がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング

膜輸送タンパク質は、細胞間のコミュニケーションや細胞の恒常性の維持に不可欠です。膜輸送タンパク質の中で、イオンチャネルは細胞の成長と発達を促進し、困難で変化する環境で細胞の状態を維持するのに役立ちます。イオンチャネルは、全身および中枢神経系(CNS)の両方で固形腫瘍の発生を促進し、サポートすることも報告されています^1,2。例えば、KCa3.1チャネルは、膜電位の調節と細胞周期の調節に重要な細胞体積の制御に関与しています。欠陥のあるKCa3.1チャネルは、腫瘍細胞の異常な増殖に寄与することが報告されています³。さらに、イオンチャネルは癌の転移性播種に寄与し得る。一過性受容器電位(TRP)チャネルは、例えば、^Ca2+および^Mg2+流入に関与している。この流入は、腫瘍を取り囲む細胞外マトリックスを調節するように機能するいくつかのキナーゼとヒートショックタンパク質を活性化し、これは癌転移の開始に重要です⁴。

イオンチャネルはがんの発症に寄与する可能性があるため、薬物関連のがん治療の標的にもなり得る。例えば、化学療法および新規免疫療法を含む治療法に対する耐性は、イオンチャネル機能調節不全に関連している^5,6,7。さらに、イオンチャネルは、がんの成長と発生を妨げる重要な創薬標的として浮上しており、再利用された低分子(FDA承認)薬や、モノクローナル抗体を含む生体高分子が検討されています1,2,8,9。この面では多くの進歩がありましたが、イオンチャネルがんの創薬は未発達のままです。これは、がん細胞のイオンチャネルを研究するという独特の課題に一部起因しています。例えば、遅効性化合物の電気生理学アッセイの設定には技術的な限界があり、チャネル活性化と薬物作用の時間的な違いがあります。さらに、今日一般的に使用されている自動電気生理学システムのほとんどは疎水性基質を利用しているため、化合物の溶解性も進行を妨げる可能性があり、化合物吸着の結果としてアーティファクトに寄与する可能性があります。さらに、天然物、ペプチド、モノクローナル抗体などの大規模な生物有機分子治療薬は、従来の電気生理学アッセイ¹⁰を使用してスクリーニングすることが技術的に困難です。最後に、がん細胞の生体電気的特性はよくわかっていません¹¹。

一方、イオンチャネルの免疫蛍光染色はしばしば困難です。これは、部分的には、それらの構造の複雑さと膜内のコンテキストによるものであり、顕微鏡研究のための抗体の生成と使用の両方の能力に影響を与えます。イオンチャネルの染色に使用される抗体が、特異性、親和性、再現性について検証されていることが特に重要です。イオンチャネル用の市販抗体は、その検証戦略と発表記録に基づいて検討する必要があります。実験には、標的タンパク質のノックダウンまたはノックアウトのいずれかによる非特異的結合の欠如を実証するためのネガティブコントロールを含める必要があります。あるいは、標的タンパク質が存在しない、またはmRNAまたはタンパク質の決定に基づいて存在量が少ない細胞株は、ネガティブコントロールとして役立ち得る。例えば、この研究は、髄芽腫細胞株(D283)における(GABA)受容体サブユニットGabra5の局在を示す。siRNAノックダウンを有するD283細胞および別の小脳髄芽腫細胞株であるDaoy細胞をGabra5について染色したが、認識可能な染色は示されなかった(データ示さず)。

ここでは、イオンチャネル機能、ならびに癌細胞に対するイオンチャネルモジュレーターの効果を分析およびアッセイするための方法が提示される。(1)イオンチャネルの細胞の染色、(2)ミトコンドリアの分極状態の検査、(3)電気生理学を用いたイオンチャネル機能の確立、および(4)in vitro薬物検証のためのプロトコルが提供されています。これらのプロトコルは、A型ガンマアミノ酪酸(_GABAA)受容体2,12,13,14,15,16、塩化物アニオンチャネルおよび主要な抑制性神経伝達物質受容体の研究を強調しています。ただし、ここで紹介する方法は、他の多くの癌細胞やイオンチャネルの研究に適用されます。

