繁殖性強膜サンゴPocillopora acutaの給餌と生息域外培養のための効果的な技術

世界中の多くのサンゴ礁の生態系は、気候変動によって引き起こされる高温ストレスの結果として失われ、劣化しています^1,2。サンゴの白化(サンゴと藻類の共生の破綻^{3)は、過去4}では比較的稀であると考えられていましたが、現在ではより頻繁に発生しており⁵、今世紀半ばから後半までに多くの地域で毎年白化が発生すると予想されています^6,7。このように白化現象の中間期間が短くなると、サンゴ礁の回復力の能力が制限され^{る可能性があります8。}サンゴのコロニーに対する高温ストレスの直接的な影響(例えば、組織の損傷⁹、エネルギーの枯渇¹⁰)は、サンゴ礁規模のレベルでの間接的な影響と本質的に関連しており、その中でも繁殖能力/加入能力の低下が特に懸念される¹¹。これにより、例えば、加入の積極的なin situ強化(例えば、サンゴ礁の播種¹²)、サンゴの回復をスケールアップするための新技術¹³、生息域外生殖システムを誘導するための生殖手がかりのシミュレーション¹⁴など、さまざまな応用研究が促進されました。これらの積極的な介入を補完するものとして、高温ストレス下でのサンゴの従属栄養給餌の利点の最近の認識¹⁵と、食物供給が繁殖に果たす役割の探求¹⁶があります。

従属栄養摂食はサンゴのパフォーマンスに影響を与えることが知られており¹⁷、サンゴの成長の増加^18,19、および熱抵抗と回復力^20,21に特に関連しています。しかし、従属栄養の利点はサンゴ種に遍在しているわけではなく²²、消費される食物の種類²³や光への曝露のレベル²⁴によって異なる可能性があります。サンゴの繁殖の文脈では、従属栄養給餌はさまざまな結果を示しており、従属栄養給餌後の繁殖能力が高い²⁵と低い²⁶の観察が報告されています。従属栄養摂食がサンゴの繁殖に及ぼす影響は、温度スペクトル全体で評価されることはめったにありませんが、温帯サンゴCladocora caespitosaでは、従属栄養が低温条件下での繁殖にとってより重要であることがわかりました²⁷。特定のサンゴ礁(例えば、高い食料入手可能性に関連するサンゴ礁²⁸)が気候変動下でより高い加入能力を持っているかどうかを判断するには、温度と摂食が生殖出力に与える役割をよりよく理解する必要がある可能性があります。

繁殖出力と同様に、温度と摂食がサンゴの繁殖タイミングに及ぼす影響は、温暖化している海での加入成功のための重要な考慮事項であるにもかかわらず、非生物的/生物的条件との繁殖の同期が比較的研究されていないままです²⁹。実験室で実施されたサンゴの温熱調整研究では、気温の上昇が早期に繁殖することが示されており³⁰、これは季節をまたいで自然のサンゴ礁から採取されたサンゴでも観察されています³¹。しかし、興味深いことに、最近、その 場外 フロースルーシステムで1年間培養された給餌サンゴで逆の傾向が観察されました(つまり、繁殖は月の周期の早い時期に冬の気温が低く、月の周期の後半に暖かい夏の気温で起こりました)³²。この対照的な結果は、豊富なエネルギー資源に関連する条件下では、生殖のタイミングが典型的なパターンから外れている可能性があることを示唆しています。

異なる温度シナリオ下での長期対照実験は、強膜サンゴの繁殖に対する従属栄養の影響のより良い理解に貢献する可能性があります。しかし、複数の繁殖サイクルの間、生息域外条件下で繁殖するサンゴのコロニーを維持することは困難な場合があります(ただし、以前の研究^32,33を参照)。本明細書では、フロースルー養殖システムにおける繁殖サンゴ(Pocillopora acuta)の積極的給餌(食物源:Artemia nauplii)および長期養殖のための簡単で効果的な技術について説明します。しかし、記載されているすべての技術は、再循環水産養殖システムにも使用できることに注意する必要があります。これらの技術を実証するために、24°Cと28°Cで「給餌」および「非給餌」処理下で保持されたサンゴのコロニーの繁殖出力とタイミングの予備的な比較が行われました。これらの温度は、台湾南部の冬と夏の海水温をそれぞれ近似するために選択されました^30,34。高温を選択しなかったのは、熱ストレスに対するサンゴの応答をテストするのではなく、長期間の生息域外培養を促進することがこの実験の主な目的であったためです。さらに、給餌セッション前後のArtemia naupliiの密度を定量化し、両方の温度処理での従属栄養給餌の実現可能性を比較しました。

