。
6. 耳と歯のバーが取り付けられた恒温性加熱パッドと脳定位固定装置フレームに動物を取り付け、頭を固定します。ヘッドが安定していることを確認することは、次の手順を成功させるために重要です(図1)。
7. 手術中に動物の目が乾燥するのを防ぐために眼科用軟膏を塗り、ホイルで覆って光から保護します。滅菌手術用カバーで動物を覆います。

図1:手術前の準備。 マウスは脳定位固定装置フレームに装着され、ノーズピースとイヤーバーで固定されます。マウスは、温度調節された加熱パッドの上に置かれます。目には眼科用軟膏が塗られ、アルミホイルで覆われています。頭を剃り、頭蓋骨を露出。滅菌カバーを動物の上に置きます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

2.開頭術

1. 外科用ハサミを使用して、頭の剃った部分の正中線に沿って皮膚を切開し、頭蓋骨を露出させます。
2. 滅菌綿棒と希釈過酸化水素(3%dH₂O中の35%H_{2O 2}の97%w / v)を使用して頭蓋骨を1〜3秒間洗浄し、結合組織を除去します(図2A)。70%エタノールの滴と新しい滅菌綿棒を使用して頭蓋骨を乾かします。
3. 頭蓋骨を前方/後方(AP)および内側/外側(ML)に位置合わせして、正確な移植部位を確保します。これを行うには、ブレグマとラムダの両方で頭蓋骨の背腹(DV)深さを測定し、2つの差が<0.03mmであることを確認します。正中外側のアライメントについては、正中線から両方の頭頂骨の等距離の点を測定し、DVの差が<0.03mmであることを確認します。
4. ブレグマを原点として使用し、目的の皮質領域を見つけてマークします。ここでは、これらは単眼一次視覚野(V1)、AP:-3.5 mm、ML:-2.5 mmです。
5. トレフィンドリルビット(直径1.8 mm)と歯科用ドリル(10,000 rpm速度)を使用して皮質を露出させ、目的の皮質領域(単眼V1)のマークがドリルビットウィンドウの下3分の1内にあることを確認します。
   1. ドリルビットの角度が頭蓋骨の曲率に対して垂直であることを確認してください。これにより、開頭手術が均一になり、硬膜や皮質の損傷を防ぐことができます。
   2. 抵抗が減少するまでドリルで穴を開けてから停止します(図2B)。23Gの針先を使用して、剥離した骨片を慎重に取り除きます(図2C)。
   3. 冷たい人工脳脊髄液(ACSF)で飽和したサージカルフォームで露出した皮質を洗浄し、破片を取り除き、発生する可能性のある出血を止めます。
   4. 手術中は、冷たいACSFを使用して、露出した皮質を常に水分補給してください。

図2:開頭術。 (A)ブレグマとラムダの間の皮膚切開を示す。露出した表面から結合組織が除去されています。(B)骨片を除去する前のトレフィンドリルによる開頭術。(C)骨片を切除した後の開頭術で、硬膜と皮質が無傷である(スケールバーは0.5mmを表す)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3.プレカット切開

注:プレカット切開を行う際に考慮するには、切開とマイクロプリズムの移植は、イメージング対象領域(ROI)の前方にある必要があります。これは、完全で正確な視野を可能にするためです。このプロトコルのコンテキストでは、切開は内側軸に沿って行われ、マイクロプリズムは後部を向いています(図3B)。

