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方法論記事

狂犬病間接蛍光抗体検査を用いた狂犬病IgGおよびIgM抗体の検出

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DOI:

10.3791/65459

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2024年1月19日

 ,  ,  , 
1Rabies Laboratory, Wadsworth Center, New York State Department of Health

この記事について

サマリー

この原稿の目的は、狂犬病特異的IgGおよびIgM抗体を検出するための狂犬病間接蛍光抗体検査の使用を検討することです。

要約

狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために開発されました。この検査は迅速な結果を提供し、いくつかの異なるシナリオで狂犬病抗体を検出するために使用できます。狂犬病IFA検査は、狂犬病を発症した患者の免疫反応を評価するための抗体の迅速かつ早期検出に特に役立ちます。生前の狂犬病診断には他の方法が優先されますが、この検査は、抗体検出を通じて最近の狂犬病ウイルスへの曝露を実証するために利用される場合があります。IFA検査では、ウイルス中和抗体(VNA)力価は得られませんが、曝露前予防(PrEP)反応は、抗体の陽性または陰性の存在によって評価できます。このテストはさまざまな状況で利用でき、さまざまなターゲットに対して結果を提供できます。この研究では、PrEPを投与された個人から採取したいくつかのペアの血清サンプルを使用し、IFAテストを使用して狂犬病抗体の存在を経時的に実証しました。

概要

狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために使用されます。これは、生前の狂犬病患者を監視するために利用できる検査の武器庫の1つです。特に、狂犬病感染に対する患者の免疫反応を評価する抗体の早期発見に有用です。IFA検査は、他の検査、病歴、患者のワクチン接種状況と併用することで、狂犬病ウイルスやワクチンへの曝露を判断するのに役立ちます1。IFA検査はIgMおよび/またはIgGを測定するため、特異的抗体の値は、抗原1への曝露からのおおよその時間枠を示すことができます。このテストは、リストされているアプリケーションや、まだ検討されていない他のアプリケーションで役立つ場合があります。

狂犬病血清学的アッセイはいくつかあります。狂犬病ウイルス中和抗体(RVNA)を測定する主な方法は、迅速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)、蛍光抗体ウイルス中和試験(FAVN)、またはこれらの修飾です1。ただし、これらの検査では、IgM抗体とIgG抗体は区別されません。狂犬病免疫応答のモニタリングにおいて抗体アイソタイプの鑑別が重要な場合、狂犬病IFAおよび狂犬病酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)試験が使用されますが、RVNAは測定されません。IFA検査とELISA検査は、検体中の狂犬病特異的抗体の存在を判定するために使用できますが、その実行方法にはいくつかの違いがあります。IFA検査では、細胞培養された生きたウイルスを抗原基質として利用しますが、狂犬病検出用の一般的なELISAでは、1つ以上のウイルスタンパク質を使用します。狂犬病ウイルスを培養できる実験室では、ELISA用の個々のウイルスタンパク質を購入または培養する代わりに、IFA検査をより簡単に実施できる可能性があります。検査の目的と狂犬病血清学的アッセイの結果から得られた情報は、どちらを選択するかを決定する際に考慮する必要があります2。

IgMが最初に反応し、28日目頃にクラス切り替えが観察されるまで増加し、その時点でIgGが主要な循環抗体になります3。したがって、IgMは、狂犬病ウイルスへの曝露またはワクチン接種後の限られた時間のみ予想されます。血清と脳脊髄液(CSF)の両方を検査することで、曝露がワクチン接種によるものか(抗体は血清にのみ見られる)、またはウイルス感染によるものか(CSF1に抗体を示す可能性がある)を示すことができます。

狂犬病抗体は曝露前予防(PrEP)後数年間持続することが確立されています4。IFA検査は、ワクチン接種後や曝露後のさまざまな時点でこれを実証するための有用なツールとなり得ます。

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プロトコル

以下のプロトコルは、ニューヨーク州保健省ワズワースセンターによるアッセイ開発のためのヒトサンプルの倫理的使用について承認されています(プロトコル承認番号#03-019)。

1. 安全性

  1. 個人用保護具(PPE)、少なくとも目の保護具(眼鏡またはフェイスシールド)、サージカルマスク、および非ラテックス手袋を着用してください。
  2. 職員が狂犬病の予防接種を受けており、過去6か月以内に≥0.5 IU / mLの力価が実証されていることを確認します。