具体的には、台湾南部の国立海洋生物水族館の研究施設のフロースルータンクから、P. acuta(平均線伸び±標準偏差:21.3 cm ± 2.8 cm)のコロニーが得られた。Pocillopora acutaは、放送産卵と典型的には繁殖戦略の両方を持つ一般的なサンゴ種である^35,36。これらのサンゴの親コロニーは、約2年前に別の実験のためにアウトレットリーフ(東経21.931度、北緯120.745度)から採取されたものである³²。その結果、本実験で使用したサンゴのコロニーは、生息域外培養条件下で生涯にわたって飼育されていました。具体的には、コロニーを周囲温度に曝露し、250 μmol quanta m−2·s⁻¹で12時間:¹²時間の明暗サイクルに曝露し、週に2回Artemia naupliiを給餌した。この長期の生息域外培養は、この実験における処理条件に対するコロニーの反応に影響を与えた可能性があると認識しています。したがって、ここでの主な目的は、温度と摂食がサンゴの繁殖に及ぼす影響を評価した応用例を示すことにより、説明されている技術を効果的にサンゴの生息域外で養殖する方法を説明することであることを強調したいと思います。

サンゴのコロニーは、6つのフロースルーシステム培養タンク(タンク内部の長さ x 幅 x 高さ:175 cm x 62 cm x 72 cm、タンクライトレジーム:12時間:12時間、250 μmol量子^m-2·s-1での明暗サイクル)に均等に分布しました(図1A)。3つのタンクの温度は28°Cに設定され、他の3つのタンクの温度は24°Cに設定されました。各タンクには、10分ごとに温度を記録するロガーがありました(材料表を参照)。各タンクの温度はチラーとヒーターで独立して制御し、フローモーターで水の循環を維持しました(材料表参照)。各水槽の半数のコロニー(n = 2コロニー/水槽)には週に2回アルテミア・ノープリウス(Artemia nauplii)を給餌し、他のコロニーには給餌しなかった。各給餌セッションの所要時間は 4 時間で、2 つの独立した温度固有の給餌タンクで実施されました。給餌中、給餌されていないコロニーを含むすべてのコロニーを給餌タンクに移動し、タンク間でコロニーを移動することによる潜在的なストレス効果を標準化しました。給餌処理と非給餌処理のコロニーは、温度固有の給餌タンク内のメッシュフレームを使用して独自のコンパートメントに配置され、給餌条件のコロニーのみが餌を受け取るようにしました。サンゴの繁殖量とタイミングは、毎晩午前9:00に、一晩で幼生収集容器に放たれた幼生の数を数えることにより、各コロニーについて評価されました。

1.サンゴのコロニーをそのまま 飼育する水槽に吊り下げる

1. サンゴのコロニーを吊るす準備として、培養水槽を挟んでノッチバー(長さ×幅×高さ:75cm×1cm×3cm)を「吊り下げ棒」と呼ぶ。
   注:この実験で使用した吊り棒は特注品ですが、培養水槽の上部に安定して配置でき、サンゴを保持するのに十分な強度があれば、ネジが突き出た(つまりノッチとして機能する)単純な塩ビパイプで十分です。
2. 釣り糸( 材料表を参照)の長さを~1.5mに測定し、半分に2回折ります。
   注:釣り糸の初期の長さは、培養水槽内のサンゴコロニーの望ましい最終位置に基づいて選択する必要があります。
3. 釣り糸の最初の端がある折りたたまれた釣り糸の端に小さなオーバーハンドノットを作ります。
   注意: 結び目を作成した後、下部に2つの大きなループ、上部に1つの小さなループがあるはずです。
4. サンゴのコロニーを2つの大きなループの真ん中に置き、ループがコロニーの周りに配置され、サンゴを水中に吊るしたときにサンゴをしっかりと保持できるようにします。
5. 釣り糸の小さなトップループを吊り下げバーの切り欠きに引っ掛けます(図1B)。

