光刺激グリッドを用いた光遺伝学的タンパク質の細胞分布のマッピング

Summary

このプロトコルでは、cAMPセンサーと光遺伝学的タンパク質であるbPAC-nLucをトランスフェクションして、その細胞内分布と光刺激に対する応答を正確に追跡します。ポイントスキャンシステムを使用してcAMP応答マップを作成する革新的なアプローチは、さまざまな分野の光遺伝学的タンパク質の研究を前進させる可能性を秘めています。

Abstract

私たちの目標は、光遺伝学的タンパク質の細胞分布を正確に追跡し、特定の細胞質位置内でのその機能を評価することでした。これを達成するために、核標的cAMPセンサーと、研究室で開発された光遺伝学的タンパク質である細菌の光活性化可能なアデニルシクラーゼ-ナノルシフェラーゼ(bPAC-nLuc)と細胞を共トランスフェクトしました。bPAC-nLucは、445 nmの光またはルシフェラーゼ基質で刺激すると、アデノシン3',5'-環状一リン酸(cAMP)を生成します。ポイントスキャンシステムに接続された固体レーザーイルミネーターを採用し、HC-1細胞の細胞質全体に小さな照明スポット(~1 μm²)のグリッド/マトリックスパターンを作成することができました。これにより、核を標的とするbPAC-nLucの分布を効果的に追跡し、包括的なcAMP応答マップを生成することができました。このマップは、bPAC-nLucの細胞分布を正確に表しており、光刺激に対するその応答は、照射されたスポットのタンパク質の量によって変化しました。この革新的なアプローチは、細胞の光遺伝学的タンパク質の研究に利用できる技術のツールキットの拡大に貢献しています。その分布と応答を高精度にマッピングする能力は、幅広い可能性を秘めており、さまざまな研究分野を進歩させる可能性があります。

Introduction

神経科学に革命をもたらしたツールとして生まれたオプトジェネティクスは、現在、世界中の多くの研究室や生物学のさまざまな研究分野で日常的に使用されている成長中の研究分野であり、新興技術となっています。私たちは、Beggiatoa sp.(細菌の光活性化可能なアデニルリルシクラーゼ;bPAC)の光感受性アデニリルシクラーゼ(AC)をナノルシフェラーゼ(nLuc)^{1,2,3)に融合させることにより、汎用性の高い光遺伝タンパク質であるbPAC-nLucを開発しました}。青色光で刺激されると、bPACはセカンドメッセンジャー3',5'-環状アデノシン一リン酸(cAMP)を生成します。nLucは最近開発された小さなルシフェラーゼで、その基質の1つが存在すると、生物発光を生成し、cAMP産生を活性化することができます⁴。したがって、この光遺伝学的タンパク質は、短い光パルスを使用して一過性に活性化するか、またはフリマジンや他のルシフェラーゼ基質と安定的に活性化することができ、さまざまなcAMPシグナル伝達パターンを模倣し、細胞応答(転写因子の活性化、遺伝子発現、細胞増殖、遊走など)を評価することができます。近年の^2ndメッセンジャーシグナル伝達の進歩により、非常に制限された細胞質領域で発生する事象の重要性が強調されています(例えば、cAMP応答要素結合タンパク質(CREB)リン酸化のためのエンドソームcAMP産生、または活性化T細胞の核因子(NFAT)の核への転座のためのCa²⁺マイクロドメインなど)^5,6.したがって、生細胞のこれらのコンパートメントからのシグナル伝達を評価、模倣、およびブロックするための一貫した体系的な戦略を開発することが重要です。bPAC-nLucが異なる細胞コンパートメントで特異的に活性化される能力を示すために、肝腫由来細胞株(HC-1)を核標的bPAC-nLucおよびH208、Förster共鳴エネルギー移動(FRET)cAMPセンサー(NLS-bPAC-nLuc;NLS-H208)です。HTC株に由来するHC-1細胞は、アッセイ可能なAC活性を欠いているため、基礎cAMPレベルが非常に低いため、FRETセンサーの全ダイナミックレンジを利用しながら推定cAMP産生を測定するのに理想的です^7,8。ポイントスキャンシステム(UGA-42 Geo、Rapp OptoElectronic)に接続された固体レーザー(445 nm、LDI-7、89 North)を使用して、個々の細胞内の非常に小さな円形領域またはスポット(~1 μm²)を系統的に刺激するプロトコルについて説明します。ポイントスキャンシステムは、2デッキ顕微鏡のバックポートの1つに接続されていたため、独立した光路を介して細胞の刺激とFRET測定を同時に行うことができました。このプロトコルでは、Rapp OptoElectronicの刺激システムに付属のSysCon Geoソフトウェアを使用して、細胞の細胞質の包括的なスキャンを実行する方法を紹介します。このアプローチでは、グリッドパターンで細胞を刺激する一連の照明を設定することにより、cAMP応答マップを生成します(図1)。