1. 培養細胞における免疫標識イオンチャネル

1. 細胞の準備と実験のセットアップ
   1. 細胞を75cm2の培養フラスコで活発に増殖する培養物として維持する。使用する細胞株の倍加時間に応じて、細胞が50%〜90%コンフルエントになるまで細胞を1回継代します。
      注:本研究では、グループ3髄芽腫細胞株であるD283細胞を使用しました。
   2. 培養フラスコから細胞を遠沈管(15 mLまたは50 mL)に回収し、2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えて接着細胞を剥離します。室温(RT)で5分間インキュベートします。5分後、フラスコを3〜5回叩いて細胞を剥離させます。細胞を10%FBSを含む10 mLの培地に集めて、トリプシンの作用を停止させます。
   3. 480 x g でRTで5分間遠心分離します。 培地を穏やかに吸引します。細胞ペレットを乱さないでください。
   4. 培養の密度に応じて、細胞を5 mLから10 mLの培地に再懸濁します。
      注:密度は活発に増殖する細胞と一致していなければならず、フラスコ内の細胞のコンフルエントに依存します。目視評価は、最適な細胞密度を概算するために使用する必要があります。具体的には、細胞は40%〜90%のコンフルエントで、均等に分布している必要があります。
   5. 100 μLの細胞を除去し、100 μLの0.4%トリパンブルーを含む1.5 mLチューブに加えて、生存細胞をマークします。細胞株に応じて、RTで5〜15分間インキュベートします。
   6. 10 μLの溶液中の血球計算盤( 材料表を参照)を使用して手動で細胞をカウントします。血球計算盤の16個の正方形の四隅のそれぞれにある生きた染色されていない細胞を数えます。平均細胞数に希釈係数を掛け、10,000を掛けて、ミリリットルあたりの細胞数(細胞/ mL)を求めます。あるいは、自動セルカウンターを使用することができる。
   7. 細胞を1 x 10⁵ 細胞/mLに希釈し、各細胞株に指定された培地に入れます。シード1。製造元の指示に従って、0.1 mg/mL ポリ-D-リジンでプレコートされた 22 mm x 22 mm のカバーガラスを含む 6 ウェルプレートの各ウェルに 8 mL の細胞を挿入します ( 材料表を参照)。
      注:細胞株特異的な嗜好の報告があるため、ポリ-D-リジンとポリ-L-リジンの両方の使用をテストすることをお勧めします^17,18。一部の細胞株にはポリ-L-リジンを分解できるプロテアーゼがありますが、一部の細胞株にはポリ-D-リジンが有毒であるという報告があります。対照的に、PC12などの神経細胞は、ポリ-D-リジン表面上でより健康であることが報告されています。
   8. 加湿した5%_CO2 環境のインキュベーターで37°Cで一晩細胞を増殖させ、細胞がカバーガラスに付着できるようにします。倒立顕微鏡で20倍の対物レンズで細胞の付着を調べます。
      注:治療または直接免疫染色の前に、細胞をカバーガラスに完全に付着させる必要があります。このとき、濃縮ストック(例えば、600μLの4xストック溶液)を添加するか、または所望の1x濃度の薬物を含有する新鮮な培地で培地を交換することによって、細胞を薬物(またはビヒクルコントロール)で処理することができる。その後、細胞をさらに48時間インキュベーターに戻すことができます。溶媒処理細胞は、標的分子のレベルおよび局在に対する薬物の効果を評価するために含まれる。本研究では、D283細胞を_{GABAA受容体} 陽性アロステリックモジュレーターQH-II-066¹⁴ ( 材料表を参照)の600 μLの3.2 μM溶液で48時間処理しました。対照細胞を等量のDMSOで処理した。
2. 免疫標識の準備:固定、透過処理、およびブロッキング
   1. 細胞を2.5 mLの1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、2 mM KH₂PO₄、材料表を参照)で洗い流し、直ちに溶液を吸引します。
   2. 1 mLの4%PFAを1x PBS中でRTで1時間使用して細胞を固定します。
      注:4%PFAは免疫染色の標準的な固定液ですが、グルタルアルデヒドまたはグリオキサールを使用して免疫蛍光用の膜タンパク質を固定することもできます。氷冷メタノールでの処理などのアルコールベースの固定法は、保存状態の低下や膜タンパク質の損失につながる可能性があります^19,20。
   3. 2.0 mLの1x PBSで6回洗浄します(1回の洗浄で5分)シェーカーで攪拌します。一次抗体の宿主種と一致する0.8%Triton X-100および10%正常血清を含む1x PBSからなるブロッキングバッファー中でRTで1時間インキュベートします(または、通常の血清の代わりに3%BSAまたはウシ血清画分Vアルブミンを使用できます)。