1. 挿入を助け、マイクロプリズムの挿入中の皮質の圧力を緩和するために、切開を行います。
2. サージカルナイフを脳定位固定装置アームホルダーに取り付け、ブレードまたは脳定位固定装置アームをML軸に沿って切断するように向けます。
3. ナイフを目的のAP座標(AP:-3.4mm)に移動します。プリズムはROIの前にある必要があるため、切開部をイメージングROIのAP座標(-3.5mm)の100μm前方にします。
4. 次に、ナイフを頭蓋骨と出会う開頭術の内側の端に移動し、骨に到達するまでナイフをゆっくりと下げてから停止します。骨の厚さは200μmなので、この値を総挿入深さに組み込みます(ステップ5.1の計算を参照)。
5. 最適なイメージングは、プリズムの中心、つまり500μmにあります。したがって、この深さが皮質柱の深さ(ROI DV:-0.35 mm)と一致していることを確認してください。
   1. 頭蓋骨の厚さを深さの計算に組み込んで、頭蓋骨の表面から事前にカットされた切開の深さを決定する以下の式を使用します。このプロトコルでは、移植の深さは次のように計算されます。
      骨厚(200μm)+イメージングROI(例:350μm)+残存マイクロプリズム深度(500μm)=1,050μm
6. 切開の長さが1mmを超えているが、過度にないことを確認してください。したがって、1.2 mm の距離が理想的であり、単眼 ML 座標はこの距離の中央にあります。
7. 切開を行う準備ができたら、視界が遮られないように余分なACSFを取り除きます(図3A)。
   1. ナイフを開頭術の内側端から切開の開始内側座標に移動します。ゆっくりと(10μm/s)ナイフを皮質に下げます。
   2. 硬膜に穴を開け、ナイフが皮質に入ったら、冷たいACSFを皮質に一滴垂らし、切開中に組織を潤滑し、水分を補給します。
8. 最終的な深さに達したら、ナイフをML軸に沿って(10μm/sの速度で)動かし始めます。
   1. 切開が行われている間、周囲の組織を観察し続けます。ティッシュがナイフと一緒に引きずられている場合は、ナイフを数回上下に動かしてティッシュが切断されていることを確認してから、ナイフを最終的な深さに戻すことを忘れないでください。
9. 完了したら、ナイフをゆっくりと上げます。切開中に血液が出てきた場合は、この時間を利用してACSFに浸したサージカルフォームで切開部位を洗浄し、血液を希釈し、切開部内の血液を押し出します。マイクロプリズムを挿入する準備ができるまで、露出した皮質の上に新鮮で飽和した外科用フォームを残すことを忘れないでください。

図3:マイクロプリズムの移植。 (A)プレカット切開。(B)皮質内の位置を示す統合マイクロプリズムレンズの概略図 (C)皮質に挿入する前に、事前に切開された正しい向きの統合されたマイクロプリズムレンズ(スケールバーは0.5mmを表します)。(D)頭蓋骨への取り付けを固定するために一体型レンズの周囲にセメントが堆積した例。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

4.マイクロプリズム挿入とヘッドプレート移植

1. マイクロプリズムレンズは、レンズの遠位端にあるプリズムに取り付けられた勾配屈折率レンズで構成され、ベースプレートに組み込まれています。マイクロプリズムをインプラントキットに取り付けます。
2. プリズムのイメージング面がベースプレートのネジと反対側にあることを確認します。マイクロプリズムの挿入と配置を容易にするために、マイクロプリズムを脳定位固定装置フレームに取り付け、切開部と位置が合うようにプリズムの向きを合わせます(図3C)。
3. マイクロプリズムを切開部位にゆっくりと下げます(10μm/s)。最初にプリズムを挿入するときはACSFを外すことを忘れないでくださいが、皮質に入ったら、冷たいACSFで洗い流して挿入を潤滑します。
   1. プリズムが切開部に下がっている間、皮質は安定したままでなければなりません。そうでない場合は、ACSFを追加し、プリズムを上下に動かして皮質をプリズムから緩めて皮質を攪拌します。
4. 最終的な深さに達したら、プリズムに触れないように注意しながら、滅菌組織を使用して露出した皮質表面を乾燥させます。
5. プリズムとレンズの周囲の露出した皮質領域をシリコーン接着剤の保護層で覆い、周囲の頭蓋骨とダミースコープへの過剰な接着剤を最小限に抑えます。
6. 硬化したら(5〜10分)、ヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けて、頭部固定イメージング中に頭を安定させます。
   1. インプラントの配置を妨げないように、またインプラントを適切に固定するためにセメントを適切に塗布できるように、ヘッドプレートが十分に後方にあることを確認してください。
   2. ヘッドプレートの正中線が埋め込み型レンズのやや右側にあることを確認し、ヘッドプレートの両側がヘッドステージに固定されるようにします
7. ヘッドプレートと頭蓋骨に接着セメントを塗布します。
   1. 不透明なセメント粉末1スクープと4滴の混合培地を混合し、1滴の触媒を塗布して、接着性歯科用セメントを調製します。
   2. ヘッドプレートと頭蓋骨の両方にセメントを置き、硬化するまでヘッドプレートを所定の位置に保持し、イヤーバーと平行になるようにします(目視検査により、動物の頭の上と後ろの両方から検査します)。
8. 露出した頭蓋骨と組織の残りの部分を覆うように接着セメントを塗布し、マイクロプリズム(ベースプレートのベースまで)とヘッドプレートを組み込みます。
9. ベースプレート、ダミー顕微鏡、またはそのコンポーネントにセメントが付着しないようにしてください。マイクロプリズムとヘッドプレートが覆われて安定するまで、接着セメントを塗布し続けます(図3D)。
10. セメントが硬化したら、鉗子でマイクロプリズムを安定させながら、脳定位固定装置アームをゆっくりと上方に動かしてダミー顕微鏡を取り外します(鉗子は磁石で接続されているため、分離中に多少の抵抗を感じる場合があります)。
11. 保護カバーをレンズに挿入し、ネジを締めて所定の位置に固定します。
12. 動物を脳定位固定装置フレームから取り出し、温かい回復ボックスで回復させ、温めた滅菌0.9%生理食塩水を皮下投与します(体重の3%)。
13. 動物が目を覚まして動いたら、清潔なシングルハウスのケージに戻します。動物を監視し、地元の機関の鎮痛に関する方針に従って、追加の術後鎮痛剤を投与します。
14. 手術後4週間待つと、動物はイメージングの準備ができているはずです。

