リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016

Summary

ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。

Abstract

Lactobacillus は、261種からなる信じられないほど大きく多様な細菌属であり、そのうちのいくつかは、胃腸管内の合成生物学的努力のシャーシとして使用する可能性のある共生株でした。属内で観察された幅広い表現型と遺伝子型の多様性は、最近の再分類と23の新規属の導入につながりました。

古い属内のバリエーションの幅が広いため、あるメンバーで示されたプロトコルは、他のメンバーと宣伝されているように機能しない場合があります。特定の菌株を正確に操作する方法に関する一元化された情報の欠如は、しばしば他の細菌ファミリーから適応されたさまざまな アドホック アプローチにつながりました。これは、どの情報が選択した株に適用されるか、または適用されないかを知らない可能性のある、この分野に参入する研究者にとって問題を複雑にする可能性があります。

この論文では、特に Limosilactobacillus reuteri 株指定F275(その他のコレクション番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で、成功が実証された一連のプロトコルを、トラブルシューティングのアドバイスと発生する可能性のある一般的な問題とともに一元化することを目指しています。これらのプロトコルにより、 L. reuteri DSM20016を使用した経験がほとんどまたはまったくない研究者でも、プラスミドの形質転換、形質転換の確認、およびレポータータンパク質 を介した プレートリーダーでのシステムフィードバックの測定が可能になります。

Introduction

ラクトバチルス属は歴史的に、グラム陽性、棒状、非胞子形成、通性嫌気性菌または糖を分解して主に乳酸を生成する微好気性菌のいずれかに分類されていました¹。これらの緩い基準により、ラクトバチルスは表現型的にも遺伝子型的にも非常に多様な属になりました。この大まかな分類により、属は再分類され、2020年に23の新規属が導入され^{ました2。}

古くてより広い属には、一般的に消費に安全であると考えられている主要な共生種とプロバイオティクス種(GRAS)が含まれていました³。乳酸菌科は、さまざまな菌株の消費によってもたらされる多くの報告された健康上の利点により、「善玉菌」であるという一般の認識を維持しています4,5,6,7。彼らが胃腸管^をナビゲートできることの容易さ8と彼らの一般の受け入れは、Lactobacillaceae株を摂取可能な薬用、治療、または診断アプリケーションのためのシャーシ生物としての強力な候補として位置付けるために組み合わされます。

ラクトバチルス科内に存在する幅広い特性は、事実上のモデル生物株が存在しない状況につながっています。研究グループは、特定の目的に最も関連する特性を持つ種を選択する傾向がありました。(例えば、酪農発酵ラボでは L. lactis、野菜発酵の研究では L. plantarum 、プロバイオティクスの研究では L. acidophilus などが考えられます。

種間のこの同じ幅広い特性は、 Lactobacillaceae科 の1つのサブセットではうまく機能するかもしれないが^{、他のサブセット}で効率的に機能するために(またはおそらくまったく機能するために)最適化を必要とするプロトコルと手順の蓄積につながりました9。家族間、そして同じ種のメンバー内でさえも最適化のこの必要性は、なじみのない研究者の努力を挫折させる可能性があります。論文のメソッドセクションに掲載されたプロトコルは、それら自身の修正¹⁰を含むこともでき、断片化された分散型プロトコルコレクションにつながる。

L. reuteriは広く脊椎動物の共生動物と考えられており、哺乳類、鳥類¹¹および魚類¹²の胃腸(GI)管で一貫して見られます。L. reuteri亜株は、粘液接着タンパク質の適応を介して、特定の天然宿主により恒久的にコロニーを形成するために遺伝的に特殊化されることがよくあります8,11,13。消化管リモシラクトバチルス種は、天然宿主以外の宿主で分離することができますが、一過性の性質に向かう傾向があります⁸。

ヒトと宿主の特殊化により、 L. reuteri DSM20016は、ヒト消化管の任意の時点で診断または治療アプリケーションのためのシャーシとしての地位を非常によく位置付けており、より一時的な株と比較して、DSM20016株は介入の効果のより長い持続性ウィンドウを提供する可能性があります。

