ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物では^Ca2+シグナル伝達、およびアポ^{トーシスの}誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。

ミトコンドリアの超微細構造は、電子^{顕微鏡5によって}最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした^6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠である^{と考えられている8。}

ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つの^{サブユニット9,10,1}で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合^部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する^9,11ため、これら2つのサブユニット^がMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体^{9,12,13,14,15,16}、Fzo1-Ugo1^複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro ¹⁷など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している¹⁸。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する^19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています²¹。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している^22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo1^24,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている²⁷。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した²⁸。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイム^Q28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。

ここでは、先に述べたミトコン^ドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの³²と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。

1. バッファーとストック溶液

1. 1 M 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)溶液を脱イオン水(pH 7.4)で調製します。4°Cで保存してください。
2. 500 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水、pH 8.0 で調製します。室温で保存してください。
3. 脱イオン水に2.4 Mソルビトールを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
4. 脱イオン水で2.5Mスクロースを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
5. イソプロパノール中に 200 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を調製します。-20°Cで保存してください。
   注意: PMSFは飲み込むと有毒であり、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こします。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。
6. 脱イオン水で72%トリクロロ酢酸(TCA)を調製します。4°Cで保存してください。
   注意: TCAは、呼吸器への刺激、重度の皮膚の火傷、および目の損傷を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。
7. SMバッファー(20 mM MOPSおよび0.6 Mソルビトール、pH 7.4)を調製します。
8. 膨潤バッファー(20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4))を調製します。
9. スクロースグラジエントバッファー(0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M、1.3 M スクロース)を 20 mM MOPS で調製し、0.5 mM EDTA、pH 7.4 で溶液を調製します。
   注:すべてのバッファーは4°Cで保存できます。ただし、真菌の増殖を防ぐために、スクロース含有バッファーを-20°Cで保存することを推奨します。プロテアーゼ阻害剤は、使用前に新たに添加する必要があります。

2. 服従軟骨小胞の生成

1. 粗酵母ミトコンドリアを確立されたプロトコルに従って新たに分離します^34,35。
   注:この実験では、ミトコンドリアを 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離しました。他の細胞小器官を欠いた勾配の純粋なミトコンドリアの生成は必要ありません。
2. 単離したばかりのミトコンドリア10 mgを1.6 mLのSMバッファー(4°C)にピペッティングで再懸濁します(図2、ステップ1)。
3. ミトコンドリア懸濁液を予冷した100 mL三角フラスコに移します。
4. 20 mLのガラスピペットを使用して、16 mLの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。添加中は、氷上で絶えず穏やかに攪拌します。この浸透圧処理により、マトリックス空間に水分が取り込まれます。ミトコンドリアの内膜の腫れは外膜を破壊します。ただし、両方の膜は接触部位⁹で接触したままになります(図2、ステップ2)。
5. 氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。
6. 5 mLのガラスピペットを使用して、5 mLの2.5 Mショ糖溶液をゆっくりと加え、サンプル中のスクロース濃度を約0.55 Mに上げます。この浸透圧処理は、マトリックス³⁶からの水の流出をもたらす。内膜の収縮は、外膜の残留断片までの距離を最大化することを目的としています。これにより、超音波処理によって内膜と外膜の人工ハイブリッド小胞が生成される可能性が低下します(図2、ステップ3)。
7. 氷上で15分間穏やかに撹拌しながらサンプルをインキュベートします。
8. ミトコンドリアを超音波処理して、提出軟骨膜小胞を生成します(図2、ステップ4)。
   1. ミトコンドリア懸濁液を予冷したロゼットセルに移します。
   2. ミトコンドリア懸濁液を10%の振幅で30秒間超音波処理し、ロゼットセルを氷浴で冷却します。
   3. 懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。.
   4. 手順2.8.2と手順2.8.3をさらに3回繰り返します。
      注:超音波処理条件は、使用する超音波処理装置によって異なります。個々のマシンに対して最適化が必要になります。過酷すぎる超音波処理は、ミトコンドリアの内膜と外膜からなる小胞の人工的な形成につながります。