5. 自由に動くマウスの皮質層の1光子カルシウムイメージング

注:目的のイメージング面を正確に取得するには、毎回元のイメージングセッションからキャプチャされた画像を利用することが不可欠です。これらの同定されたランドマークは、ニューロンとともに、プロトコルのステップ9で詳細に説明されているアライメントプロセスにおいて重要な役割を果たします。1光子データを取得する場合、ミニスコープはイメージングシステムとレーザー光源の両方になります。励起は、対物レンズ前面に0-2 mW/mm² の出力範囲を持つLEDを使用します。このレーザーは、GCaMPシグナル伝達に455nm±8nm(青色光)の励起波長を使用します。レンズフォーカススライダーを使用してフォーカス(Z軸)を調整でき、インターフェース上では0〜1000(0は0μmの作動距離、1000は最大300μmの作動距離を表します)として表されます。

1. データを取得する前に、記録セッションの前に、動物を部屋とオープンアリーナに1時間順応させます。
2. イメージングする前に、適切な消毒剤(蒸留水と70%エタノールで安定化次亜塩素酸など)ですべてを消毒し、洗浄してください。
3. DAQボックスをコンピュータに接続し、データ集録ソフトウェアを起動してセットアップします。イーサネットケーブルを介して直接接続を確立し、フレームのドロップを最小限に抑えます。ただし、ワイヤレス接続の強度によっては、ワイヤレス接続モードで十分な場合があります。
4. ミニスコープを動物のベースプレートに穏やかな首筋の下に取り付けます。
   1. まず、止めネジを緩めて、ベースプレートから保護カバーを取り外します。鉗子でカバーの開口部を持ちます。次に、カバーが置かれているベースプレートにミニスコープを取り付けます。
   2. ベースプレートに対するミニスコープの向きを確認してから、ネジのマーキングのある面がネジに面するように取り付けます。
   3. ミニスコープを取り付けたら、止めネジを締めて安定させます。ある程度の抵抗が感じられるまで、止めネジを進めてください。止めネジを締めすぎると、ミニスコープが損傷する可能性があるため、避けてください。
5. MiniscopeをDAQボックスに接続し、記録用のソフトウェアを準備します。
   1. データ収集ソフトウェアで、ミニスコープのストリームをオンにし、記録パラメータ(イメージングフレームレート、ゲイン、LEDパワー、efocus値)を調整して、クリアな視野を実現します(図4A)。
   2. ヒストグラムウィンドウをオンにし、ゲインとLED電力を調整して、記録された強度が35%から70%の間になるようにします。
   3. 縦断的研究を行う場合は、以前のセッションで撮影した記録またはスナップショットを参照し、同じイメージング面がはっきりと見えるようにefocus値を調整します。
6. 実験とデータ取得を開始します。
7. 実験終了後、動物を行動装置から取り出します。
   1. 穏やかな首筋の下で、止めネジを緩め、ミニスコープを動物のベースプレートから取り外します。
   2. 保護カバーをベースプレートに戻し、止めネジで安定させます。
8. 動物をホームケージに戻します(1光子データを処理する場合は、手順7に進みます)。

図4:ソフトウェアによるデータの取得と処理。 (A) Miniscopeからのリアルタイムストリームを示す画像。レンズのフォーカス値を調整して、ゲインとイメージングレーザーパワー(B)とともに、ストリーミングウィンドウにはっきりと見えるようにすることをお勧めします。 異なる時点で記録されたセッションの推奨されるアライメントワークフローを示す概略図。データ処理ソフトウェアの指示に従って、最初のセッションから平均画像を生成することをお勧めします。この画像は、次のセッションのモーション補正時に参照画像として使用する必要があります。(C)同じ最大投影ΔF/F画像からの4つのセルの例。各セルにオレンジ色の線が引かれ、セルの直径がピクセル単位で測定され、その平均がセル識別アルゴリズムの入力引数として取得されます (左上: 13、右上: 11、左下: 12、右下: 13)。(D)手動キュレーション後の細胞同定アルゴリズムの出力(画像はトリミングされています)。白い輪郭は同定された細胞を表します(スケールバーは100μmを表します)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