2.サンゴの餌やり

1. 給餌容器の作り方
   1. アクリルパイプ(縦×横×高さ:25cm×60cm×25cm)で長方形のフレームを作ります。餌を与えられたサンゴと給餌されていないサンゴをそれぞれ配置できるフレームに2つの別々のコンパートメントを作ります(図1C)。
      注:アクリルパイプを使用したのは、軽量(つまり、重いPVCパイプとは対照的に)であるため、培養タンクへの供給容器の出し入れを容易にするためです。
   2. ホットグルーガンを使用して、100μmのプランクトンメッシュをフレームの底と側面に接着します。
   3. 合計~10個の小さな穴(直径0.5cm)をパイプ(特にフレームの側面と底面に沿って)開けて、培養タンクに置いたときに供給容器が浮かばないようにします。
   4. 給餌容器の各コーナーにあるプランクトンメッシュに穴(直径~0.5cm)を開けます。
   5. 長さ8cm、直径0.5cmのチューブを角の穴に通し、ホットグルーガンを使用して所定の位置に固定します。
      注意: これらのチューブは、給餌中にエアポンプとバブルストーンに接続されます(詳細については、手順2.3.2を参照してください)。
2. アルテミア 栽培
   1. 独立した給餌タンクから2Lの海水を採取し、 アルテミア の孵化容器に海水を注ぎます(図1D)。
      注:プロトコルを実証するために使用した本実験では、2つの独立した処理固有の給餌タンクが使用されたため、 アルテミア 培養用の2つの孵化容器を準備する必要がありました。
   2. アルテミア嚢胞を追加する前に、孵化容器の底に接続されたチューブにエアポンプを約10分間接続します。
   3. 待っている間、天びんを使用して8 gの アルテミア 嚢胞を測定します( 材料表を参照)。
      注:Huangらが提案しているように、35個のアル テ ミア・ノープリウス/mLの平均密度を得るには¹⁹、アル テミア 嚢胞4gと海水1Lの比率を使用します。
   4. 10分後、8gの アルテミア 嚢胞を孵化容器に注ぎます。
   5. アルテミア嚢胞を48時間インキュベートします。
3. 給餌タンクの準備
   1. 容器の上部が水面より上になるように、給餌容器を給餌タンクに入れます。
   2. 給餌容器のコーナーチューブの外側部分をエアポンプに接続すると、給餌中の水循環を容易にするためにバブルストーンに空気が供給されます。
   3. 給餌開始の~5分前にエアポンプをオンにします。
4. Artemia naupliiの濃縮とコレクション
   1. 1.5 mLの濃縮飼料( 材料表を参照)を、希望の給餌時間の2時間前に孵化容器に加えます。
      注:Huang et ^al.19は、0.75 mLの濃縮食と1 Lの海水の比率を推奨しています。
   2. 2時間後、ハッチングコンテナに空気を供給するバルブをオフにします。
   3. 孵化容器を段ボール箱で覆って周囲光を排除し、孵化容器の底に光源(携帯電話の懐中電灯で十分)を5分間置いて、アルテミア・ノープリウスを容器の底に引き付け、それによって生きているアルテミア・ノープリウスを空の殻から分離しやすくします。
   4. 5分後、ボックスと光源を取り外します。
   5. ハッチングコンテナの下に3Lの計量水差しを置きます。
   6. 孵化容器からチューブを取り外して、 アルテミア ノープリウスと海水溶液が計量水差しに流れ込むようにします。 1Lのアルテミア ・ナウプリと海水溶液を採取します。
      注: 不要な空のシェルを除外するために、ハッチング コンテナの体積の半分だけを収集します。
   7. 給餌タンクのすぐ近くに立って、 アルテミア ノープリウスと海水溶液を100μmのストレーナーに注ぎ、 アルテミア ノープリウス(ストレーナに残る)を海水から分離します。
   8. ストレーナー内に保持されている Artemia naupliiを、給餌タンクの水で2回すすぎます。
   9. これで、Artemia nauplii を使用する準備が整いました。
5. サンゴのコロニーに餌をやる
   1. 手順2.4.8のストレーナーを給餌タンクに入れて 、Artemia naupliiを降ろします。
   2. タンク内の水を手でかき混ぜて、 アルテミア ノープリウスを均等に分配します。
      注:このステップの後、 アルテミア ノープリウス密度の「給餌前」定量化のためにサンプルを収集します(詳細については、ステップ3.1を参照してください)。
   3. 各吊り下げバー(サンゴのコロニーがバーからぶら下がったまま)を培養タンクから給餌タンクに移動し、給餌タンクの上部にしっかりと固定されるようにバーを配置します。サンゴが空気にさらされる時間は、できるだけ短くする必要があります。
      注:コロニーが互いに接触していないこと、および餌を捕獲するのに十分なスペースがあることを確認してください(たとえば、~5 cm離れています)。
   4. 給餌中の光の乱れを避けるために、給餌タンクのライトを消すか、非気密の蓋を使用して給餌タンクを覆ってください。
   5. コロニーが4時間邪魔されずに餌を食べるのを許します。
   6. 4時間後、 アルテミア ノープリウス密度の「給餌後」定量化のためにサンプルを採取します(詳細については、ステップ3.1を参照してください)。
6. 給餌後の後片付け
   1. 給餌セッションが完了したら、サンゴのコロニーを取り除きます。給餌タンクから吊り下げバーを個別に取り出し、それぞれの培養タンクからの海水で各サンゴを完全にすすぎ、残っている アルテミア ノープリウスを取り除きます。
      注意: すすぎ中にコロニーが前後に揺れた場合に発生する可能性のある損傷のリスクを減らすために、ぶら下がっている間ではなく、安定した表面でコロニーをすすぎます。最初の移動に従って、サンゴが空気にさらされる期間をできるだけ短くしてください。
   2. 吊り下げバー(サンゴを吊るした状態)を培養水槽に戻します。
   3. 給餌容器とエアポンプを接続しているチューブを取り外し、給餌容器を給餌タンクから取り外します。
   4. 給餌容器を真水で完全にすすぎ、残っているアル テミア ノープリウスをすべて取り除きます。

