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方法論記事

生検由来腎細胞の代謝表現型の解明

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DOI:

10.3791/65457

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2025年6月17日

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1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

この記事について

サマリー

このプロトコルは、生検由来の腎臓細胞の代謝プロファイリングを実施するための独自の方法を説明しています。提示されたアプローチは、健康な成体雄ブタで最適化されており、腎臓同種移植片の生存率のリアルタイム評価を強化する可能性があります。この方法は、代謝に基づく複数の腎臓病にわたる新しい生物学を明らかにするのにも役立つ可能性があります。

要約

腎臓移植は、末期腎疾患の最適な治療法です。しかし、移植された腎臓は早期に失われることが多く、移植後10年で最大50%の移植片が失われます。移植片の早期喪失の主な原因の 1 つは、移植時に移植片が受ける損傷であり、虚血再灌流障害 (IRI) として知られています。移植後1週間の透析の必要性として定義される遅延移植片機能(DGF)は、急性腎障害(AKI)の機能的および組織学的特徴を示す重度のIRIの症状です。AKIを駆動するメカニズムは不明のままですが、蓄積された証拠は、同種移植片の代謝機能の変化がAKIを媒介し、DGFの原因である可能性があることを示唆しています。したがって、IRIの代謝基盤を解読し、モニタリングすることで、AKIを診断し予防する能力を向上させることができます。この記事では、針生検由来腎細胞懸濁液中のミトコンドリア呼吸(酸素消費率)、解糖(細胞外酸性化率)、および細胞内ATPレベルを評価する独自の方法について説明します。この方法論は、健康な成体雄ブタで最適化され、自家移植のブタモデルで検証されています。提示されたアプローチは、臨床における腎臓同種移植片の生存率のリアルタイム評価を強化する可能性を秘めています。患者由来の生検における代謝のプロファイリングは、他の代謝ベースの腎臓病における新しい生物学も明らかにする可能性があります。

概要

腎臓移植は、末期腎疾患の最適な治療法です1,2,3,4;しかし、移植された腎臓は時期尚早に失われることが多く、移植後10年で最大50%の移植片が失われます5。罹患した患者は、罹患率と死亡率が増加し、医療制度に大きな経済的負担をもたらしています6。移植片の早期喪失の主な原因は、移植時に移植片が受ける損傷であり、虚血再灌流障害(IRI)として知られています。IRIは、血流の減少とそれに続く再灌流7によって引き起こされる避けられない損傷です。虚血は、コハク酸組織の蓄積を特徴とし、これがミトコンドリアの呼吸鎖における逆電子の流れを促進し、スーパーオキシドの生成とその後の再灌流後の早期の損傷につながります8。移植臓器のIRIは、一次非機能、遅延グラフト機能(DGF)、拒絶反応、およびグラフト転帰の不良のリスクを高めます8,9。DGFは、移植後1週間目の透析の必要性と定義され9、重度のIRIの症状です10。組織学的には、IRI関連DGFは急性尿細管壊死(ATN)および微小血管系の損傷として現れます。機能的には、糸球体濾過率 (GFR) と尿量、同種移植片11 の急性腎障害 (AKI) の特徴が減少しています。その重要性にもかかわらず、現在、虚血再灌流関連の移植後AKIの治療法はありません。治療法の欠如は、疾患のメカニズムの不完全な理解と、損傷が可逆的である可能性のある重要な時点で移植片機能障害のリスクが最も高い患者を特定するためのマーカーの欠如に起因しています12。

蓄積された証拠は、同種移植片のエネルギー代謝の変化がAKIを媒介し、DGF 13,14,15を支える可能性があることを示唆しています。腎臓細胞は、ミトコンドリア呼吸と解糖系という2つの主要なメカニズムを介してエネルギーを生成します16。IRIでは、再灌流によりミトコンドリア機能障害が生じます17。その結果、解糖が主要なエネルギー源となる13,18,19,20。IRIの代謝シフトは、尿細管および微小血管内皮細胞の死を促進し、AKI 21,22,23,24につながります。以前の研究では、ATNは解糖酵素の発現増加およびミトコンドリアタンパク質のレベルの変化と関連していた25、これは移植片13,18のIRIと一致していた。さらに、ブタの腎臓自己移植モデルでは、虚血とそれに続く低温保存により、腎臓のミトコンドリアタンパク質のレベルが低下し、乳酸排泄が増加しました26。全体として、これらの知見は、同種移植片の基礎代謝特徴が同種移植片の機能不全を予測できるため、移植前であっても腎臓同種移植片の代謝表現型を監視することの臨床的重要性を確固たるものにしています27。