この論文では、 Limosilactobacillus reuteri (菌株名:F275、その他の収集番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で有効性が実証された一連のプロトコルの概要と、分子生物学およびシステム生物学のアプリケーションを支援するために、他のソースからの菌株に関する一元化された情報について説明します。ここに記載されている手順は、 L. reuteriの培養、電気コンピテントストックの作成、形質転換コロニーの選択、コロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR) による 形質転換の確認、および蛍光レポータータンパク質 を介した 設計されたシステム応答の測定を可能にするはずです。

関連するプロトコルは、L. reuteri (株: ATCC-PTA-6475)14 における CRISPR-Cas9 支援 ssDNA ゲノム再構成、および複数の非 L. ロイテリにおける CRSIPR-Cas9 ニッカーゼ支援ゲノム編集をカバーしていることに注目する。 ロイテリ、ラクトバチルス科の染色^15,16;ただし、これらは、ここで焦点を当てているL.ロイテリDSM20016株には対応していません。

Protocol

1. L. ロイテリDSM20016 エレクトロコンピテントセルの作製

注:これはBerthierらによるプロトコルに基づいています¹⁷、遠心分離速度はRattanachaikunsoponらによって知らされています。¹⁸.

1. 50 mL 遠心チューブで、グリセロールストックから L. ロイテリ を 6 mL のデマンロゴサシャープ(MRS)ブロスに接種します。静的インキュベーター内で37°Cで一晩好気的にインキュベートします。
2. 翌朝、一晩培養した4 mLをMRSブロス200 mL(1:50希釈)に接種します。
3. 600 nmの光学密度値(OD600)が0.5〜0.85に達するまで、静的な37°Cインキュベーターで好気的に成長させます。これには約2〜3時間かかります。
4. 適切なOD600値に達したらすぐに、培地を50 mLの遠沈管にデカントし、管のバランスを取りながら氷上に置きます。
5. 予冷した4°Cの遠心分離機で5,000 x g で5分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、各ペレットを予め冷却した(0°C〜4°C)_ddH2Oの50mLに再懸濁し、前の工程と同じ設定で再度遠心分離する。細胞をできるだけ氷の上に保ちます。
7. 手順 1.6 を繰り返します。
8. 各ペレットを25mLの_ddH2O:0.5Mスクロース、10%グリセロールに再懸濁する。5,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を氷の上に戻します。
9. 全てのペレットを同じ2mLの_ddH2O:0.5Mスクロース、10%グリセロールに再懸濁する。
10. 予冷した微量遠心チューブで50 μLから100 μLの部分に分注します。後で使用するために-80°Cで保管してください。

2. ロイテリのエレクトロポレーション

注: 次の手順では、ピペッティングをできるだけ避けてください。プラスミドを添加していないコントロールエレクトロポレーションを含めることは、抗生物質の選択が適切であることを確認することをお勧めします。

1. 電気能力のある L.ロイテリ アリコート全体を取り、氷上で解凍します。
2. 5 μLから10 μLのプラスミド(最終プラスミド濃度>6 nM)を解凍したアリコートに穏やかに混合し、ピペッティングをできるだけ避けます。
3. 氷冷した1mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移します。
4. 1.25 kV、400 Ω、および25 μFでエレクトロポレートします。
5. 室温(RT)MRSブロス1 mLを加え、キュベットを1回または2回反転させて混合します。
6. キュベットを37°Cの静的インキュベーターに2.5〜3時間入れて、回復させます。
7. 適切な選択で複数のMRS寒天プレートに全量をプレートします。
8. プレートを、小さな火のともったろうそく(「ティーライト」)と嫌気性雰囲気を生成する小袋を備えた完全に気密な容器に入れます。
9. 37°Cで2〜3日間、または目に見えるコロニーが存在するまで成長させます。