      注: この手順は、非特定の結合をブロックするために使用されます。
3. 免疫標識
   注:蛍光色素に結合した抗体を添加した後は、光退色を防ぐためにすぐに測定を行う必要があります。標識抗体とのインキュベーションは、光から保護する必要があります。フリーラジカルを除去する薬剤を含む封入剤を使用すると、光退色が減少します。カバーガラスを密封した後、スライドを遮光性のある不透明な容器(4°C)に保管します。イメージング時には、励起照明の強度と露光時間を制限することにより、光退色を最小限に抑えることができます。
   1. 150 mm培養皿の底をろ紙で裏打ちして加湿チャンバーを準備します。ろ紙を滅菌蒸留水で湿らせます。ろ紙の上に収まるようにカットしたラボフィルムに3 x 2のグリッドを描き、6ウェルプレートのカバーガラスの向きを保つようにラベルを付けます。実験室用フィルムをろ紙の上に置き、上端と下端を露出させてチャンバーを加湿します。
   2. カバーガラスあたり100 μLの一次抗体を3%BSAを含む1x PBSで希釈して調製します。 GABRA 遺伝子タンパク質産物を検出するには、ウサギ組換えモノクローナル一次抗体を1:200に希釈して使用します(Gabra5抗体、中間領域; 材料表を参照)。
      注:バックグラウンドで最適なシグナルを生成する一次抗体濃度を経験的に決定するには、二次濃度を一定に保ちながら、一次抗体の希釈系列を使用します。最適な一次抗体濃度を確立するには、1:100、1:250、1:500、1:750、および1:1,000の希釈が推奨されます。
   3. カバーガラスを6ウェルプレートのブロック溶液からラボフィルムに描かれたグリッド上の適切な位置に移します。6ウェルプレートからブロック溶液を廃棄し、洗浄ステップのためにプレートを保持します。
   4. 希釈した一次抗体100 μLを各カバーガラスの中央に慎重に加えます。カバーガラスの端に溶液を置かないでください。RTで1時間インキュベートします。
   5. 2.5 mLの1x PBSを6ウェルプレートの各ウェルに加えます。カバーガラスを6ウェルプレートの適切な位置に戻します。
   6. 2.5 mLの1x PBSでそれぞれ5分間6回の洗浄を行います。
      注意: すすぎ手順中にカバーガラスを乾燥させないでください。これは、バックグラウンド蛍光シグナルの原因となる可能性があるためです。
   7. カバーガラスを実験室用フィルムの適切な場所に戻します。各カバーガラスに、1x PBS + 1%-5% BSAで希釈した二次抗体100 μLを追加します。
      注:最初に、Alexa Fluor 488( 材料表を参照)に結合した二次抗体は、1x PBS + 3% BSAで1:1,000希釈して使用します。二次抗体濃度は、必要に応じて、濃度を上げて存在量の少ない標的タンパク質を検出するか、濃度を下げてバックグラウンドを減らすことで最適化できます。
   8. 残りのステップでは、光曝露を最小限に抑えて、結合した二次抗体のフォトブリーチングを防ぎます。培養皿をアルミホイルで覆い、RTで1時間インキュベートする。
   9. カバーガラスを6ウェルプレートに戻します。シェーカーを使用して、2.5 mLの1x PBSでそれぞれ5分間6回の洗浄を行います。プレートをシンクまたは廃棄物容器の上にひっくり返して、PBSを取り外します。最後の洗浄後、カバーガラスの取り外しを容易にするためにPBSをウェルに入れたままにします。
   10. 各カバーガラスの顕微鏡スライドにラベルを付けます。スライドの中央に、DAPI(核を染色するため)を含むグリセロール含有封入剤を滴下します( 材料表を参照)。
   11. 鉗子を使用して、カバーガラスをウェルから取り外し、スライドの中央にある封入剤の滴の上にそっと置きます。
       注意: 封入剤に気泡が形成されないようにしてください。
   12. 小さなろ紙を使用して、余分な封入剤を取り除きます。カバーガラスの端をマニキュアでシールし、ポリッシュを完全に乾かしてからイメージングします。スライドガラスを4°Cで不透明なプラスチックの箱に保管します。
4. イメージングと分析
   1. 液浸油を使用した40倍対物レンズ下で蛍光顕微鏡で画像を取得します( 材料表を参照)。
   2. 適切なフィルターで蛍光画像を視覚化します。
   3. 注:Alexa Fluor 488の場合は、496 nm / 519 nmの励起/発光を使用します。DAPIの場合、358 nm/461 nmの励起/発光を使用します。
   4. デジタル画像ファイルをキャプチャして保存します。4 x 4 のビニング値は、画像収集率を容易にし、背景を減らすために使用されます。
   5. 最終的なイメージを準備します。画像は、ImageJまたは市販のソフトウェアで処理することができます。結果を 図1に示す。

