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方法論記事

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

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DOI:

10.3791/65433

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2023年6月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Univ Paris Est Creteil, INSERM, IMRB, F-94010 Creteil, France, 2Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, IMRB, F-94700 Maisons-Alfort, France, 3EFS, IMRB, F-94010 Creteil, France, 4AP-HP, Hopital Mondor, Service d'histologie, F-94010 Creteil, France

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex vivo環境での筋幹細胞および筋細胞ニッチの2D培養について説明します。

要約

骨格筋は体の中で最大の組織であり、運動から体温調節まで、複数の機能を果たします。その機能と損傷からの回復は、多数の細胞タイプと、コア筋細胞(筋繊維、筋幹細胞)とそのニッチの間の分子シグナルに依存しています。ほとんどの実験環境では、この複雑な生理学的微小環境は維持されず、筋幹細胞にとって重要な細胞状態である休止状態のex vivo 研究も許可されていません。ここでは、ニッチの細胞成分を持つ筋幹細胞の ex vivo 培養のためのプロトコルが概説されています。筋肉の機械的および酵素的分解を通じて、細胞タイプの混合物が得られ、それは2D培養に入れられます。免疫染色は、1週間以内に、筋線維、そして重要なことに、静止筋幹細胞の特徴を示すPax7陽性細胞とともに、複数のニッチ細胞が培養中に存在することを示しています。これらの独特な特性はこのプロトコルに基本的で、translational質問に演説するのに使用することができる静止そっくりの幹細胞の細胞拡大そして生成のための強力な用具をする。

概要

運動、呼吸、代謝、姿勢、体温の維持はすべて骨格筋に依存しており、骨格筋の機能不全は衰弱性の病状(ミオパチー、筋ジストロフィーなど)を引き起こす可能性があります。1.骨格筋は、その本質的な機能と豊富さから、正常な筋肉機能をサポートし、治療標的として役立つ重要な側面を理解しようと努力する世界中の研究機関の注目を集めています。さらに、骨格筋は、主にその常在幹細胞2により、健康な筋肉が完全な損傷や変性の後に完全に自己修復できるため、再生と幹細胞機能を研究するために広く使用されているモデルです。これらはサテライト細胞とも呼ばれ、筋線維3の周辺の基底層の下に局在している。

成人の骨格筋の中核となる細胞は、筋線維(長い合胞体多核細胞)とサテライト細胞(筋原性を有する幹細胞で、損傷によって活性化されるまで静止している)です。後者の細胞は筋肉再生の中心細胞であり、このプロセスはそれらがない場合には起こり得ません4,5,6,7。その身近な微小環境には、複数の細胞タイプとそれらにシグナルを送る分子因子があります。このニッチは、発達を通じて成人期8まで徐々に確立されます。成体筋には、複数の細胞タイプ(内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、線維脂肪形成前駆細胞-FAP、制御性T細胞など)が含まれています。9,10および細胞外マトリックス成分(ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、ペリオスチンなど)11は、健康、病気、および再生の文脈で互いに、および衛星細胞と相互作用します。

この複雑なニッチを実験環境で維持することは、基本的ではあるが困難である。同様に難しいのは、サテライトセル9にとって重要なセル状態である静止状態を維持または回復させることである。これらの課題に部分的に取り組むためにいくつかの方法が導入されており、それぞれに長所と短所があります(説明のセクションで詳しく説明します)。ここでは、これら2つの障壁を部分的に克服できる方法を紹介します。筋肉は最初に採取され、次に機械的および酵素的に分解されてから、不均一な細胞混合物が培養されます。培養の過程で、ニッチの多くの細胞タイプが検出され、静止状態に戻ったサテライト細胞が観察されます。プロトコルの最後のステップとして、広く受け入れられているマーカーを使用して各細胞タイプの検出を可能にする免疫蛍光法のステップが提示されます。

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プロトコル

すべての実験は、Institut Mondor de Recherche Biomédicale(INSERM U955)のフランスおよびEUの動物規制、特に指令2010/63/UEに準拠しています。動物は、認証番号A94、028、379およびD94-028-028の動物施設で管理され、充実した環境で飼育されました。それらは許可された研究者と動物の世話人によってのみ取り扱われ、動物飼育施設の職員によって目視検査が行われ、生涯にわたって不快感の兆候がないか確認されました。彼らは解剖前に子宮頸部脱臼によって安楽死させられた。動物の生涯の間に介入処置は行われなかった。したがって、倫理委員会とフランス高等教育研究イノベーション省から手続きの承認を得る必要はありませんでした。実際、指令2010/63/UEによると、安楽死と死後解剖には倫理的クリアランスは必要ありません。本稿で発表した結果は、野生型C57BL/6NRj系統( 材料表参照)とトランスジェニック Tg:Pax7-nGFP 系統12(我々のチームで作製)によるものです。プロトコルは、8〜12週齢の雄および雌のマウスに適用されました。