3. 耐酸性蛍光レポータータンパク質mCherry2の測定

1. 測定に必要なコロニーを選択し、1ウェルあたり1.5 mLのフィルター滅菌(非オートクレーブ)MRSブロスと適切な選択抗生物質を96ウェル保存マイクロプレートに接種します。
2. 振とうせずに37°Cで24時間好気的に一晩インキュベートします。
   注意: この保存マイクロプレートは、セクション4(コロニーPCR)で使用するために保管する必要があります。
3. L. reuteri は、固定期にあるときに培地から沈殿します。ピペッティング を介して 一晩培養を再懸濁します。
4. 200 μLを平坦で底の透明な96ウェルプレートに移し、プレートリーダーに移し、mCherry2(励起[例]:589 nm、発光[Em]:610 nm)またはその他の関連するレポーターのODと蛍光を測定します。

4. コロニーPCR による プラスミド取り込みの確認

1. セクション3の96ウェル保存用マイクロプレートから、5 μLをPCRチューブに移します。
   注:>5分が経過した場合は、 L.ロイテリ をもう一度再懸濁する必要がある場合があります。
2. ポータブルベンチトップマイクロ遠心分離機で、ペレットが見えるまでスピンダウンし(2,000 x gで約2分間)、上清を廃棄し、ペレットを20 μLの20 mM NaOHに再懸濁します。
3. 95°Cで5分間煮沸し、ボルテックスし、もう一度沸騰させます。
4. すぐにサンプルを冷やします。以下の手順では、テンプレートの分解とPCR阻害の可能性を下げるために、サンプルをできるだけ氷上に保つようにしてください。
5. ポータブルベンチトップマイクロ遠心機で2,000 x g で細胞破片がペレットになるまで2分間スピンダウンし、次に1 μLの上清を取り、99 μLの氷冷DNaseおよびRNaseを含まないddH₂O(100倍希釈)に希釈します。
6. プラスミド特異的プライマーを用いた標準的なPCR反応では、鋳型DNAとして100倍希釈を使用します。 大腸菌 ミニプレップ由来のプラスミドを有するポジティブコントロールを含む。
7. サンプルを氷上に戻し、適切なローディング染料を1倍の濃度で加えます。
8. 1%アガロースゲルをTAEバッファー(トリス酢酸エチレンジアミン四酢酸[EDTA])中で110 Vで30分間分析します。必要に応じて画像。

5. L. reuteri のミニ分取プロトコルとそれに続く PCR によるプラスミドの存在の確認

メモ: 材料表に記載されているミニ準備キットで使用することを目的としたプロトコル。

1. 適切な抗生物質を含むMRSブロス10 mLに L. reuteri を接種し、静的インキュベーター内で37°Cで一晩好気的にインキュベートします。
2. あらかじめ冷却した4°Cの遠心分離機で5,000 x g で10分間遠心分離します。
3. 後のステップを妨げる可能性のある酸性度を無効にするために、ペレットを2 mLの標準P1バッファー(キットに付属)で洗浄し、前述と同じ設定で遠心分離し、上清を廃棄します。
4. 細菌細胞を溶解するために、10 mg/mLリゾチームと100 U/mLムタノリシンを含む250 μLの改変P1バッファーにペレットを再懸濁します。37°Cで1〜2時間インキュベートします。
5. 250 μLのバッファーP2を加え、4〜6回反転させて混合し、RTで5分以内インキュベートします。
6. 350 μLのバッファーN3(キットに付属)を加え、すぐに4〜6回穏やかに反転させて混合します。
7. 10,000 x g で10分間遠心分離します。
8. できるだけ多くの上清をスピンカラムに移し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
9. スピンカラムを500 μLのバッファーPB(キットに付属)で洗浄し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
10. スピンカラムを750 μLのバッファーPE(キットに付属)で洗浄し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、60秒間遠心分離して、残留バッファーを除去します。
11. スピンカラムを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。20〜30 μLのDNAaseおよびRNAseを含まないddH 2 Oをスピンカラムのフィルターに塗布し、1〜₂分間放置してから、10,000 x g で60秒間遠心分離します。
12. プラスミド特異的プライマー(pTRKH3_pTUSeq_F:CACCCGTTCTCGGAGCA、pTRKH3_pTUSeq_R:CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA)を用いて標準的なPCR反応を行い、溶出液から鋳型DNAを提供します。 大腸菌 ミニプレップ由来のプラスミドを有するポジティブコントロールを含む。
    注:この研究で使用されたPCR設定は、98°Cで5分間、(98°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで45秒間)30サイクル、72°Cで2分間、4°Cホールドです。パラメータは、使用するポリメラーゼ、フラグメント長、およびこのプロトコルを利用する人が使用する正確なプライマーに大きく依存します。