3. 給餌前後の アルテミア ・ノープリウス密度の定量化

1. サンプルの収集
   1. サンプルを採取するには、 Artemia naupliiを降ろして給餌容器に均等に分散させたとき(ステップ2.5.2)、給餌セッションが完了した後(ステップ2.5.6)の2つの時点でサンプルを採取します。
   2. 各時点について、3本のシリンジを使用して、供給容器の表面、中間層、および最下層からそれぞれ20 mLの水を汲み上げます。
2. サンプル希釈
   1. 各シリンジについて、20 mLの水サンプルを独立した500 mLビーカーに移します。
   2. ビーカーに180 mLのお湯(~60°C)を加えます(1:10に希釈)。
      注:お湯は、列挙の精度を高めるために Artemia naupliiを固定化するために使用されます。
   3. ビーカーから採取した水サンプル2 mLを9ウェルプレートの各ウェルに加えます。
      注:ビーカーでサンプルを混合して、2 mLのサンプルを採取する前に、 Artemia naupliiを水柱に均等に分散させます。
   4. 6.5倍の倍率を使用して、実体顕微鏡下で各ウェル内の Artemia naupliiの数を数えます( 材料表を参照)。
3. Artemia naupliiの密度の計算
   1. 各ウェル内の Artemia nauplii の数を 2 で割って、mL あたりの Artemia nauplii の数を求めます。次に、その数値に10を掛けて(希釈を考慮して)、 アルテミア ノープリの密度を計算します。
   2. Artemia nauplii の平均密度 (つまり、給餌前と給餌後の 27 ウェルの反復の平均密度) を計算して、給餌前と給餌後の Artemia nauplii 密度を比較します。