2.ミトコンドリアの分極状態をテストする

注:このプロトコルは、TMRE(テトラメチルローダミン、エチルエステル)アッセイを利用して、活性ミトコンドリアの膜電位を標識し、負電荷を維持します^21,22。TMREは、細胞透過性の赤橙色の正電荷色素で、相対的な負電荷のために活性ミトコンドリアに蓄積します。不活性または脱分極したミトコンドリアは、膜電位を低下させ、TMREを比例的に隔離することができません。酸化的リン酸化(OXPHOS)のイオノフォア脱共役剤であるFCCP(カルボニルシアニド4-[トリフルオロメトキシ]フェニルヒドラゾン)は、ミトコンドリア膜を脱分極し、TMRE²³の蓄積と隔離を防ぎます。これを図 2 に示します。

1. 細胞の準備と実験のセットアップ
   1. 細胞を75cm2の培養フラスコに維持する。培養液を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSで細胞をすすぎます。
   2. 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えて、接着細胞を剥離します。RTで5分間インキュベートし、細胞を10 mLの培地に再懸濁します。
   3. 培養フラスコから細胞を15 mL遠沈管に回収します。480 x g でRTで5分間遠心分離します。 培地を吸引します。
   4. 細胞を5 mL〜10 mLの培地に再懸濁し、培養物の元のコンフルエント性に応じて、細胞濃度が血球計算盤で1平方あたり50〜100細胞になるようにします。必要に応じて容量を調整し、正確なカウントに必要なセル密度を確保します。
   5. 100 μLの細胞を除去し、100 μLの0.4%トリパンブルーを含む1.5 mLチューブに追加します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。細胞をフェノールレッドを含まない培地で3 x 10⁴ 細胞/mLに希釈します。
      注:フェノールレッドを欠くDMEM培地は、フェノールレッド曝露が膜透過性を阻害し、バックグラウンド自己蛍光に寄与する可能性があるため使用されます。
   6. ウェルあたり2.5 mLの細胞懸濁液(75,000細胞)を、製造元の指示に従ってポリ-D-リジンでプレコートされた22 x 22 mmのカバースリップを含む6ウェルプレートにシードします( 材料表を参照)。
   7. 加湿した5%_CO2 インキュベーターで37°Cで一晩細胞を増殖させ、細胞がカバーガラスに付着できるようにします。
   8. 倒立顕微鏡下で20倍の対物レンズで細胞の付着を調べます。先に進む前に、セルをカバーガラスに完全に取り付ける必要があります。
2. 原液の調製
   1. TMRE (MW = 514.96 g/mol) の 1 mM ストック溶液 (1,000x) を調製するには ( 材料表を参照)、1 mg の TMRE を 1.94 mL の DMSO に溶解します。分注し、光から保護された-20°Cで保存します。凍結/解凍サイクルの繰り返しは避けてください。
   2. FCCP (MW = 254.17 g/mol) (ミトコンドリア酸化的リン酸化脱共役剤)の 50 mM (2,500 倍) ストック溶液を調製するには、10 mg の FCCP を 786.9 μL の DMSO に溶解します。分注し、光から保護された-20°Cで保存します。凍結/解凍サイクルの繰り返しは避けてください。
   3. 注:調製されたストック溶液は、TMREミトコンドリア膜電位アッセイキットの一部です( 材料表を参照)。
3. 細胞株のTMRE濃度の確立
   1. 細胞培養培地で500 nMのTMRE溶液を調製します。作業溶液を光から保護します。
   2. 培地中でカバーガラス上で増殖した細胞にTMREを添加し、最終濃度が50〜200 nMの範囲になるようにします。これを行うには、まず培養液を吸引し、TMREを含む培養液と交換します。
   3. 37°Cで20分間インキュベートします。 細胞はライブで見られるため、イメージングを可能にするために治療時間をずらすようにしてください。
   4. 細胞を1x PBSで2回洗浄し、最終TMRE濃度で標識された顕微鏡スライド上でカバーガラスを反転させます。
   5. 生細胞を直ちにイメージングします(ピークE_x / E_m = 549 nm/575 nm)。
      注:細胞が培地から取り出されて顕微鏡スライドに置かれるとミトコンドリアの健康が損なわれるため、培養条件から取り出したサンプルをすぐに画像化してください。カバーガラスの代わりに、ガラス底皿で細胞をイメージングすることができます。
   6. 利用可能な顕微鏡とソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。
      注:TMRE濃度最適化プロセス中に実験顕微鏡イメージングパラメータを確立し、その後の実験で同じ条件を維持して、正確なデータ比較を保証します。プロトコルの詳細は、共焦点顕微鏡と互換性のあるソフトウェアを採用しました( 材料表を参照)。
   7. 細胞株に依存する最適なTMRE濃度を選択します。
      注:ミトコンドリアTMREレベルの変化を解消するための最良のシグナルを提供するTMRE濃度は、一般に最も低いTMRE濃度であり、均一で容易に検出可能な蛍光シグナルを提供します。
4. 細胞の偏光状態のテスト
   1. アッセイ調製
      1. 処理原液を所望の濃度で調製し、アッセイする最終化合物濃度の培地を調製します。FCCPの場合、ストック溶液は20 mMである必要があります(50 mMストック溶液からDMSOで調製)。
      2. 一度に1枚のカバーガラスに取り組み、1.8 mLの培地と試験化合物を細胞に加えます。
      3. 細胞を試験化合物とともに、加湿環境下で37°Cおよび5%_CO2 で所望の期間インキュベートします。
         注:治療時間は、試験化合物がミトコンドリア膜電位を変化させるメカニズムによって異なります。ミトコンドリア膜電位を迅速かつ直接的に脱分極させるFCCPのような強力なプロトノフォアは、処理後すぐに(数分以内に)分析する必要があります。対照的に、タンパク質の活性化や代謝回転を変化させる、タンパク質合成を必要とするなど、ミトコンドリアの電子伝達連鎖機能に間接的に影響を与える化合物による治療効果は、効果を示すまでに時間がかかる場合があります。
      4. インキュベーション中に、顕微鏡の電源を入れ、ゲイン、レーザー強度、画像キャプチャレート、平均化、露光時間など、所定の最適なイメージングパラメータに設定します。
      5. 薬物処理期間の後、200 μLの10x TMRE(上記で決定した最適濃度)をコントロール細胞および薬物処理細胞に加えます。
      6. 加湿環境下で5%_CO2 中で37°Cで15〜30分間インキュベートします。培地を穏やかに吸引し、細胞を1x PBSで1回すすぎます。
      7. 細胞培養培地または処理化合物によって引き起こされるバックグラウンドを避けるために、1x PBSリンスステップを繰り返し、処理条件でラベル付けされた顕微鏡スライド上でカバーガラスを反転させます。
      8. 画像:細胞はE_x / E_m = 549 nm / 575 nmで生きています。共焦点顕微鏡を使用して、細胞の完全性が失われる前に、高速画像キャプチャ(512 ピクセル x 512 ピクセル、平均 = 4)でいくつかのzスタックフィールドを収集します。
      9. 分析用に画像ファイルを保存して保存します。この手順を次の実験条件に対して繰り返す。
   2. 実験的コントロール
      1. 培地中に試験化合物を欠いている上記(ステップ3.1.1-3.1.8)のように実施された無処理(陰性)コントロールを使用する。
      2. プロトノフォア化合物FCCPからなるミトコンドリア膜電位破壊(ポジティブ)コントロールを使用する。培地中の1.8 mLの20 μM FCCP( 材料表を参照)を細胞に加えます。上記のように(ステップ3.1.1-3.1.2;およびステップ3.1.3-3.1.8で概説した細胞イメージング)、TMREで染色する前に、加湿環境下で5%_CO2 中で37°Cで10分間インキュベートします。
         注:これらの実験には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方が必要です。
   3. 定量化
      1. 各zスタックの中央領域からの単一の代表画像から個々のセルのキャプチャされたピクセル強度を測定します。この作業では、分析を容易にするために単一の焦点面が選択されました。
      2. 処理ごとに少なくとも30個の細胞(全体)のピクセル強度を分析します。ExcelまたはPrismを使用して、各処理のピクセル強度を平均し、平均の標準誤差とともに棒グラフ形式で表示します。
         注:ImageJは蛍光定量にも使用できます。あるいは、TMRE染色蛍光は、市販のソフトウェアプラットフォームを用いて定量することができる。