同種移植片の拒絶反応と喪失の短期リスクの臨床予測モデルが開発されました28,29。しかし、これらのモデルは精度に欠けており、グラフト30,31,32の分子的特徴を考慮していない。最近の研究では、同種移植片の機能不全や拒絶反応 13,14,15,25,33,34 など、移植片の劣った結果に関連する組織レベルでの分子パターンを特定することにより、この満たされていないニーズに対処することを目的としていました。これらの研究は、遺伝子33,34,35、タンパク質25,26、および代謝物レベル13,14での定常状態の分子測定に依存しており、同種移植片の代謝表現型の不完全な画像を残しています。この知識のギャップは、特定の瞬間における腎臓由来のサンプルの代謝機能とエネルギー状態を測定できないことが一因です。生検由来の腎細胞の代謝表現型を決定するための標準化されたプロトコルの開発は、患者サンプルの研究に変換できる可能性があります。この記事では、生検由来腎細胞懸濁液中のミトコンドリア呼吸(酸素消費率)、解糖系(細胞外酸性化率)、および細胞内ATPレベルを評価するための独自のワークフローについて説明します。この方法論は、健康な成体雄ブタの腎生検コアを使用して最適化されています。将来の臨床実施を容易にするために、生検コアは、腎移植片サンプリング36,37の標準的な臨床プロトコルと同様に、18G針を使用して得られた。最後に、実験条件の識別におけるプロトコル実装の有用性は、自家移植のブタモデルで検証されました。

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プロトコル

このプロトコルは、トロント総合研究所の動物管理委員会によって承認されています(動物使用プロトコル番号:3652)。動物は、カナダのオンタリオ州にある国立衛生研究所(NIH)のNational Society of Medical Research and Guide for the Care of Laboratory Animalsに従って世話をしました。この研究では、生後3か月の雄ヨークシャー豚5頭(それぞれ体重約30kg)が使用されました。この方法論のプロトコルは、次のステップに細分化されます:(1)単一の腎生検コアの細胞懸濁液への解離。(2)生検由来腎細胞の代謝プロファイリング。(3)生検由来腎細胞におけるATP含有量の測定。代謝機能またはATP含有量の測定のために収集されたすべての生検サンプルは、バイオセーフティキャビネット内で検索から3時間以内に解離しました。この方法論のワークフローを 図 1 に示します。試薬および使用した機器は 、材料表に記載されています。

1. 単一腎生検コアの細胞懸濁液への解離

  1. 同軸針(すなわち、外側のガイド針と内側の生検針)ガンシステム38を使用して、腎皮質から組織の3つの生検コアを収集する。臨床翻訳には、18 G生検ニードルガンの使用が推奨される39。
    注: 腎皮質の生検を行うときは、生検ニードルガンの角度 (~45 °C) と穿刺の深さ (~20 mm) を一貫してください。
  2. 各生検コアを、2 mLのRPMI 1640を氷上に含んだ15 mLチューブに慎重に入れます。
    1. 氷の上に置いた6cmのシャーレにメスを使用して、生検組織を小片(長さ≤2 mm)に断片化します。極細の細い先端の湾曲したピンセットを使用して、各生検の組織断片を、1 mLの解離培地を含む異なる1.5 mLチューブに入れます。
      注:解離培地は、0.1 mg/mL DNase I、10 mg/mL コラゲナーゼ、および Bacillus polymyxa 由来の中性プロテアーゼ 2990 単位/mL を含む RPMI 1640 培地で構成されています。この培地組成物を用いたヒト腎生検の解離は、細胞生存率を最大化し、希少で脆弱な細胞集団の表現を保存することが証明されている40。
  3. 断続的な攪拌を行いながら、37°C(加熱ブロック)で30分間解離を行います(5分ごとにチューブをボルテックスすることをお勧めします)。
  4. 解離後、細胞懸濁液を35 μmセルストレーナースナップキャップチューブでろ過します。
  5. ストレーナーを1:1の容量の100%ウシ胎児血清(FBS)ですすいでください。
  6. 3つの生検由来腎細胞懸濁液を1つの15 mLチューブにプールします。
  7. 遠心分離(400 x g、5分、4°C)で細胞をペレット化し、10% FBSを含むRPMI 1640 1 mLに再懸濁します。この細胞懸濁液は、通常、0.8〜1.2×106 個の細胞を生成します。