6. 頭部固定マウスの皮質層の2光子カルシウムイメージング

注:2光子レーザー走査型顕微鏡の場合、光源は励起波長920 nmの波長可変超短パルスレーザーです。対物レンズで測定された励起パワーは、典型的には100〜150mWであり、各セッションで同様のレベルの蛍光が得られるように調整された。発光光を発光フィルター(525/70nm)でフィルタリングし、グリーンチャンネルと呼ばれる独立した光電子増倍管(PMT)で測定しました。画像は、20倍の空気浸対物レンズ(NA = 0.45、作動距離6.9-8.2mm)で取得しました。

1. データを取得する前に、数日前に動物を装置に慣れさせます(動物が行動設定に慣れるようにするため)。動物が1日15〜30分、2〜3日間、セットアップを探索するか、データ取得を開始する前に自然な行動を示すまで過ごします。
2. 2光子イメージングシステムの電源を入れ、取得ソフトウェアを起動して、レーザーをオンにします。 続行する前に、レーザーがシャッターされ、光電子増倍管がオフになっていることを確認してください。
3. 蒸留水と70%エタノールで安定化された次亜塩素酸で洗浄された2光子イメージング装置。
4. 動物のサイズに合わせて装置を調整してください。マウスとそのヘッドプレートをヘッドステージセットアップにそっと取り付け、所定の位置にねじ込んでマウスの頭を安定させます。
5. 取り付けたら、レンズカバーを取り外し(手順5.4.1を参照)、ベースプレートの上に対物レンズを合わせます。
6. 落射蛍光とXYZステージコントロールを使用して、皮質組織に焦点を合わせます。
7. 皮質層が見えたら、顕微鏡を切り替えて2光子イメージングを可能にします(ミラーをダイクロイックミラーに交換し、蛍光シャッターを閉じ、落射蛍光レーザーとモニターの電源を切ります)。撮影時は、光電子増倍管を保護するために、必ず主灯を消してください。
8. 取得した画像ファイルを最適化するためのパラメータを設定します。
   1. カルシウムイメージングには、GCaMPシグナルの高速発光を捉えることができる共鳴取得モードを使用します。
   2. レーザー出力、PMTゲイン、ズーム、ルックアップテーブル(LUT)を調整して最適な画像を取得し、1光子画像を参照して正しい焦点面が画像化されていることを確認します。
   3. 行動モニタリングと刺激入力(該当する場合)を同期させた2光子システムで皮質層のイメージングを開始します。
   4. 時間の経過とともに同一の画像を再現する場合は、これらの取得パラメータとXYZ距離を必ず保存してください。
9. 皮質層のzスタックをキャプチャするには、以下に説明する手順に従います。
   1. zスタックを開始する平面を見つけ、取得パラメータを調整して画像を最適化し、これをソフトウェアの開始点としてマークします。
   2. 次に、Zコントロールを使用してスタックを下に移動し、スタックの輝度を一定に保つようにレーザー出力を調整するだけで、ソフトウェアでスタックの終了をマークします。
   3. 重要なステップ:[レーザー出力勾配]タブの[相対指数勾配]オプションを使用して、ソフトウェアがzスタックを通過する際のレーザー出力の増加を計算できるようにします。勾配を計算できるように、ソフトウェアが提供する表の終点レーザー出力値を必ずマークダウンしてください。
   4. zスタックパラメータを設定したら、ステップサイズ(μm)を調整します。
      注: ステップ サイズによって、スタックの所要時間、スライス数、および詳細品質が決まります。ステップサイズが小さいほど、ステップサイズが大きい場合と比較して、取得時間が長くなり、スライス数が増加し、詳細度が向上します。Zスタックは、解剖学的なランドマークや特徴を強調するため、1光子および2光子画像のレジストレーションを支援するために使用されます。
10. ニューロンのカルシウム変化の時系列(T系列)を取得するには、XYZステージコントロールを使用して最適な焦点面を見つけ、レーザー出力、PMTゲイン、ズーム、およびLUTを調整します。
    1. アクイジションソフトウェアの [T-series ]タブで、1光子イメージングシステムを使用してアクイジションしたデータと一致するアクイジション周波数パラメータを定義します。
       注:周波数を一致させると、1Pと2Pのデータが比較可能になり、データ処理ステップで使用されるセル識別アルゴリズムに適しています。複数のトリガやその他のアクイジションモードをTシリーズアクイジションに組み込むことができます。
11. Tシリーズ買収開始