3. 電気生理学を用いたイオンチャネル機能の確立

注:このセクションの手順では、がん細胞株中の試験化合物をスクリーニングするための自動電気生理学アッセイの使用について説明します(図3)。

1. 細胞の準備
   1. 死んだ細胞や細胞の異常増殖がない健康な培養物から細胞を採取します。化学細胞剥離液TrypLEまたは手動セルスクレーパーのいずれかを使用して、接着細胞およびクラスター細胞を回収します。CNSがん細胞の間で特に一般的な塊または球状に成長する細胞を解離します。
      注:細胞の穏やかな解離は、イオンコンダクタンスに不可欠な膜タンパク質の完全性を維持するのに役立ちます。
   2. 細胞を561 x g でRTで10分間遠心分離します。 上清を捨て、37°Cに維持したDMEM(フェノールレッドなし)、HEPES、およびペニシリン/ストレプトマイシンに20%FBSおよび4 mM L-グルタミン( 材料表を参照)を含むペレットを懸濁します。
      注:フェノールレッドの曝露は膜透過性を阻害するため、フェノールレッドを含まないDMEM培地が使用されます。
   3. ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに細胞を低密度でプレートし、単一細胞間に分離があるようにします。
      注:ここではポリ-L-リジンが使用されており、ポリ-L-リジンはコーティング特性が優れているため、ポリ-D-リジンは使用されていません。
   4. 記録を行う前に、細胞を加湿チャンバー内で37°Cおよび5%CO2で₁₂ 時間から24時間(最適な時間を確立する必要があります)インキュベートします。
2. 電気生理学記録
   1. カバーガラスからメディアを取り外します。細胞を1x PBSで2回穏やかに洗浄します。~300 μLのトリップLE溶液を加えます。ピペットを使用して、細胞が剥離するまで4〜5回静かに上下にピペットで移動します。
   2. 無血清培地(DMEM)(フェノールレッドフリー)を添加し、体積あたりの最終細胞数を少なくとも100万細胞/mLに維持します。1mLピペットを用いて、細胞を整頓し、細胞クラスターを欠く細胞懸濁液を得た。
   3. 細胞懸濁液を1 mLチューブに移します。細胞膜を安定化させるために、細胞を4°Cで10分間インキュベートします。細胞塊の形成を避けるために、シェーカー(穏やかなサイクル)で細胞を回転させ続けます。
   4. パッチ移植セットアップを準備します(「 材料表」を参照)。コンピュータ、アンプ、および灌流システムの電源を入れます。パッチマスターソフトウェアを開き、新しいファイルを作成します。
   5. バッファー(細胞外および内部)をRTに持ち込み、バッファーをそれぞれの灌流チューブにロードします。
      注:GABA_A受容体の記録には、161 mM NaCl、3 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.5 mM CaCl 2、10 mM HEPES、および6 mM D-グルコースを含む「細胞外(浴)溶液」(NaOHを使用してpHを7.4に調整)と、120 mM KCl、2 mM MgCl ₂、10 mM EGTAを含む「内部溶液」の両方が必要です。 および10 mM HEPES(NaOHを使用してpHを7.2に調整)。
   6. 電極チップ(メーカー提供)の底部に5μLの内部溶液を満たし、電極チップをポートアパッチのファラデー上部に置きます。チップに10μLの外部溶液を加え、Patch-Masterソフトウェアを使用してオシロスコープの矩形パルスを観察します( 材料表を参照)。
      注:抵抗は2〜3MΩの範囲ですが、これは細胞株に依存します。
   7. 矩形パルスが表示されたら、最初の電子調整の後、ソフトウェアがユーザーにセルを追加するように促した後、記録を開始します。
   8. 電極の中央部分に20 μLのシングルセル懸濁液を静かに加え、ソフトウェアで抵抗値を観察して、セルパッチとそれに続くギガオームシールを待ちます。
   9. 細胞パッチのライブ進行状況は、ソフトウェアの左側の列で確認できます。セルが「全セルモードで維持」されたら、ソフトウェア内でプロトコルを開いて記録を開始します。
   10. 保持電位を−80mVに設定します。Patch-Masterソフトウェアを使用してギャップのない連続記録プロトコルを実行し、セルからの電流を記録します。
   11. 安定したベースラインを取得し、ソフトウェアの左側のパネルにある自動灌流タブを使用して、指定された期間、リガンドとそれぞれの化合物アプリケーションに切り替えます。
   12. パッチマスターソフトウェアを使用してデータを取得します。
       注:データは1kHzでローパスフィルタリングされ、100kHzでデジタル化されます。
   13. Nest-o-Patchソフトウェアを使用して電流応答の最大振幅を計算することにより、データ分析を実行します( 材料表を参照)。