2. 生検由来腎細胞の代謝プロファイリング

注:代謝プロファイリングステップでは、代謝機能分析装置での解糖(ECAR)と酸素消費率(OCR)の測定、および市販のキットを使用した細胞内ATPレベルの測定を統合します。

  1. カートリッジユーティリティプレートのハイドレーションとキャリブレーション
    1. サンプル回収の1日前に、代謝機能分析装置のカートリッジユーティリティプレートのすべてのウェルに200μLのddH2Oを加えます。
    2. カートリッジユーティリティプレートをCO2フリーインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
    3. サンプル回収の日には、真空システムに接続されたパスツールピペットを使用して吸引してddH2Oを除去し、カートリッジユーティリティプレートの各ウェルに200μLのキャリブラント溶液(pH = 7.4)を追加します。
    4. CartridgeユーティリティプレートをCO2フリーインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 代謝機能測定のための細胞プレーティングとアッセイ培地およびストレッサー化合物の調製
    1. 100 μLのRPMIと10% FBSを96ウェル代謝機能アッセイプレートの各ウェルに加えます。
    2. ステップ1で得られた細胞懸濁液の少量アリコート(例えば、10 μL)を別のチューブで分離し、トリパンブルー排除生存率色素を使用して細胞を染色します。
    3. 計数チャンバーを使用して、元の懸濁液中の生細胞(トリパンブルー陰性)41 の濃度を決定する。
    4. 代謝機能アッセイプレートの各研究ウェルに、密度1.0 x 105 生細胞/ウェルで細胞を播種します。このセル番号は、最適化後に決定されました(「代表的な結果」の項を参照)。
      注:代謝機能アッセイプレートの四隅のいずれにも細胞を播種しないでください、これらはブランクとして使用されます。
    5. 代謝機能アッセイプレートを37°C、5%CO2 インキュベーターで一晩(~16時間)インキュベートすることにより、細胞を接着させます。
    6. 翌日、顕微鏡下で細胞が70%〜80%の最小コンフルエンスにあることを確認します(健康な細胞単層は、代謝機能パラメータを最適に決定するために重要です)。
    7. フェノールレッドフリーの基礎培地のアリコート(40-50 mL)を37°Cで少なくとも15分間解凍します。
    8. 解凍済みの基底培地33.915 mLに、2 mMグルタミン(350 μL)、1 mMピルビン酸(350 μL)、および5.55 mMグルコース(385 μL)を加えて、35 mLのアッセイ培地を調製します。
    9. シングルまたはマルチチャンネルピペットを使用して、代謝機能アッセイプレートの各スタディウェルからRPMI培地を静かに取り出します。次に、100 μLの基礎培地を加えて細胞を洗浄します。
    10. 基礎培地を静かに取り出し、細胞のないウェルを含むすべてのウェルに150 μLのアッセイ培地を加えます。
      注:アッセイ培地なしでウェルを放置すると、プレート環境の湿度条件に影響を及ぼし、代謝機能の測定値に一貫性がなくなる可能性があります(補足図1)。
    11. 代謝機能アッセイプレートを CO2 フリーインキュベーターに 37 °C で ~1 時間置く(順化ステップ)。カートリッジユーティリティプレート(以前にキャリブラント溶液でインキュベート)をバイオセーフティキャビネットに戻します。
    12. 順応中に、アッセイ培地でストレッサー化合物の次の4つの溶液を調製します:7 μMオリゴマイシン(7倍、最終濃度1 μMオリゴマイシン)。2.4 μM シアン化カルボニル-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP) (8x、最終濃度 0.3 μM FCCP);450 mM 2-デオキシ-グルコース(2-DG)(9x、最終濃度50 mM 2-DGの場合);10 μM ロテノンと 10 μM アンチマイシン A (Rot + AA) (10x、最終濃度 1 μM Rot + 1 μM AA)。
      注:オリゴマイシンはATPシンターゼの活性を阻害するため、電子伝達鎖(ETC)を中断します。これにより、OCRとATPシンターゼによるミトコンドリアへのプロトンの流入が減少します。その結果、解糖系がATP産生の主要な供給源となる42。FCCPは、プロトン(正電荷)を引きつけ、ミトコンドリアへの連続的なプロトン流入を誘導することにより、酸化的リン酸化の非共役剤として作用するシアン化物(負電荷)であり、ATP合成酵素活性とは無関係にETCによる酸素消費を可能にする43。2-DGは、2-ヒドロキシル基が水素で置換されたグルコースの合成構造類似体であり、解糖の競合阻害剤として作用する44。RotおよびAAは、それぞれ電子伝達鎖の複合体IおよびIIIの阻害剤である45。代謝機能アッセイの異なるステップで各薬物を注射する効果は、 補足図2に示されています。