2. 抗原スライドの調製

注意: ウイルス、CSF、および血清のすべての操作は、バイオセーフティキャビネット(BSC)で普遍的な予防策を使用して実行してください。

  1. 10%ウシ胎児血清(EGM)を添加したEagleの最低限の必須培地で、3.0 x 105 細胞/mLの濃度になるように20 mLのマウス神経芽腫またはBHK-21細胞を調製し、使用するまで冷気に保ちます。
  2. CVS-11ウイルスをEGMで希釈して、1ミリリットルあたり1.0 x 106.5 50%組織培養感染用量(TCID50)の作業希釈液で調製し、使用する準備ができるまで冷やしてください。
    注:TCID50 は、以前に公開されたリードとミュンチ法によって決定されます5。
  3. 加湿スライドチャンバーとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)でコーティングされたウェル顕微鏡スライドを70%エタノールで洗浄し、BSCで風乾させます。
  4. スライドチャンバー内の吸収紙のストリップに蒸留水(dH2O)を加えて、手順全体を通して湿度が一定に保たれるようにします。
  5. 鉛筆を使用して、使用する各スライドにロット番号、日付、細胞の種類、および保管に必要なその他の識別情報をラベル付けし、スライドチャンバーに入れます。
    注意: ほとんどのマーカー、ペン、またはラベルは、将来のアセトン固定ステップ(ステップ2.9)に耐えられません。
  6. 50 μLのウイルス希釈液を、繰り返しピペットで顕微鏡スライド上の各ウェルに塗布します。次に、50 μLの細胞希釈液を各ウェルに塗布し、すでにウェルに付着しているウイルスでピペットチップを汚染しないように注意します。
  7. 湿度スライドチャンバーを閉じ、34〜36°Cの湿気のあるインキュベーターに入れます。 24時間後の細胞感染力を評価します。
    メモ: 手順 2.8 から 2.12 は 1 枚のスライドでのみ実行してください。
  8. スライドを湿度チャンバーから取り出し、上清を慎重に吸引します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされたCoplinジャーでスライドを2分間洗浄し、スライドを風乾させます。
  9. スライドをCoplinジャーに入れ、可燃性物質用に承認された-20°Cの冷凍庫で最低1時間、冷たいアセトンにスライドを固定します。すべてのアセトンの注入と空気乾燥の手順をドラフトで実行します。
  10. アセトンが点滅し、スライドさせて乾かします。メーカーの指示に従って調製した狂犬病直接蛍光抗体(DFA)複合体をスライドのウェルに適用し、34〜36°Cの湿度の高いインキュベーターで30分間インキュベートします。
  11. PBSのCoplinジャーでスライドをそれぞれ2分間2回洗浄します。スライドを風乾します。
  12. 0.05 M トリス、0.15 M NaCl(pH 9.0)、20%グリセロール封入剤をカバーガラスに封入し、200倍の倍率の蛍光顕微鏡でスライドを読み取り、感染性を評価します。細胞が約50%感染していない場合は、目的の感染力に達するまで、翌日に手順2.7〜2.12を繰り返します。
    注:細胞感染性は、スライドウェル上の陰性細胞と狂犬病陽性細胞の比率を視覚的に評価することに基づいて概算されます。陰性細胞は赤色に見え、陽性細胞は緑色の蛍光染色を示します。
  13. 残りのスライドをインキュベーターと湿度チャンバーから取り外します。各ウェルから上清を注意深く吸引し、スライドをPBSを含むCoplinジャーに1〜2分間入れます。スライドを約30分間風乾します。使用できる状態になるまで、スライドを-80°Cで保管してください。

3. サンプル調製

  1. 検査のために患者の血清またはCSFサンプルの希釈液を準備します。0.05%エバンスブルーを含むPBSで希釈した適切な使用濃度に必要なコンジュゲートを調製します。
    注:コンジュゲートを暗所に保管し、塗布前に蛍光色素の完全性を維持してください

4. IFAの手続き

  1. 各アッセイに必要な数の抗原スライドを取り出し、スライドを完全に解凍して乾燥させます。
  2. スライドをCoplinジャーに入れ、可燃性物質用に承認された-20°Cの冷凍庫で2時間から一晩、冷たいアセトンにスライドを固定します。スライドをアセトンから取り出し、風乾させます。
  3. 湿度を維持するために、スライドを BSC 内の湿度チャンバーボックスに置き、dH2O に浸した吸収ストリップを入れます。各サンプル希釈サンプル、コントロールサンプル、またはPBSを50 μLずつ、あらかじめ決められたウェルに添加します。
    注:各スライドには、適切な数の患者サンプルウェル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、およびPBS細胞コントロールウェルが含まれている必要があります。
  4. 密閉した湿度スライドチャンバーを37°C、5%CO2 湿潤インキュベーターに入れます。スライドを30分間インキュベートしてから、インキュベーターから湿度スライドチャンバーを取り出し、BSCに入れます。
  5. アスピレーターチップを使用して、細胞単層を乱さないように、各ウェルから上清を慎重に吸引します。滅菌スポイトピペットを使用して、各ウェルにPBSを1滴塗布します。
  6. 慎重な吸引を繰り返し、各スライドをPBSで満たされたCoplinジャーに入れ、合計15分間、2回洗浄します。
  7. スライドを加湿チャンバーボックスに戻し、適切な抗ヒト抗体コンジュゲート50 μLを各ウェルに塗布します。手順 4.4 から 4.6 を繰り返します。
  8. スライドを風乾させ、封入剤でカバーガラスをマウントし、蛍光顕微鏡でスライドを読みます。