4. インビトロ 効力

注:この手順では、薬物の効力を決定するためのMTSアッセイについて詳しく説明します。One Solution Cell 増殖アッセイは、必要なすべてのアッセイ試薬を調製溶液に組み合わせ、細胞培養ウェルにワンステップで添加して、実験化合物で処理した後の細胞の生存率と増殖を評価します。試薬は、メーカーの推奨( 材料表を参照)に従って再構成され、分注され、-20°Cで保存されます。 このセクションでは、特定の細胞株における試験化合物の_IC50 を決定するためのアッセイの使用について説明します(図4)。このMTS試薬は、既知の濃度で多数の化合物のハイスループットスクリーニングにも使用できます。

1. 細胞の準備
   注:細胞数は、個々の細胞株の成長と代謝に依存します。アッセイを使用して治験治療を評価する前に、実験的に最適な細胞数を決定します。
   1. トリプシン処理によって培養物から接着細胞を回収し、Accutase( 材料表を参照)を使用して、塊または球状に増殖する細胞を解離します。
      注:膠芽腫および原発性髄芽腫細胞株は、塊または球状に増殖する傾向があるため、アキュターゼを必要とすることがよくあります。
   2. 細胞をカウントし、ウェルあたり10,000個の細胞を含む細胞溶液を75 μLの容量で作成します。テストする細胞数のためにストックを希釈します。希釈液あたり少なくとも1 mLを調製してください。
   3. 各希釈液75 μLを96ウェルプレート中の5つの連続したウェルのセットにプレートします。加湿環境(インキュベーター)で37°C、5%_CO2 で一晩インキュベートします。
      注:増殖または代謝が遅い細胞株(3日以上で増殖培地を酸性化する)は、細胞数の上限として10,000個を超える細胞を必要とする場合がありますが、急速に成長する細胞株(一般に20時間倍加時間より速い)は、必要な細胞数が少なくて済みます。代謝の高い細胞株は、ウェルあたり1,000個未満の細胞しか必要としない可能性があります。細胞範囲を調整して、これらの細胞株のMTSアッセイに最適なプレーティング密度を決定することができます。
2. 模擬処理制御
   1. ウェルあたり25 μLの培地を添加して、MTSアッセイにおける試験化合物の添加をシミュレートします。
      注:実際のMTSアッセイでは、試験化合物(ここではGABA_A 受容体モジュレーター、QH-II-066)用に選択された処理濃度の4倍ストック25μLを細胞に添加し、ウェルあたり100μLの総容量で1倍の最終処理濃度を得ます。
   2. 加湿環境下で37°C、5%_CO2 で48時間インキュベートします。これは、薬物の存在下での標準的なインキュベーションをシミュレートする。
3. MTSアッセイ
   1. MTS試薬の必要なアリコートを解凍します。ウェルあたり20 μLのMTS試薬を追加します。加湿環境下で37°C、5%_CO2 で1時間インキュベートします。
   2. プレート(1,350 x g 、5分間)を室温で遠心分離して、吸光度の読み取りを妨げる可能性のある気泡を除去します。
      注意: 細かいゲージの針で気泡を取り除きます。
   3. 490 nmの吸光度を読み取る。データをエクセルファイルとして保存します。
   4. プレートを5%_CO2中の37°Cに戻し、アッセイの4時間直線範囲内の期間内で繰り返し読み取りた。
      注:吸光度を読み取る前に再遠心分離する必要はありません。後の読み取り値、特に2時間の読み取りからのデータは、細胞株がMTS試薬を代謝する速度を調べるために重要であり、アッセイのためにプレートに細胞数を選択するのに役立ちます。
   5. ExcelまたはPrismを使用して、490 nm(OD₄₉₀)での吸光度光学密度(OD)とメッキセル数をプロットします。
   6. アッセイの細胞番号を選択します。最適なセル数は、線形範囲内で彩度以下になります(OD₄₉₀ = 1)。
      注:増殖が遅い細胞の場合、メッキされた細胞数はウェルあたり20,000細胞に調整でき、ウェルあたり500細胞をアッセイから除外できます。
4. ICの決定₅₀
   1. 1日目:MTSアッセイ用の細胞をプレートします
      1. 研究の細胞株名と各株の継代数を記録します。アッセイ中の蒸発に対抗するには、少なくとも、96ウェルプレートの外周の上下の列と端の左右の周囲列に1x PBS(ウェルあたり100 μL)を充填し、アッセイ中の蒸発に対抗します。
      2. アッセイの開始前に決定した各細胞株に最適な細胞数をプレートします。HEPESバッファーを含まないフェノールレッドフリー、抗生物質フリーの培地のウェルあたり75 μLに細胞をプレートします。FBSは、細胞株の増殖をサポートするために20%まで増加させることができます。
         注:フェノールレッドの曝露は膜透過性を阻害するため、フェノールレッドを欠く培地が使用されます。
      3. サンプルを処理濃度のために少なくとも5倍にプレートします。手動または自動の血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