    13. 各薬剤の25μLを、カートリッジユーティリティプレートの各ウェルの上部にある対応するポート(セルのないウェルを含む)にロードします。次の順序に従って薬物をロードします:7xオリゴマイシン(ポートA)、8x FCCP(ポートB)、9x 2-DG(ポートC)、10x Rot + AA(ポートD)。
    14. カートリッジユーティリティプレートをCO2フリーインキュベーターで、代謝機能アッセイのセットアップに必要になるまでインキュベートします。
  3. 生検由来腎細胞における酸素消費量と解糖速度の測定
    1. 代謝機能アナライザーの電源がオンになっていて、アクセサリコンピューターのコントローラーソフトウェアに接続されていることを確認します。
    2. ソフトウェアを起動します。
    3. [テンプレート] > [空白] ボタンをクリックします。
    4. 最初のタブで、 インジェクション戦略ボタンをクリックします。4 つの注入ポートに対応する文字 A、B、C、D の各ボタンをクリックします。各ポートから注入される薬物の名前を書き留めます:オリゴマイシン(ポートA)、FCCP(ポートB)、2-DG(ポートC)、Rot + AA(ポートD)。
    5. 2番目のタブで、すべての実験条件を定義します。[ 条件の追加 ]ボタンをクリックして、新しい条件を導入します。ソフトウェアは、各条件に自動的に色を割り当てます。 「プレートマップ 」ボタンをクリックし、対応する実験条件を各ウェルに割り当て、それに応じて色分けします。
      注:4つのコーナーウェルは、バックグラウンド信号を差し引くために使用されるため、空白(黒色)として割り当てておく必要があります。
    6. 3 番目のタブで [Injection] ボタンを 4 回クリックすると、4 つのインジェクション (ポート A、B、C、D) がシーケンスに追加されます。アッセイは、デフォルトの注入シーケンス(A、B、C、D)、測定回数(3回の基礎測定+各注入後の3回測定)、および測定間隔(3分)を使用して実行できます。
    7. 4番目のタブで、基本的な学習情報をボックスに入力し、[ 実行]をクリックします。トレイが開き、ソフトウェアがユーザーにカートリッジユーティリティプレートの取り付けを求めます。プレートをトレイに置く前に、必ず緑色の蓋を取り外してください。
    8. キャリブレーション後(~15分)、トレイが再び開き、ソフトウェアはユーザーにカートリッジユーティリティプレートを取り外し、代謝機能アッセイプレートをトレイに置くように求めます。繰り返しになりますが、プレートをトレイに取り付ける前に、プレートの蓋を取り外してください。カートリッジユーティリティプレートは廃棄できます。
    9. アッセイは約2時間で終了します。その後、対応する '.asyr' ファイルを保存します。.asyr ファイルを計算的に解析して、ECAR 曲線と OCR 曲線を調べます。データを優先形式にエクスポートします。
  4. 代謝機能データの正常化のためのDNA含量測定
    1. 代謝機能アッセイ後、指定された細胞増殖アッセイキットを使用して、各ウェルの細胞内のDNA量を決定します( 材料の表を参照)。
    2. 20x Cell Lysis Bufferを脱イオン水で希釈し、必要量の1x Cell-Lysis Bufferを調製します。
    3. 標準曲線を調製するには、バクテリオファージλDNA標準試料(細胞増殖アッセイキットに付属)を細胞溶解バッファーで段階希釈した100 μLのサンプルを調製し、0 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mLの範囲の濃度に希釈します。各希釈液を黒色の96ウェルマイクロプレートの異なるウェルにロードします。
    4. 400x色素試薬を1x細胞溶解バッファーで希釈して、1x色素結合溶液を調製します。各標準曲線ウェルおよび代謝機能アッセイ研究ウェルには、100 μLが必要です。
    5. 1x色素溶液100μLを、すでにスタンダードが含まれている最初のカラムに分配します。注:この時点までのプロセスは、代謝機能アッセイの実行が終了する30分前に開始できます。
    6. シングルチャンネルまたはマルチチャンネルピペットを使用して、代謝機能アッセイプレートからアッセイ培地を取り出します。
    7. マルチチャンネルピペットを使用して、代謝機能アッセイプレートの各スタディウェルに100 μLの1x色素結合溶液を加えます。ピペットで数回上下に動かして細胞を溶解し、内容物をブラックプレートに移します。
    8. マイクロプレートを光から保護し、37°Cで2〜5分間インキュベートします。
    9. 蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、480 nmの励起と520 nmの発光検出により、各サンプルの蛍光強度を測定します。