3. 服従軟骨小胞の分離

1. 生成された小胞を、20,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、残りの無傷のミトコンドリアから分離します。 無傷のミトコンドリアはペレット化し、小胞は上清にとどまります。
2. 小胞混合物を濃縮します。
   1. 上清を新しい超遠心分離チューブに移します。
   2. 0.8 mm x 120 mmのカニューレを装備した1 mLのシリンジを使用して、チューブの底部に0.3 mLの2.5 Mショ糖溶液のクッションをロードします。
   3. 118,000 x g で4°Cで100分間遠心分離します。
      注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。
3. 小胞は、遠心分離後、スクロースクッションの上部にディスクとして現れます。上澄み液の約90%を捨てる。次に、ピペッティングで上下に動かし、2.5 Mスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁することにより、濃縮小胞を回収します。懸濁液を氷冷したDounceホモジナイザーに移します。
4. ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して、少なくとも10回のストロークで懸濁液を均質化します。
5. スクロースグラジエントを準備します。
   1. 5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。
      注意: スクロース濃度を測定および調整するには、屈折計をお勧めします。ただし、必須ではありません。10 μLの緩衝液を屈折計に塗布し、それぞれの屈折率を検出します。ショ糖濃度の計算は次のとおりです。
      
      1.3333は水の屈折率を表します。0.048403は、水溶液中のモル屈折率からスクロース濃度への線形スケーリングから得られるスクロース特異的変換指数 ^である37。
   2. 遠心分離チューブに最高濃度のショ糖を加え、チューブを-20°Cに保ちます。 レイヤーが完全にフリーズするまで待ってから、次のレイヤーを適用します。最後の層が追加されるまで適宜進み、グラジエントを-20°Cで保存します。
      注:実験を開始するときは、グラジエントを融解するために、凍結グラジエントを 4 °C に移すことを忘れないでください。これには約3時間かかります。ここでの遠心分離には、容量13.2 mLのスイングバケットローターを使用しました。別のローターを使用する場合は、グラジエントステップボリュームをそれに応じて調整する必要があります。
6. 屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。屈折計にアクセスできない場合は、スクロース濃度が2 Mであると仮定することもできます。この想定されるスクロース濃度は、次のステップの基礎となります。
7. 適切な量の 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4)を添加して、スクロース濃度を 0.6 M に調整します。スクロース濃度が測定されずに2 Mと推定される場合は、調整後に濃度が十分に低いかどうかをテストすることをお勧めします。試験管内の200 μLの0.8 Mスクロースの上に、サンプルの少量のアリコート(約50 μL)を塗布します。サンプルは 0.8 M スクロースの上に留まる必要があります。
8. サンプル(約 1 mL)をスクロースグラジエントの上にロードします(後で参照できるように 10% を保持します)。グラジエントの乱れを避けるためには、慎重なピペッティングが重要です(図2、ステップ5)。
9. 200,000 x g 、4°Cで12時間遠心分離して小胞を分離します。可能であれば、遠心分離機をゆっくりと加速および減速に設定して、グラジエントの乱れを回避します(図2、ステップ6)。
   注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。
10. 1 mLのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700 μLのフラクションで回収します。これにより、17 のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。

4. 服従軟骨小胞の解析

1. 各画分を2回連続して実施されたTCA沈殿³⁸に供することにより、タンパク質を濃縮し、SDS-PAGEサンプルを調製する。
   1. 200 μL の 72% TCA を個々のフラクションに加え、溶液が均一になるまで混合します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿したタンパク質を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、500 μLの28%TCA溶液を加え、よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。
   2. ペレットを1 mLのアセトン(-20°C)で洗浄し、20,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上澄みを捨て、ペレットを自然乾燥させます。ペレットを60 μLのSDSサンプルバッファーに再懸濁し、サンプルを95°Cで5分間インキュベートします。
      注:最初のTCA沈殿後、特に高密度画分に大量のスクロースが残ります。これは、追加のTCA降水によって除去されます。
2. 各画分20 μLをSDS-PAGE³⁹およびイムノブロッティング^{40、41、42、43}で分析します。

ミトコンドリアの内膜と外膜を分離することは比較的簡単です。しかし、接触部位を含む小胞の生成と分離ははるかに困難です。私たちの意見では、超音波処理条件と使用される勾配の2つのステップが重要かつ不可欠です。