4.サンゴの幼生の収集

1. 幼虫採集容器の作り方(図1E)
   1. 6Lのペットボトルを選択し、ボトルの底を完全に切り取ります。
      注:この開口部は、幼虫収集容器にコロニーを出し入れするために使用されます。
   2. ボトルの両側から~15 cm x 20 cmの長方形を切り取って、2つの窓を作成します。
      注:直径~15cmのサンゴには、6Lのペットボトルが適しています。調査対象のサンゴのサイズに基づいてボトルのサイズを変更します。
   3. ホットグルーガンを使用し、次にエポキシを使用して、100μmのプランクトンメッシュを各窓に接着します。
   4. ボトルの底の両側に2つの小さな穴(直径~0.5cm)を作ります。
   5. 2つの小さな穴に紐を通し、両端を結んで、幼虫の収集容器を吊り下げバーに引っ掛けるためのハンドルを作成します。
   6. 最初に使用する前に、ボトルをフロースルータンク(サンゴなし)に少なくとも24時間入れて、接着剤の残留物を取り除きます。
2. 珊瑚採集の準備
   1. 幼虫の収集容器を培養タンクに完全に浸します。
   2. コロニーと容器の両方を水に浸したまま、コロニーを幼虫収集容器に入れます。
   3. 幼虫収集容器のハンドルを吊り下げバーに引っ掛けます。
      注意: 吊るした後は、収集容器の上部が水面から~3cm上にあることを確認してください。
   4. すべてのコロニーが幼虫収集容器に入るまで、手順4.2.1〜4.2.3を繰り返します。
3. サンゴの幼生の収集と列挙
   1. 3Lの計量水差し、ボウル、3mLのピペット、50mLのチューブを用意します。
   2. 吊り下げバーから釣り糸を外し、幼虫の収集容器から1つのコロニーを取り出します。コロニーをすぐに培養タンクに戻します。
      注意: 空気に触れる時間はできるだけ短くしてください。
   3. 幼虫収集容器のキャップの端に片手を置きます。
      注意: 幼虫の収集容器が水で満たされていると、重くなることがあります。適切なサポートがないと、容器を水から取り出すときに破損する可能性があります。
   4. 幼虫収集容器の「ハンドル」を吊り下げバーから外します。
   5. 幼虫収集容器をゆっくりと水から持ち上げます。
   6. 収集容器を培養タンクから約45°の角度で数秒間保持し、幼虫収集容器の窓 から 余分な水がタンクに逆流できるようにします。
      注意: 容器の上部から幼虫を注ぐ可能性を軽減するために、容器を45°以上に傾けないでください。
   7. 幼虫収集容器をタンクから取り出し、計量水差しの上に置きます。
   8. キャップを緩める前に、1本の指でキャップに適度な圧力をかけてから、キャップを緩めます。
      注意: 収集容器内の水は、最初に指で支えられていない場合、キャップを取り外すとすぐに放出される可能性があります(つまり、幼虫が失われる可能性があります)。
   9. 計量水差しの中の水の一部をボウルに移します。
   10. 3 mLのピペットを使用して幼虫を50 mLのチューブに移し、ボウル内の幼虫の数を手動で数えます。
       注意: 一部の幼虫がピペット内に詰まる可能性があることに注意してください。その場合は、ピペットに海水を吸い込み、指一本でピペットを密封しながら軽く振って幼虫をほぐしてください。
   11. すべての幼虫が数えられるまで、ステップ4.3.9とステップ4.3.10を続けます。この段階で、幼虫はその後の実験で使用することができます。
   12. 他のすべてのサンゴのコロニーについて、手順4.3.2〜4.3.10を繰り返します。
       注意: 計量水差しとボウルはコロニー間ですすぐ必要があります。
   13. カウントが終了したら、各収集容器、特に窓を真水で完全にすすいでください。

記載されたプロトコルにより、(1)異なる給餌と温度処理の間での個々のサンゴコロニーの繁殖出力とタイミングの比較、および(2)異なる温度での アルテミア ノープリウス給餌の実現可能性の評価が可能になりました。ここでは、調査結果の概要が示されていますが、この実験の短期的な性質(つまり、1つの繁殖サイクルのみ)と、 生息域外 条件に順応したサンゴコロニーの使用のために、報告された温度と摂食がサンゴの繁殖に及ぼす影響を広く解釈することに関しては注意が必要です。