3. 生検由来腎細胞のATP含量の測定

注:指定されたATP検出試薬と組換えATP(rATP)標準を使用して、生検由来腎細胞のATP量を測定します( 材料の表を参照)。

  1. 凍結した場合は、ATP検出試薬を4°Cで一晩解凍します。
  2. 生検由来細胞懸濁液を取得し、細胞をカウントした後、100 μL の RPMI 1640 培地と 10% FBS を含む白色の 96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに 1.0 x 104 個の生細胞/ウェルをプレートします。マイクロプレートの最初の列は、翌日にrATP標準曲線をロードするために使用されるため、空のままにしておきます。
  3. マイクロプレートを37°Cで5%CO2 インキュベーターで一晩インキュベートします。
  4. 翌日、ATP検出試薬を室温で予温します。
  5. rATP 標準曲線を生成します。PBSで段階希釈したrATP標準試料100 μLのサンプルを、0 nM、0.001 nM、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、100 nM、1000 nMに調製します。
  6. 各rATP標準サンプル50μLをマイクロプレートの1列目にロードします。
  7. 10% FBSを含むRPMI 1640培地を、シングルまたはマルチチャンネルピペットを使用して、各マイクロプレートスタディウェルから取り出します。
  8. 各試験を100 μLのPBS(37°Cのウォーターバスで予熱)でよく洗浄します。
  9. PBSを取り外し、各スタディウェルに50μLの新しいPBSを追加します。
  10. 50 μLのATP検出試薬を標準ウェルとスタディウェルの両方に加えます。
  11. 混合し、37°Cで2分間インキュベートし、続いて室温で10分間インキュベートします。
  12. マイクロプレートリーダーで発光を読み取り、記録します。

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結果

ワークフローは、健康な生後3か月の雄ヨークシャー豚の生検由来腎臓細胞でテストされました。組織解離および細胞プレーティングのプロトコルは、上記で概説したとおりに従った。細胞を16時間接着させた後、ミトコンドリア呼吸と解糖のマーカーとして、代謝機能アナライザーを使用して、生検由来のブタ腎臓細胞でOCRとECARをそれぞれリアルタイムで測定しました。