5. スライド解析

  1. 高い抗狂犬病抗体価が確認されたポジティブコントロールサンプルと比較した染色パターンと蛍光強度に基づいてサンプルを等級付けします。
  2. サンプルをネガティブ、1+、2+、3+、4+のスケールでグレーディングし、陰性の結果は蛍光染色を示さず、4+はポジティブコントロールサンプル1と同様の染色パターンを持つ明るい緑色のリンゴ色の蛍光を表します。
    注:青リンゴの色は、FITC標識抗体にのみ適用されます。色は蛍光色素の選択によって異なります。
  3. 希釈係数で表されるエンドポイント値をサンプルに割り当て、サンプルが 1-2+ グレードを表示します。最初のアッセイでエンドポイントに達しない場合は、より高い希釈率でサンプルをテストします。

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結果

すべての血清サンプルは、PrEP後のほぼ同じ期間に患者から収集されました。サンプルは、狂犬病ワクチンの最終接種から2週間後、狂犬病ワクチンシリーズの6か月後、および狂犬病ワクチンシリーズの18か月後に、5人の異なる患者からテストされました。各血清サンプルを直列に希釈し、プロトコルステップ 5.2 および 5.3 に記載されているように、IgM と IgG の両方の存在について等級付けしました。割り当てられた抗体値は、サンプルがエンドポイントグレード1-2+に達した希釈係数を表します。

PrEP後の各時点での試験結果から、さまざまなレベルの抗体存在を検出できるアッセイの能力が実証されています。最初のワクチン接種後まもなく、 図1に示すように、患者サンプルに高レベルのIgMとIgGの両方が存在しました。明るい緑色の蛍光細胞染色の領域は、抗体の存在が陽性であることを示しています。赤血球は狂犬病陰性の細胞で、抗体が結合できません。ワクチン接種から約6カ月後、患者サンプル中のIgMとIgGの両方のレベルが有意に低下したが、IgMはほ...

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ディスカッション

IFA検査では、抗原抗体複合体を利用することで、狂犬病特異的抗体を可視化する標識部位が可能になります。神経芽細胞腫またはBHK細胞をマルチウェルPTFEコーティング顕微鏡スライドに播種し、狂犬病ウイルスラボ株CVS-11を接種します。単分子膜がコンフルエントになり、細胞が約50%の所望の感染力に達すると、スライドは使用準備が整うまで保存されます6。

患者血清またはCSFを感染細胞単層に塗布し、狂犬病特異的抗体がウイルス抗原7に付着するようにインキュベートします。洗浄手順に続いて、蛍光標識された抗ヒトIgGまたはIgM抗体を塗布し、サンプルアプリケーションからのウイルス結合抗体に結合します。標識抗体は、蛍光顕微鏡で可視化することができます。

このアッセイを実施する準備をする際は、患者サンプル、コントロール、およびコンジュゲートの最適な調製を決定することが重要です。最初の患者サンプルは、低希釈倍率でスクリーニングするか、希釈せずにスクリ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

このプロジェクトを支援してくださったニューヨーク州保健省ワズワースセンターに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25x55mmガラスカバーは、任意の
アセトン
任意の抗ヒトIgGラベル付コンジュゲートSigma-AldrichF9512
抗ヒトIgMラベル付コンジュゲートSeraCare5230-0286
ピペットチップ任意の
BHK-21細胞ATCCCCL-10をスリップします
BION IFA希釈剤MBL BIONDIL-9993
細胞培養水Sigma-AldrichW3500EGM
Coplin Jars任意の
胎児ウシ血清 Sigma-AldrichF2442EGM
FITCフィルター付き蛍光顕微鏡任意の
グリセロールSigma-AldrichG7893封入剤
Gullsorb IgM 不活性化試薬フィッシャーサイエンティフィック23-043-158IgG 不活性化試薬
L-グルタミンSigma-AldrichG-7513EGM
最小エッセンシャルメディアイーグル–w /アール'塩、L-グルタミン、および非必須アミノ酸、重炭酸ナトリウムなしSigma-AldrichM0643EGM
マウス神経芽細胞腫細胞ATCCCCL-131
マルチウェルPTFEコーティングガラススライド任意の
PBS任意のpH 7.6 
ペニシリンΣP-3032EGM
狂犬病直接蛍光抗体抱合体ミリポアシグマ5100、5500、6500、RU5100、またはRU5500
炭酸ナトリウムSigma-AldrichS-5761EGM
塩化ナトリウム結晶Sigma-AldrichS5886マウンタント
滅菌スポイト
任意ストレプトマイシン硫酸塩Sigma S9137EGM
Trizma プリセット結晶 pH 9.0Sigma-AldrichS9693マウンタント
トリプトース リン酸ブロスBD260300EGM
ビタミンミックスSigma-AldrichM6895EGM
吸引重

参考文献

  1. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
  2. Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
  3. Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
  4. Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
  5. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  6. Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
  7. Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
  8. Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
  9. Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
  10. Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
  11. Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).

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