実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

Summary

同期時系列実験を分析する際の課題の1つは、実験によって同期からの回復の長さと細胞周期期間が異なることが多いことです。したがって、異なる実験からの測定値をまとめて分析したり、容易に比較したりすることはできません。ここでは、フェーズ固有の比較を可能にするために実験を調整する方法について説明します。

Abstract

細胞周期の調査は、多くの場合、細胞集団を同期させて、細胞が細胞周期を通過するときに時系列のさまざまなパラメータを測定することに依存します。しかし、同様の条件下でも、複製実験では、同期からの回復と細胞周期の横断に必要な時間に違いが見られるため、各時点で直接比較することはできません。実験間で動的測定値を比較するという問題は、突然変異集団または同期回復時間および/または細胞周期期間に影響を与える代替増殖条件で悪化します。

私たちは以前、細胞の同期集団がどのように同期から解放され、細胞周期を通して進行するかを監視する、細胞周期同期の喪失の特徴付け(CLOCCS)という名前のパラメトリック数学モデルを公開しました。次に、モデルから学習したパラメータを使用して、同期時系列実験の実験時点を正規化された時間スケール(生存線点)に変換できます。ライフラインスケールは、実験開始からの経過時間を分単位で表すのではなく、同期から細胞周期への進入、そして細胞周期の段階までの進行を表します。ライフラインポイントは、同期された母集団内の平均細胞の位相に対応するため、この正規化された時間スケールにより、さまざまな期間や回復時間を含む実験間の直接比較が可能になります。さらに、このモデルは、異なる種(例えば、サッカロミセス・セレビシエおよびシゾサッカロミセス・ポンベ)間の細胞周期実験を調整するために使用されているため、細胞周期測定値の直接比較が可能になり、進化の類似点と相違点が明らかになる可能性があります。

Introduction

細胞周期の進行に合わせて同期した細胞集団に対して行われる時系列測定は、細胞周期の進行を制御するメカニズムを調べるための標準的な方法です¹、²、³、⁴、⁵、⁶、^7、8.同期/リリース時系列実験間で比較を行う機能は、これらの動的プロセスを理解するために不可欠です。調査結果を裏付けるために反復実験を使用すると、結論の再現性の信頼性を高めることができます。さらに、環境条件間、変異体間、さらには種間の比較により、細胞周期制御に関する多くの新しい洞察を明らかにすることができます。しかし、同期からの回復と細胞周期の進行速度における実験間のばらつきは、反復間または細胞周期のタイミングを変更した実験間で時間ポイント間の比較を行う能力を損ないます。これらの課題のため、反復は完全な時系列に含まれないことがよくあります(例:Spellman et ^al.4)。時系列全体の反復が収....

Protocol

1. 細胞周期期および実験データの収集

1. 所望の同期法を用いて細胞周期に関して細胞を同期させる(例えば、Lemanら¹⁸に記載されるような遠心水簸またはRosebrock 19に記載されるような交配フェロモン停止;Lemanら¹⁸およびRosebrock¹⁹の両方は、同期から解放するための方法も含む)。時系列全体でサンプリングを開始し、時系列の長さが少なくとも 2 つの完全な細胞サイクル期間であることを確認し、最適には、細胞サイクルごとに少なくとも 10 個のサンプルを収集します。各時点で、以下に説明するように、細胞周期期データ(出芽またはフローサイトメトリー)用のサンプルと実験データ用のサンプルを収集します。
2. 出芽データを細胞周期相データとして使用する場合は、CLOCCSアライメントの出芽データを収集します。
   1. 時系列全体のサンプル。各時点で、細胞を収集し、Lemanらに記載されているように、200μLの超音波処理細胞培養物を200μLの固定液と混合することによってそれらを固定する¹⁸。
   2. 標準的な出芽では、40倍の対物レンズと血球計算盤を備えた透過光顕微鏡を使用して、時点ごとに少なくとも2....

Results

上記のプロトコルと 図1 のワークフローで説明したステップを5つの細胞周期同期時系列実験に適用し、異なる同期法(交配フェロモンと遠心水簸¹⁸)とシーケンシングプラットフォーム(RNAシーケンシング[RNA-seq]とマイクロアレイ)の反復間、および実験条件全体の2つの代表的な比較を示しました。 S. cerevisiaeを用いて複数の実験を行い、各実験について細胞周期期および実験データを収集した。このワークフローでは、CLOCCSを使用してさまざまな同期/リリース時系列実験をパラメーター化し、これらのパラメーターを使用して実験を共通の比較可能なライフラインスケールに調整し、これらの調整された実験を2つの代表的な比較に使用します。

反復間の代表的な比較を実証するために、条件1と呼ばれる、同じ菌株および同じ実験条件で実施された3つの実験を選択しました。これらの実験のうち2つは互いの直接複製であり、両方ともマイクロアレイ分析 によって 分析され、.......

Discussion

本論文では、同期した細胞集団に関する時系列実験のデータをより正確かつ定量的に評価する方法を提示する。この方法は、出芽データやフローサイトメトリーDNA含量データなどの入力細胞周期相データを使用するベイズ推論モデルであるCLOCCSから学習したパラメータを利用して、各実験をパラメータ化します^14,15。CLOCCSは、入力された細胞周期フェーズデータを使用して各実験のパラメータを推測し、共通のライフラインスケールへのアライメントに使用されます。複数の同期/リリース時系列実験を単一のライフラインに合わせた時間スケールに変換することで、以前は困難または不可能であった実験と複数の反復実験の集約との間のフェーズ固有の関連性のある比較が可能になります。

このプロトコルの重要なステップには、データの収集、CLOCCSの実行、データセットのアライメント、およびデータセット間の比較が含まれます。まず、このプロトコルで使用するためにデータを収集する必要があります。データは、対象とする問.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			。Leman 2014に記載されている。
固定液用の	4%ホルムアルデヒド
100%エタノール			フローサイトメトリーの固定用。Haase 2002に記載されている。
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
フローサイトメーター			フローサイトメトリーのプロトコル用です。
Git
https://git-scm.com/ Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
顕微鏡			細胞や芽を数えるため。
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Proteaseの解決			フローサイトメトリーのプロトコルのため。Haase 2002に記載されている。
RNAse A溶液			フローサイトメトリープロトコル用。Haase 2002に記載されている。
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	フローサイトメトリー染色用。Haase 2002に記載されている。
トリス			pH 7.5