         注:手動血球計算盤を使用するには、(1)トリパンブルーの培地に再懸濁した細胞の1:1希釈液を調製します。(2)細胞株に応じて5〜15分間インキュベートする。(3)トリパンブルーの細胞10μLを血球計算盤計数チャンバーに入れます。(4)四隅と中央の正方形の生存細胞を数え、正方形あたりの平均細胞数を決定します。(5)ミリリットルあたりの生細胞を次のように計算します。
         mLあたりの生細胞=平均生細胞×2(希釈係数)×10:⁴
      4. HEPESバッファーを含まないフェノールレッドフリー、抗生物質フリー培地で所望の濃度の細胞を調製するのに十分な容量を使用します(すなわち、ウェルあたり75 μL x プレートあたり60ウェル = プレートあたり4.5 mLの細胞)。
         注意: 各プレートには、バックグラウンド減算のための中程度のコントロールが必要です。培地コントロールは、必要に応じてPBSウェルを交換することができます。
   2. 2日目:処理化合物の追加
      1. 75 μLの培地に播種した細胞に25 μLの治療溶液を加えたときに所望の最終濃度が得られるように、所望の最終濃度の4倍で実験処理を準備します(= ウェルあたり総容量100 μL)。
      2. 最高濃度のストックを段階希釈して、テスト溶液(この場合は_{GABAA受容体} モジュレーターQH-II-066)を調製します。例えば、最終的な薬物濃度を5.0 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM、および0.3125 μMにする場合、20 μMから始まる1:1の段階希釈液を調製して、それぞれ10 μM、5 μM、2.5 μM、および1.25 μMの濃度を取得します。
         注:各プレートには、培地のみのコントロールに加えて、未処理の細胞(培地のみ)と既知の濃度の溶媒処理された細胞(多くの場合DMSO)の2つの細胞ベースのコントロールが必要です。ビヒクルが化合物の活性範囲における細胞増殖に影響を与えないようにすることは良い習慣です。
      3. 試験化合物を添加したら、細胞を加湿環境下で37°Cおよび5%_CO2 で48時間インキュベートします。
   3. 3日目:細胞増殖アッセイ(MTS)の実施
      1. 必要なMTS試薬の量を計算し(試験培養液100 μLあたり20 μL)、分注されたMTS試薬の必要量を解凍します( 材料表を参照)。
      2. ボルテックス、および使用前に試薬が完全に溶液中にあることを確認してください。解凍した試薬を滅菌済みの25 mL試薬リザーバーにピペットします。
      3. 20 μLのMTS試薬(マルチチャンネルピペットを使用)を、100 μLの培養培地中のサンプルを含む96ウェルプレートの各ウェルにピペットします。
      4. プレートを37°C、5%_CO2 で加湿環境下で1時間から4時間インキュベートします。プレートは複数の時点で読み取ることができます。通常、プレートは1時間および2時間または3時間で読み取られます。
      5. 媒体中の気泡は誤った結果につながる可能性があります。プレートリーダーで読み取る前に、プレートを1,350 x g で室温で5分間回転させます。針またはピペットチップを使用して、遠心分離後に残っている気泡を除去することができます。
      6. 適切なマイクロプレートリーダーまたは分光光度計を使用して490 nmの吸光度を測定します( 材料表を参照)。
      7. データをエクセルファイルとして保存します。
         注:試験化合物の存在下でのインキュベーション時間は、試験される化合物に加えて、代謝速度および研究中の細胞株の成長に応じて変化する。48時間のインキュベーション期間は、ほとんどの細胞株および試験化合物の出発点として適しています。
5. データ分析
   1. データをExcelファイルで転送し、試験化合物濃度を上げて各反復のデータを整理します。中程度のみの対照値を平均し、実験データからこの値を差し引きます。
   2. 各複製についてコントロールを100%増殖に設定することによって、ビヒクルウェル(または溶媒処理コントロールウェル)と比較した処理ウェルにおける細胞増殖のパーセントを決定する。
   3. Excelで生成されたデータを任意のプログラムに転送します。著者らは通常、Prismソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、細胞増殖を50%阻害する薬物濃度を決定した(IC₅₀)。
   4. Prismソフトウェアで、X列をセル番号、Y列を並べたサブ列の5つの複製値の平均ODとするデータテーブルを作成します。
   5. 薬物治療を分析する場合、X列に治療濃度の値を入力します。x軸に処理化合物名と濃度単位のラベルを付けます。
   6. Excel 分析から計算された複製セル生存率の値を Y サブ列に入力します。y軸を細胞増殖(%)としてラベル付けします。
   7. 解析ツールを使用して、[XY 解析] の下の [非線形回帰 (カーブ フィット)] を選択します。
   8. 用量反応[阻害]と正規化反応-変数勾配を選択します。
   9. 解析機能を実行します。結果表を表示して、IC₅₀ の計算されたベストフィット値とカーブフィットグラフを確認します。グラフのx軸は、必要に応じて対数スケールに変更できます。