7. 1光子カルシウムイメージングデータの処理

1. 1光子で動画を記録するには、Miniscopeシステムに付属のデータ処理ソフトウェアを使用してください。
   1. まず、空間的および時間的ダウンサンプリングによってムービーを前処理します。一般に、動画の空間的ダウンサンプリングを2倍にすると、細胞同定の精度を著しく損なうことなく、処理時間が大幅に短縮されます。
   2. 動画のフレームレートが 10 Hz 付近まで下がるように、時間的ダウンサンプリング係数を設定し、次の手順で使用するセル識別アルゴリズムにより適しています。
   3. 同一撮影日に複数の動画を取得する場合は、前処理工程の前に動画を1つの時系列に結合してまとめて処理します。
   4. 必要に応じて、空間バンドパスフィルタをムービーに適用して、低空間周波数と高空間周波数を除去し、コントラストの高い滑らかなムービーにします。
2. ソフトウェアの動作補正機能を使って動画を登録します。これにより、動画が登録され、イメージング面に対するミニスコープの動きによって引き起こされるモーションアーチファクトが補正されます。
   1. 重要なステップ:縦断的研究を行う場合は、映画を同じ視野、たとえば、最初のイメージング日に撮影された映画の平均画像に登録します(図4B)。
   2. 対応するタブを使用して動画のΔF/Fを計算し、動画を投影してΔF/F動画の最大投影画像を生成します。この画像は、蛍光レベルの変化を示す領域を示しており、個々のニューロンの可能性があり、ニューロンの平均直径を測定するために使用できます(図4C)。
   3. あるいは、ニューロンが明瞭な蛍光を示す動き補正動画で細胞径を測定します。
3. ソフトウェアのアルゴリズムを使用して細胞を同定します。
   1. このステップでは 2 つのオプション (PCA-ICA と CNMF-E) を使用できますが、この試験では CNMF-E を使用します。平均セル直径をピクセル単位で入力し、アルゴリズムを実行して、細胞のような活動を示す関心領域 (ROI) を含むセル セットを生成します。
   2. 細胞であるROI(細胞様の形態を持ち、活性^が22、23で、FOV内にある)とそうでないROIを手動で選択し、キュレーションされた細胞セットを検証します(図4D)。
4. 各ROIのカルシウム痕跡をエクスポートして、さらに分析します。

8. 2光子カルシウムイメージングデータの処理

1. 2光子記録動画の場合は、2光子カルシウム解析データを処理するために設計されたPythonパッケージを使用します。
2. まず、Tシリーズで撮影した画像を、以下のように.tiffスタックに結合します。
   1. [実行オプション] インターフェイスで、タウ値やフレームレートなどのパラメーターを調整して、使用する GCaMP と記録のフレームレートと一致するようにします。
   2. オプション: do_registration パラメーターを 1 に設定して、ムービーを登録します。これは、上述した動き補正ステップと同等である。
   3. オプション: anatomical_onlyパラメーターを 1 に設定して、蛍光ダイナミクスに加えて解剖学的特徴を使用して ROI を検出します。セル径の入力が必要なので、画像処理ソフトで測定してください。これは、より自然な形状のROIを生成するため、一般的に推奨されます(図5A-C)。
   4. すべてのパラメーターを設定したら、アルゴリズムを実行して、すべての計算が同時に実行されるようにします。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) を参照して、進行状況を確認します。
   5. 完了したら、細胞選択インターフェースに戻り、細胞同定結果を手動でキュレーションします。
3. キュレーションされたセルの画像を、ムービーの最大投影の上に保存します。これは、後で1光子記録データを登録するための参照画像として使用します。
4. その後、アルゴリズムは結果を自動的に保存します。npy形式で、後でPythonでアクセスできます。または、結果を他の形式のファイルに保存して、他のソフトウェアでさらに分析することもできます。

図5:2光子処理ソフトウェアを用いた細胞同定。 (A)2光子処理ソフトウェアから取得した細胞同定の代表画像。 Anatomical_only パラメーターを 0 に設定し、他のすべてのパラメーターを同じにすると、破線の間の領域に複数の非セルが存在し、実際のセルの手動キュレーションに干渉します。(B)画像処理ソフトによる(A)の細胞径測定例(左上、7.5ピクセル、右上、9、左下、6.5、右下、7.5)。(C)細胞同定の代表画像。 Anatomical_only パラメータを1に設定し、(B)から取得した平均セル径をセル径アルゴリズムに入力すると、破線(スケールバーは200μm)の間の領域にセルが存在しません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