最初の実験は、生検由来の腎臓細胞におけるOCRおよびECAR値と代謝ストレスに対する予想される応答を自信を持って測定するための最適な播種密度を決定することを目的としていました。15,000細胞、30,000細胞、60,000細胞、1,20,000細胞の4つの異なる播種密度を試験しました。細胞は、標準製剤(5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、および1 mMピルビン酸)を含む代謝機能アッセイ培地に曝露されました。代謝ストレスは、以前に報告された一連の薬物を次の用量で注射することによって誘発されました:1μMオリゴマイシン、0.3μMのFCCP、100mMの2-DG、および1μMのRot + AA。.これらの用量は、ヒト腎臓細胞

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ディスカッション

この記事では、生検から得られた腎臓細胞の代謝機能を評価するための独自の方法について説明します。フレッシュコア腎生検から単一細胞懸濁液を得るためのプロトコルを、代謝機能および細胞内ATPレベルの分析と組み合わせた。解糖系はECARを測定することで評価され、ミトコンドリア呼吸はOCRを測定することで評価されます。ポリーン腎生検を使用して、方法論を最適化しました。

腎生検を代謝機能分析装置で解離して得られた細胞の生体エネルギー機能を効果的に研究するには、まず播種する生細胞の密度を最適化し、使用するストレッサー化合物の用量を滴定し(該当する場合)、期待される結果を反映した臨床的に関連性のある実験グループで方法論を検証することが重要です。最適化は、異なる細胞密度とストレッサー化合物濃度で行いました。1,00,000細胞/ウェルを播種し、1 μMオリゴマイシン、0.3 μM FCCP、50 mM 2-DG、および1 μM Rot/AAへの曝露後に、予想されるOCRおよびECARベースライン値と曲線形状が得られ...

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開示事項

共著者のいずれも、開示すべき競合する金銭的利益またはその他の利益相反を持っていません。

謝辞

AKは、University Health Network Foundation(579067450776、579072310776、579068260776の賞)の支援を受けました。SC-Fは、腎臓研究科学者コア教育およびナショナルトレーニング(KRESCENT)プログラム(2019KPPDF637713および24KNIA-1291062)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-デオキシ-D-グルコースシグマD6134解糖の競合阻害剤
5mL丸底ポリスチレン
試験管、セルストレーナースナップキャップ		ファルコン352235解離チューブアンチ
マイシンAから ストレプトマイセス sp.SigmaA8674呼吸鎖の複合体IIIの阻害剤
AOF BP ProteaseVitaCyte003-1000解離酵素
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)
フェニルヒドラゾン(FCCP)		SigmaC2920酸化的リン酸化のアンカプラー
CellTiter-Glo 2.0 Assay, 100mLPromegaG9242細胞内ATPの測定
コラゲナーゼ MAVitaCyte001-2030解離酵素
CyQUANT 細胞増殖アッセイ、培養細胞用InvitrogenC7026細胞内DNA
、D-グルコース、無水、試薬グレードのBioshopGLU501代謝基質
DNase IStemcell07469解離酵素
ウシ胎児血清、プレミアム、
米国産、熱不活化、500 mL		Wisent080-450解離培地サプリメント
L-Glutamine-200 mM (100x) 液体 (100 mL)Gibco25030081代謝基質
オリゴマイシン ASigma75351ATP シンターゼ
阻害剤 PBS、-/-、500 mLWisent311-010-CLCell wash
rATP, 10 mM, 0?5 mLPromegaP1132細胞内ATPの測定
ロテノンシグマR8875呼吸鎖の複合体Iの阻害剤
RPMI 1640Gibco11875119解離メディア
タツノオトシゴ ウェーブコントローラーソフトウェア 2.6アジレントN/A代謝機能測定のセットアップ
シーホースウェーブ デスクトップソフトウェア 2.6アジレントN/A代謝機能データの分析
タツノオトシゴ XF ベース培地、  フェノールレッドなし、500 mLアジレント103335-100代謝機能の測定
タツノオトシゴ XFe96 FluxPak (プレート20枚、カートリッジ18個、
、キャリブラント液500mL)		Agilent102416-100代謝機能の測定
タツノオトシゴ XFe96 代謝機能分析装置Agilent101991-100代謝機能の測定
ピルビン酸ナトリウム 溶液 100 mM (100X)、液体 100mLGibco11360070代謝基質
測定

参考文献

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

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