各コロニーはモニタリング期間(2022年9月)に繁殖し、月間総繁殖量はコロニー間で大きなばらつきを示しました。コロニーによって放出された幼虫の総数は、528匹の幼虫を産んだ1つのコロニー(無給餌24°C処理)を除いて、6〜319匹の範囲でした。すべてのコロニーのデータを図2に示しますが、高生産の外れ値コロニーはデータ分析に含まれていません。生殖出力は、温度(一般化線形混合効果モデル;z = 5.35、p < 0.001)および摂食(z = 3.01、p < 0.003)の影響を受け、温度と摂食処理(z = 12.22、 p < 0.001)の間に有意な 交互作用が認められた。28°Cで培養したコロニーは、給餌時(131±133)よりも給餌なし(平均±標準偏差;151±82)でより多くの幼虫を放出したが(一般化線形混合効果モデル、事後対照;z = 3.01、p = 0.014)、24°Cで培養したコロニーでは逆の傾向が見られ、給餌コロニー(80 ± 78)は給餌されていないコロニー(12 ± 6)よりも多くの幼虫を産んだ(z = 11.91, p < 0.001)。

すべてのコロニーで繁殖は、満月(旧暦15日目)の前に行われました(図3)。幼虫の放流の平均月日(MLD)は、月の6.5日から11.1の日の範囲であり、月周期の早い時期に繁殖した「給餌されていない28°C」のコロニーと、月の周期の後半に繁殖した「給餌24°C」のコロニーの間でのみ、処理の間に有意差が検出されました(線形混合効果モデル、 事後対照、t = 4.10、 p = 0.006)。

正式な繁殖モニタリングの前月(2022年8月)に、アルテミアノープリウスの密度が給餌セッションの前後に評価されました。これは、この実験のサンゴ養殖の開始時(T0)と、処理条件下でのサンゴ養殖の2週間後と4週間の3つの時点で繰り返されました(図4)。T0での初期評価では、両方の温度処理でアルテミア・ナウプリイの給餌前と給餌後の密度に差は見られませんでした。培養開始から2週間後と4週間後、両方の温度処理で給餌した後、アルテミアノープリウス密度は低かった(2週目:二元配置ANOVA、F 1,104 = 128.45、p < 0.001;4週目:二元配置ANOVA、F1,104 = 294.71、p < 0.001)。 評価した3つの時点のいずれにおいても、温度処理間の給餌前密度(p > 0.05)または温度処理間の給餌後密度(p > 0.05)に差はなかった。

すべての分析は、パッケージlme437、lmerTest38、emmeans39、car40、およびHmisc41を使用してRで実行されました。分析に使用されるデータと R スクリプトは、GitHub (https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission) で公開されています。

図1:陰気な強膜サンゴの摂食と生息域外培養の実験計画と代表的な材料の概略図。 (A)Pocillopora acutaのコロニーを、24°Cまたは28°Cのフロースルー養殖水槽で、給餌および非給餌条件下で培養した。黒い円はコロニーを表しています。(B)コロニーには釣り糸を吊るし、取り扱いのストレスを軽減し、培養水槽と給餌水槽の間の効率的な移動を促進しました。(C)給餌セッション中、すべてのコロニーを温度固有の給餌タンク内のメッシュフレームに移動させました。給餌コロニーはフレームの一方の区画に配置され、給餌されていないコロニーはフレームのもう一方の区画に配置されました。餌を与えられたコロニーだけに食料が与えられた。(D)エンリッチメントアルテミア・ノープリウスは、週に2回、給餌処理でコロニーに投与された。(E)コロニーを幼虫の収集容器に一晩入れ、月の1周期にわたって毎日の繁殖出力を定量化しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:異なる温度(24°C対28°C)および給餌処理(給餌と非給餌)下での Pocillopora acuta コロニーの繁殖出力。 これらの文字は、治療間の生殖出力の有意差を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:異なる温度(24°C対28°C)および給餌処理(給餌と非給餌)下でのPocillopora acutaコロニーの繁殖時期。 縦の破線は、各処理の平均生殖日(MLD)を示しています。治療特異的プロット(A-D)の各バー内の色調は、毎日の総繁殖に対する個々のコロニーの寄与を示しています。これらの文字は、治療による生殖のタイミングの大きな違いを表しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:24°Cおよび28°Cの温度処理におけるサンゴの給餌セッション前後の アルテミア ・ノープリウスの密度。 給餌前の密度はサンゴの給餌前に計算され、給餌後の密度は4時間のサンゴの給餌セッションの完了後に計算されました。 アルテミア ・ノープリウスの密度は、サンゴ養殖の開始時(T0)に評価され、その後、フロースルー養殖システムでの処理条件下で2週間後と4週間後に評価されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。