9. イメージングモダリティ間で同定された細胞セットの登録

1. 1光子および2光子の記録から同定された細胞を、1光子イメージングソフトウェアのPythonインターフェースを介して利用可能なマルチモーダル画像レジストレーションおよび解析アルゴリズム(MIRA)で登録します。
   1. このアルゴリズムは、非剛体レジストレーションを介して 1 光子と 2 光子のデータをアライメントします。Web サイトにあり、この研究に使用された一連のデモンストレーション オンライン ノートブックを参照してください。
      注:ノートブックは、すべての処理が1Pソフトウェアで完了するように作成されているため、2P処理ソフトウェアと互換性がありません。したがって、この調査では、ノートブックの一部の手順のみを実行します。
2. デモノートに記載されている手順に従い、各イメージングモダリティの構造画像を生成します。デフォルトでは、これには 2 光子の z スタックの最大投影と 1 光子記録の平均画像の生成が含まれます。あるいは、2光子記録の平均画像を使用します。
   1. プロンプトが表示されたら、空間バンドパスは画像をフィルタリングしてランドマークをより適切に視覚化し、一致するように方向を変更します。
3. 2 つの画像で一致するランドマークを選択します (図 6A)。
   1. これらを使用して、2 つのイメージの位置合わせに必要なワープを計算します。一般に、3〜5つのランドマークで十分です。
   2. このアルゴリズムは、ランドマークと画像の類似性の組み合わせに基づいてワープを計算します。満足のいく結果が得られるまで、2つの因子に与えられた相対的な重みに対して最適化します。
4. 1光子セッションで取得した細胞マップをワープして、2光子データにアライメントされた新しい細胞マップを生成します。
   1. 次に、この歪んだセルマップを1P処理ソフトウェアにインポートして、2光子ムービーの投影像が最大になる画像を背景に生成します。
   2. 登録目的でこのイメージをエクスポートします。
5. プログラミングソフトウェアで、これまでに生成した2つの画像(2光子最大投影像の上に2光子セルマップ)を位置合わせし、2光子最大投影像の上に1光子セルマップをワープします(図6B、C)。
   1. これを行うには、この調査では、ユーザーがさまざまな登録手法の結果を比較できる登録推定アプリケーションを使用します。2つの画像が同じ背景を持つことを考えると、厳密なレジストレーションを備えた位相相関手法で十分でした。
6. レジストレーションが完了したら、レジストレーションされたイメージをスキャンして、重なり合う ROI を探します。これらは、両方の記録セッションでアクティブな ROI であり、さらなる分析に使用できます。

図6:MIRAワークフローを用いたクロスモダリティ細胞レジストレーション。 (A)細胞アライメントワークフローの代表的な画像。左が1光子データの平均画像、右が2光子データの平均画像です。両方の画像から一致するランドマークが選択され、ランダムな配色(赤い円)でソフトウェアにラベルが付けられます。(B)同定された2つの細胞セット、1光子(紫)および2光子(緑)を示す例示アライメント画像を、2光子データの平均画像に重ね合わせる。(C)(B)の白枠で囲んだ領域の画像では、ここでは整列したセルが緑と紫の輪郭線を重ねて表している。すべてのパネルにおいて、スケールバーは200μmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

結果

1光子と2光子の両方のイメージングモダリティを使用して、自由に動き、頭部を固定した条件下で、数週間にわたって同じニューロン集団の慢性多層in vivo カルシウムイメージングを実施する方法が示されています。ここでは、動物が暗闇の中でオープンアリーナを探索している間に、1光子イメージングの下で一致するニューロン集団を特定する能力が実証されました(図7A)。同定されたニューロンから微量のカルシウムを抽出し、比較のためにzスコアを付けました(図7B)。ニューロンは、3週間間隔のセッションで同等のレベルの蛍光と発火率を示しました。

図7:一次視覚野からのカルシウム動態は、3週間にわたるセッション間で安定して記録できます。 (A)同定されたニューロンの空間フィルターを、3週間にわたる1光子で自由に動くカルシウムイメージング下での同じ視野の3つの別々の記録からの最大投影画像に重ね合わせました。ROI は、(B) に示されている順序でラベル付けされます。2回目(中央)と3回目(右)の暗い領域は、1回目(左)のセッションを基準とした画像レジストレーションの結果です(スケールバーは0.5mmを表します)。(B)(A)に示す第1セッション(左)、第2セッション(中央)、第3セッション(右)における登録ROIのZスコアカルシウム活性。水平スケールバーは 10 秒、垂直スケールバーは 10 sd です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