通常、線形グラデーションは、ステップグラデーションと比較して解像度が高いと考えられています。しかし、再現性のある生産は面倒で、特別な機器が必要です。そこで、個々のステップ間の差が比較的小さいステップ勾配を生成する方法を確立しました(ステップ3.5参照)。遠心分離時にステップグラジエントのバランスが取れ、ほぼ直線的なグラジエントになるのではないかと推測しました。驚くべきことに、屈折計を使用して遠心分離後の個々のフラクションのスクロース濃度を測定したところ、200,000 x g で12時間の遠心分離後にステップグラジエントが実際にほぼ直線的になることが明らかになりました(図3)。

軽度の超音波処理の重要性は、これらの代表的な結果で明らかです。穏やかな超音波処理条件(図4A)では、ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、初期の低密度画分(フラクションNo.4)で濃縮され、後期のフラクションでは事実上存在しなかった。ミトコンドリア内膜マーカーTim17は、高密度画分に濃縮された(画分番号17)。対照的に、接触部位タンパク質Mic60は、中間スクロース濃度の画分に蓄積し(画分番号12-14)、種々の膜小胞の生成とその後の分離に成功したことを示している。対照的に、より厳しい超音波処理条件では、ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、グラジエントのより低い画分で検出され得る(フラクションNo.14およびフラクションNo.17、 図4B)。さらに、中間密度の画分にはかなりの量のTim17が含まれていました(フラクションNo.13およびフラクションNo.14、 図4B)。中間密度の画分に外膜マーカーと内膜マーカーが非特異的に蓄積していることは、混合膜の人工的な形成を示しており、候補タンパク質の同定を阻害します。

図1:ミトコンドリアの超微細構造の模式図。 ミトコンドリアのさまざまなコンパートメント、膜、およびタンパク質の位置を示すための概略図。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:接触部位タンパク質を単離するためのミトコンドリア分画のワークフロー。 プロトコルに記述されているプロセスの概略図。(1)単離したばかりのミトコンドリアは、(2)浸透圧的に腫れ、(3)その後縮小した。(4)収縮したミトコンドリアは、サブレドコンドリア小胞を生成するための軽度の超音波処理に反対した。(5)小胞混合物を濃縮し、スクロースステップグラジエントにロードした。(6)遠心分離により、ミトコンドリア外膜小胞は低ショ糖濃度で、ミトコンドリア内膜小胞は高ショ糖濃度で、接触部位含有小胞は中濃度のショ糖濃度で濃縮された。略語:MIM、ミトコンドリア内膜;MOM、ミトコンドリア外膜。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:遠心分離による線形グラジエントの生成。 2 段階のグラジエント(1.3 M、1.13 M、次に 1.02 M、0.96 M、0.8 M、20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4)を並行して調製し、1 mL の 0.6 M スクロースを 20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA(pH 7.4)で両方のグラジエントにロードしました。グラジエントを 200,000 x g および 4°C で 12 時間遠心分離し、それぞれ 17 分割で回収しました。この方法の再現性は、屈折計を用いて個々のグラジエントの単一画分のスクロース濃度を測定することによって試験した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:明確に定義された超音波パルスによる接触部位タンパク質の単離。 (A,B)新たに単離された酵母ミトコンドリアを浸透圧処理に供し、超音波処理に曝露した。生成された小胞は、ショ糖浮力密度勾配遠心分離を使用して分離されました。グラジエントを分画し、さまざまなフラクション中のタンパク質をTCA沈殿に供しました。ミトコンドリア外膜(Tom40)、ミトコンドリア内膜(Tim17)、および接触部位(Mic60)のマーカータンパク質の分布を、示された抗体を用いたイムノブロッティングにより分析しました。(A)軽度の超音波処理(4 x 30秒、振幅10%)により、外膜タンパク質(低密度画分)および内膜タンパク質(高密度画分)が明確に分離された。さらに、接触部位タンパク質Mic60は、中間密度の画分で濃縮することに成功しました。(B)より厳しい超音波処理(4 x 30秒、振幅20%)は、ハイブリッド小胞の生成をもたらし、したがって、接触部位の明確な分離を可能にしなかった。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者らは、利益相反がないことを宣言します。