1. 試薬および装置調製、前消化

  1. 解剖器具(直線および湾曲したハサミ、鉗子、 材料表を参照)に70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。コルク板にアルミホイルを塗り、10cmのシャーレ(1匹につき1枚)を近くに置いておく。紙と70%エタノールを手の届くところに用意してください。
    注意: 解剖の最後に、解剖ツールを水ですすぎ、70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。
  2. 回転式ウォーターバスを 37 °C に設定し、DMEM と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、0.5 U/mL コラゲナーゼ、3 U/mL ディスパーゼ( 材料表を参照)、0.2% BSA を 50 mL チューブに混ぜて消化ミックス(20 mL/動物)を調製します。
  3. 消化ミックスを細胞培養フード内の0.22 μmフィルターに通します。
    注意: 消化ミックスは毎回新鮮に準備することをお勧めします。

2. 試薬と機器の準備:消化後




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結果

このプロトコルは内生ニッチから衛星細胞そしてほとんどのセルを維持している間筋肉細胞培養を可能にする。図 2 はプロトコルの主なステップをまとめたもので、図 1 は解剖と消化の重要な部分を示しています。後肢の筋肉組織の解剖が推奨されます(図1A-C)、この筋肉群はよく研究されており、発達の起源と分子階層を共有しているためです14。すべての混合物を無菌条件下で調製することをお勧めします。さらに、消化ミックスを細胞培養フードの下の 0.22 μm フィルターに通すと、培養コンタミネーションの低下が認められました。

バルク調製物の1/30をコーティングされた1cm2 ウェルプレートに播種すると、培養開始から3〜4日後に細長い細胞が見えます。ただし、これは細胞濃度によって異なる場...

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ディスカッション

成人の骨格筋の機能は、精巧に調整された一連の細胞間相互作用と分子シグナルによって支えられています。ここでは、生理学的微小環境によく似た ex vivo 環境でこれらのパラメータの研究を可能にする方法を提示する。

いくつかのグループは、筋原性細胞を培養するためのin vitro法を報告しています。これらの方法は、サテライト細胞を単離して、その筋原性前駆細胞特性を研究することを目的としていました。ポジティブセレクションにはPax7、CD34、a7-インテグリン、ネガティブセレクションにはCD45、CD31、Sca1の抗体パネルを使用して、ヒラメ筋および/またはEDL筋18、またはFACS単離サテライト細胞からバルク筋から純粋なサテライト細胞を単離するために、2つの主要なアプローチが使用されます19,20,21.また、F...

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開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

図 2 では、Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) のテンプレートを使用しました。FRラボは、Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE(助成金19507および22946)、Fondation pour la Recherche Médicale - FRM(EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793)、Agence Nationale pour la Recherche - ANR(ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73)、およびLa Ligue Contre le Cancer(IP/SC-17130)の支援を受けています。上記の資金提供者は、この研究のデザイン、収集、分析、解釈、報告、またはこの原稿の執筆に何の役割も果たしていませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗CD31BD550274希釈 1:100
抗 FOSBサンタクルーズsc-7203希釈 1:200
反 GFPAbcamab13970希釈 1:1000
反 Ki67Abcamab16667希釈 1:1000
反 MyHCDSHBMF20-c希釈 1:400
抗MYODアクティブ モチーフ399911:200
anti-MYOGSanta Cruzsc-5761:150
anti-Pax7Santa Cruzsc-816481:100
anti-PDGFRαInvitrogenPA5-16571希釈 1:50
b-FGFPeprotech450-33濃度 4 ng/mL
ウシ血清アルブミン (BSA) – 消化に使用 シグマ アルドリッチA7906-1006濃度 0.2%
BSA IgGフリー、プロテアーゼフリー – 染色に使用ジャクソン免疫研究001-000-162濃度 5%
セルストレーナー 40 umDominique Dutscher352340
セルストレーナー 70 umDominique Dutscher352350
セルストレーナー 100 umDominique Dutscher352360
コラゲナーゼロシュ10103586001濃度 0.5 U/mL
培養プレートSarstedt94.6140.802
ジメチルスルホキシド (DMSO)EuromedexUD8050-05-A
ディスパーゼロシュ4942078001濃度 3 U/mL
解剖鉗子 サイズ 5ファインサイエンスツール91150-20
解剖鉗子サイズ55サイエンスツール11295-51
剖はさみ(大、ストレート)ファインサイエンスツール9146-11
剖はさみ(小、湾曲)ファインサイエンスツール15017-10
剖はさみ(小、ストレート)ファインサイエンスツール14084-08
ダルベッコの修正Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher41966-029
EdU Click-iT kitThermoFisherC10340
ウシ胎児血清 – オプション 1EurobioCVF00-01
ウシ胎児血清 – オプション 2Gibco10270-106 
マトリゲルコーニング ライフサイエンス354234コーティングソリューション
パラフィルムドミニク・ダッチャー090261フレキシブルフィルム
パラホルムアルデヒド – オプション 1PanReac AppliChem ITW 試薬211511.1209濃度 4%
パラホルマルデイド – オプション 2ThermoFisher28908濃度 4%
ペニシリン連鎖球Gibco15140-122
振とう湯浴サーモフィッシャーTSSWB27
TritonX100Sigma AldrichT8532-500 ML濃度 0.5%
野生型マウスJanvierC57BL/6NRj
希釈希釈希釈ファイン解解解菌

参考文献

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