次に、異なるイメージングモダリティにわたるニューロン集団の登録が実証されました。1光子と2光子のイメージングセッションは、同じ日に実施されました。ROIは1光子データから同定し、手動でキュレーションしてセルマップを生成しました(図8A)。同様に、2光子データを処理して細胞マップを生成し、細胞を自動的に同定し、デモンストレーション用に手動で選択しました。次に、1光子セッションからの平均投影像を、MIRAプラットフォームを使用した2光子zスタックからの最大投影像に位置合わせしました(図8B)。次に、この歪んだ細胞マップをエクスポートし、2光子最大投影画像に重ね合わせ、2光子細胞マップと位置合わせしました(図8C)。これにより、両方のイメージングモダリティで同じ細胞の活性を示す細胞同定が可能になり(図8D)、ニューロン応答の定量分析に使用できます。

図8:一次視覚野からのカルシウム動態は、異なるイメージングモダリティ間で記録されています。 (A)特定されたニューロンの空間フィルターを、1光子の自由に移動するセッションからの最大投影画像に重ね合わせます。標識ニューロンは、(C)で提示された2光子記録データに正常に登録されたニューロンです。(B)(A)と同じ輪郭を、(C)の2光子セッションデータと一致するように歪ませた。(C)アライメント後の(A)に示すROIの空間フィルター(白)と、同日の2光子ヘッド固定記録セッションから2P処理ソフトウェアを使用して同定されたROI(緑)を、2光子セッションの最大投影画像に重ね合わせたもの。重複する ROI は登録済みと見なされ、さらなる分析のために選択されます (スケール バーは 0.5 mm を表します)。(D)1光子(左)および2光子(右)の記録セッション(水平スケールバーは10秒、垂直スケールバーは10秒)で登録されたROIのZスコアのカルシウム活性。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、同じ神経集団において、頭部固定状態と自由に動く状態の神経細胞を観察し、直接比較できることを示しました。視覚野での応用を実証しましたが、このプロトコルは、皮質領域と深部核24,25,26,27,28、およびその他のデータ収集および行動セットアップ^29,30の両方の他の多くの脳領域に適合させることができます。

このプロトコルでは、最適なデータ取得を可能にする重要なステップを書き留めておくことが重要です。まず、Zスタックを実行するときは、全体を通して一貫した輝度を維持することが重要です。前述したように、光は浸透する組織が多いほど散乱します。したがって、ゲインを上げることで、レーザーはより多くのパワーを持ち、組織をさらに浸透させ、ROIを励起することができます。ただし、深部組織のROIを励起するために必要なゲインでzスタックを開始すると、蛍光構造の過剰露光と光毒性が発生し、皮質表面の組織が漂白される可能性があるため、お勧めできません。したがって、[ 相対指数勾配 ] オプションを選択すると、z スタックの各ステップで最適になるために必要な検出力の定常勾配を計算できます。第二に、細胞セットを経時的に一貫して登録するための次の重要なステップは、最初の1光子イメージングセッションで撮影した動画の平均画像を確実に保存することです。これにより、ユーザーは後続のイメージングセッションを元の画像と比較し、細胞セットとデータ取得の連続性を確保することができます。

軽量で小型化された2光子顕微鏡が独立して設計されていることは注目に値します^31,32、これは自由に行動する動物の高解像度イメージングを可能にします。これは、高解像度のin vivoイメージングのエキサイティングな進歩を強調していますが、限られた視野(FOV)と高度に専門化された設計により、一般のエンドユーザーにとっては困難です。私たちが説明した方法は、商用サプライヤーからすぐに入手できるいくつかの確立されたプラットフォームを統合し、アクセス可能な選択肢にします。理論的には、オープンソースのミニスコープおよび一般的な2光子顕微鏡と互換性のあるカスタマイズされた自己組織化マイクロプリズムに置き換えることもできる^33,34。