Results

トランスフォーメーションの効率化
L. reuteriは、他のラクトバチルス科^19,20で観察されるようなdcm-/dam^-非メチル化プラスミドを必要としません(図1を参照)。10 μLの8.5 kbプラスミドpTRKH3_mCherry2(pAMβ1シータ複製起点)を用いたL. reuteri DSM20016のエレクトロポレーションは、プラスミドメチル化条件に関係なく、約80コロニー形成単位(CFU)/μg(200 μLメッキあたり5〜8コロニー)の形質転換効率をもたらすはずです。選択的硬化と再形質転換により、約4 x 10³ CFU/μg(200 μLあたり200-250コロニー)のpTRKH3_mCherry2で観察された、はるかに高い形質転換効率²¹

Discussion

L. reuteri DSM20016の形質転換のための最も重要なステップは、形質転換がプレーティングされた後の嫌気性増殖条件の生成である。好気性条件で得られたコロニーはごくまれにしかなく、MRSブロスに接種すると一般に成長しません。コロニーの成長の可能性を最大化するために、回収量全体をプレーティングすることも実施する必要があります。これらの2つの重要なステップがあっても、形質転換中に予想されるコロニーの数がプレートあたり1つまたは2つまで少なくなる可能性があるため、形質転換効率は依然として実験の限界です(図1を参照)。

市販の食品容器が最初に使用され、一貫した_O2排除には不十分であることが判明した。大学の機械工場が設計した嫌気性チャンバーのCADファイルは、補足ファイル1にあります。これらの箱は建具の小さな隙間から空気が浸透することがあるため、最初に使用する前に漏れがないか確認するために、水(密封されていない)で満たすことをお勧めします。通常、後続...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL 分光光度計キュベット	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (冷蔵遠心分離機)	Beckman Allegra	N/A	生産終了
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 エレクトロポレーションシステム	VWR	58017-984
遠心チューブ (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 ローディング色素	NEB	B7024S
エレクトロポレーションキュベット	フィッシャーブランド	FB101
エリスロマイシン	ミリポアシグマ	E5389-5G
ゲルエレクトロポレーションバス/ドック	VWR76314-748
グリセロール	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reutri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	株指定 F275
リゾチーム	BioShop	LYS702.5
微量遠心チューブ (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP を constutive, codon optimised, mCherry2 レポーターに置き換えましたたんぱく質
MRSブロス(脱水)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	ミリポアシグマ	1064691000
P100ピペット	エッペンドルフ	3123000047
P1000ピペット	エッペンドルフ	3123000063
P2.5ピペット	エッペンドルフ	3123000012
P200ピペット	エッペンドルフ	3123000055
PCRチューブ	FroggaBio	STF-A120S
パーソナル卓上型微量遠心分離機	Genlantis	E200100
ペトリ皿	VWR	25384-088
PTC-150 サーマルサイクラー	MJ Research	N/A	生産終了
pTRKH3_slpGFP (変更)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 分光光度計	サーモScientific	840-281700
保存用マイクロプレート	Fisher Scientific	14-222-225
ショ糖	BioShop	SUC507
TAE バッファー 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	終了
VWR 1500E インキュベーター VWR		N/A	終了