上記は、がん細胞のイオンチャネルの特性評価に使用できる手順です。最初のプロトコルは、イオンチャネルの染色を強調しています。詳述したように、イオンチャネル、さらに言えば、細胞外膜に存在するタンパク質を染色する場合、多くの課題があります。図1に示すのは、五量体GABAA受容体のサブユニットに対する染色である。2番目のプロトコルは、癌細胞におけるミトコンドリアの分極状態を試験した結果を強調しています。ミトコンドリアは、細胞の生存率と増殖、および細胞死に不可欠な役割を果たしています。哺乳類細胞では、ミトコンドリアは、ミトコンドリアの内膜と外膜の間に見られるBcl-2ファミリータンパク質の放出を介して、細胞ストレスに応答してアポトーシスを活性化します。サイトゾルでは、Bcl-2ファミリータンパク質がカスパーゼプロテアーゼを活性化し、プログラムされた細胞死を媒介します。原形質膜イオンチャネル機能の変化は、ミトコンドリア内のイオンレベルを含む細胞内イオン恒常性の破壊をもたらし、膜電位の喪失につながり、アポトーシスを引き起こす可能性があります14。Ca2+、K+、Na+、およびH+のレベルは、ミトコンドリア開始細胞死を引き起こす可能性のあるシグナル伝達イベントにおける重要な決定要因です。図2に示すのは、細胞透過性の正電荷色素TMREによる染色であり、負電荷21、22を維持している活性ミトコンドリアにおける膜電位を標識および画像化する。TMREは、相対的な負電荷のために活性ミトコンドリアと結合する赤橙色の色素です。脱分極または不活性のミトコンドリアは膜電位を低下させ、したがってTMREを隔離することができない。この実験では、イオノフォアアンカプラーFCCPは、ミトコンドリア膜を脱分極し、それによってTMRE23の蓄積を防ぐため、重要な制御です。3番目のプロトコルは、シングルセルパッチクランプ電気生理学に焦点を当てています。図3は、患者由来髄芽腫細胞株D283から記録された痕跡の代表的な記録である。最後に、第4のプロトコルは、癌細胞の増殖状態を決定するためのアッセイを強調する。図4に、MTSアッセイがどのように機能するかの詳細と、研究中の癌細胞(この場合はDAOY)の生存率を損なう薬剤とインキュベートした場合のプレートと読み出しの図を示します。

図1:イオンチャネルの細胞の染色 。 (A)D283髄芽腫癌細胞におけるGABAA受容体 のサブユニットであるタンパク質Gabra5の染色。(B)DNAに結合する蛍光染色剤4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で処理した固定細胞。(C)Gabra5とDAPIの両方について染色された髄芽腫癌細胞の融合。スケールバー= 10 μm。この図はKallayら14から採用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ミトコンドリアの分極状態をテストする。 (A)生きたD283髄芽腫癌細胞は、薬物QH-II-066の濃度を増加させて治療される。次に、細胞を正に帯電した細胞透過性のTMRE(テトラメチルローダミン、エチルエステル)で処理し、活性(負に帯電した)ミトコンドリアに蓄積します。脱分極または不活性のミトコンドリアは膜電位を低下させているため、TMRE色素を保持できません。その結果、それらは低い蛍光シグナルを示す。蛍光顕微鏡で画像化。FCCP(カルボニルシアニド4-[トリフルオロメトキシ]フェニルヒドラゾン)。ピーク:λex、549ナノメートル;λem、575ナノメートル。スケールバー = 10 μm。 (B)ソフトウェアプラットフォームを使用したTMRE染色の定量(パネルAに示す画像)。データは、平均の平均と平均の標準誤差として表示されます。この図はKallayら14から採用されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:電気生理学を用いたイオンチャネル機能の確立 。 (A)ファラデーケージ(a)、記録室(b)、吸引ユニット(c、右)で構成されるPort-a-Patchセットアップまたはリグを示しています。(B)灌流入口(a)、出口(b)、および参照電極(c)を備えた記録チャンバーを強調するPort-a-Patchリグの上面図。(C)Port-a-Patchは、自動および手動の操作モードと溶液リザーバーを備えた迅速な溶液交換灌流システムに接続されています。(D)Port-a-Patchリグ(Nanion)およびD283髄芽腫癌細胞を使用した全細胞パッチクランプ電気生理学記録からの代表的な電流トレース。GABA(10 μM)を-80 mVの保持電位で5秒間印加しました。(E)GABA(1 μM)とGABA単独によって誘導される電流を増強するGABAA受容体 アゴニスト(全身麻酔薬)プロポフォール(50 μM)を併用したPort-a-Patchリグ(Nanion)およびD283髄芽腫癌細胞を使用した全細胞パッチクランプ電気生理学記録からの代表的な電流トレース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:薬物の効力を評価するためのMTSアッセイ 。 (A)細胞増殖の減少によって反映される、薬剤の効力を評価するために使用される「MTSアッセイ」の基礎となる化学反応。生存可能である細胞によるMTSテトラゾリウムの還元は、色素ホルマザンを生成する。(B)薬物濃度の増加に伴うMTSアッセイの比色結果を示す96ウェルプレート。この実験では、DAOY髄芽腫癌細胞を、GABAA 受容体の陽性アロステリックモジュレーターである前臨床薬KRM-II-08の濃度を高めて治療します。(C)MTSアッセイで生成された用量反応曲線(96ウェルプレートの定量から)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:手動と半自動および/または全自動の電気生理学セットアップの比較。

D.A.P.K.はAmlal Pharmaceuticals Inc.の共同設立者、社長、CEOであり、Amlal Pharmaceuticals Inc.の共同設立者であり、Bexion Pharmaceuticals, Inc.の医薬品安全性監視委員会のメンバーです。