それにもかかわらず、このプロトコルは、エラーが実行不可能なFOVにつながり、その結果、データが損なわれる可能性があるため、正確なマイクロプリズムの移植などの課題に直面しています。また、異なるモダリティで一貫したFOVを維持することは、画像取得に使用される目的が異なるため、困難です。ただし、マイクロプリズムのXY軸は固定されたままであるため、FOVの変化はZ軸に沿っています。したがって、両方のイメージングモードに存在する特定のランドマーク(血管、皮質組織のアーチファクト、同一のニューロンなど)を使用して、FOVを同期させます。さらに、異なるモダリティで同じニューロンをアライメントして識別するためにレジストレーションを適用することが重要です。注意すべきもう一つの課題は、両方のモダリティで取得中のGCaMP組織の光退色を最小限に抑えることです。したがって、記録に費やす時間を減らし、信号対雑音比を最適化し(LED/レーザー出力ではなくゲインを上げることによって)、イメージングセッションの間に24〜48時間待つことが重要です。

これらの固有の複雑さにもかかわらず、私たちのプロトコルは、外科的精度と適切な画像処理技術で実行されると、神経活動を比較するための堅牢なプラットフォームを提供します。これにより、厳密に制御されたタスクにおける頭部固定状態と、より自然な行動を模倣した自由に動く状態との比較が可能になり、神経科学の分野での応用の可能性が広がります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9% 輸液用塩化ナトリウム溶液 (Vetivex 11) 250ml	デクラ	20091607	生理食塩水 水分補給および薬物回収用
18004-1 トレフィン 直径 1.8mm バー	FST	18004-18	ドリルビット
1ml シリンジ	テルモ	MDSS01SE	1ml シリンジ
23G x 5/8 インチ 6% ルアー針	テルモ	NN-2316R	23G 針
71000 自動定位固定装置	RWD-RWD
吸収性止血ゼラチンスポンジ (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	ゲルフォーム
アルコールパッド 70% イソプロピルアルコール	ブラウン	9160612	アルコールパッド
アルミホイル	小売業者	-	手術中に目を覆うホイル
人工脳脊髄液	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
自動マイクロインジェクションポンプ	WPI	8091
ベタジン溶液 (10% ヨウ素化ポビドン) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (カスタマイズ)			イメージングシステム
カーディフ Aldasorber	Vet-Tech	AN006	麻酔吸収器
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon		MRH48230 20倍対物レンズ
コンパクト麻酔システム - 単一ガス - イソフルラン K/F、酸素濃縮器付き モデル:ZY-5ACおよび掃気ユニット	Vet-Tech	AN001	コンパクト麻酔システム
コンテック プロクロル	アストンファーマ	AP2111L1	消毒剤(次亜塩素酸)
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射剤、USP、4mg / ml、NDC:0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	デキサメタゾン
解剖ナイフ、刃先4mm、厚さ0.5mm、ステンレス鋼	ファインサイエンスツール	10055-12	皮質切開用ナイフ
サイド、非穿刺マウス&新生児ラットの耳棒	Stoelting	51649	耳棒
ダミー顕微鏡	Inscopix	ダミー顕微鏡	移植を助けるために
エタノール(100%)	VWR	40-1712-25	70%エタノールの製造に使用
フィッシャーブランド ニトリル インディゴ 使い捨て手袋 PPE Cat III	FischerScientific	17182182	手袋
ホメオサームモニター 50-7222-F	ハーバード ホメロジケート	50-7222-F	ホメオロメティック モニタリング システム/ヒーティングパッド
画像処理ソフト	ImageJ	-	画像処理ソフト
Inscopix データ処理ソフト (IDPS)	Inscopix	-	一光子カルシウムイメージング処理ソフトウェア
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	二光子イメージングレーザー
IsoFlo 250ml 100% w/w吸入	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-SIL 低毒性シリコーン接着剤	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	シリコーン接着剤
MICROMOT メインアダプター NG 2/S, w/ ドリルユニット 60/E	PROXXON	NO 28 515	ハンドヘルドドリル
nVoke 統合イメージングおよびオプトジェネティクスシステムパッケージ	Inscopix-One-photon		イメージングシステムおよびソフトウェア
ProView インプラントキット	Inscopix	ProView インプラントキット	ダミー顕微鏡、脳定位固定アームおよびアタッチメント
ProView プリズムプローブ	Inscopix	1050-002203	マイクロプリズムレンズ
リマジル (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	カルプロフェン
テーブルクランプ付き多関節アームの立体視鏡	WPI	PZMTIII-AAC	顕微鏡
スーパーボンドユニバーサルキット、SUNメディカル	プレステージ-デンタル	K058E	接着剤
二光子カルシウム画像ソフトウェア	Suite2P	-	二光子カルシウムイメージング処理ソフトウェア
蒸気	Vet-Tech	-	イソフルラン蒸気
ザイリン潤滑眼軟膏5g	ザイリン-ナイト	MLG / 28/1551	眼科軟膏