Protocol

1. HC-1細胞の培養とイメージングの準備

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 IU/L)、ストレプトマイシン(100 mg/L)、およびL-グルタミンを添加したDMEMでHC-1細胞を10 cmディッシュに保持し、37°C、5% CO₂、95%加湿空気中でインキュベー
トします。
2. 細胞が ~90% コンフルエントになったら、1:5 または 1:10 の希釈液を使用して、2 〜 4 日ごとに細胞を継代します。
3. 実験の2日前にガラスカバースリップにトランスフェクション用の細胞を播種します。
   1. 予め加温した培地とPBSを使用した組織培養フードで無菌条件下で作業し、細胞のほぼ合流皿から培地を吸引し、5mLのPBSで穏やかに洗浄します。
   2. PBSを吸引し、トリプシン1mLを追加します。.細胞が剥離するまで、37°Cで3〜5分間インキュベー
   トします。
   3. 細胞を4 mLの培地に再懸濁し、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
   4. 血球計算盤を使用して細胞の数をカウントし、細胞密度を計算します。
   5. 細胞を1.5 x 10⁴細胞/mLの密度に希釈します。
   6. 2 mLの細胞懸濁液を、ポリD-リジンコーティングを施した25 mmガラスカバースリップに6ウェル皿でピペットで移します。
   7. インキュベーター内で細胞を約24時間インキュベートし、70%がコンフルエントするまでインキュベートします。
4. トランスフェクション試薬3 μLあたり0.25 μgのNLS-bPAC-nLuc DNA/0.75 μgのNLS-H208 DNAと、フェノールレッドを含まないOpti-MEM培地で希釈したP3000試薬2 μLの比率で、製造元の指示に従ってトランスフェクションキットを使用して細胞をトランスフェ
クションします。
5. 細胞をインキュベーターに~48時間置くことで、検出可能なレベルのcAMP.
   を産生するために不可欠なbPAC-nLucの十分な発現を確保します。 注:bPAC-nLuc発現の最小必要レベルは、刺激システムの効力と刺激のパラメータによって異なります。
6. イメージング用のカバースリップ上に細胞を準備します。
   1. 1つのウェルから培地を吸引し、2mLのPBSで2回洗浄します。
   2. 一対の鉗子を使用してカバーガラスを慎重に持ち上げ、イメージングチャンバーに入れます。
   3. フェノールレッドを欠くOpti-MEM 1 mLをイメージングチャンバーに加えます。細胞は、HBSSまたはその他の生理学的蛍光適合溶液でイメージングすることもできます。

2. 光シミュレーションとライブセルイメージング

1. NLS-bPAC-nLucを発現する細胞の暗所での培養と操作を行います。<500 nmの波長への曝露を避けるには、赤色のセーフライトランプ(材料表)と13 Wの琥珀色のコンパクト蛍光電球(材料表)を使用します。
2. 6ラインマルチLEDライトエンジン(Table of Materials)、発光フィルターホイール(Table of Materials)、XYステージ(Table of Materials)、ORCA-Fusion Digital CMOSカメラ(Table of Materials)、100x/1.4NA対物レンズ(∞/0.17/FN26.5)を搭載した電動2デッキ顕微鏡(Table of Materials)で実験を行います。デジタル顕微鏡ソフトウェア(Table of Materials)を使用して画像をキャプチャします。このセットアップは、ZT458rdcダイクロイックフィルター(材料の表)に付属の独立した光路を使用して、細胞の刺激とFRET測定を同時に実行できます。
   注:互換性のあるセンサーによる光遺伝学的刺激とFRET/インテンシオメトリックイメージングを同時に行うことができる場合は、どのような取り込みセットアップでも使用できます。
3. UGA - 42 Geosystemの電源を入れます。顕微鏡の電源を入れ、H208 FRETセンサーで取得するための適切なパラメーターでセットアップします。取得構成は、FRETセンサーの発現レベルによって異なります。一般的なパラメータは、YFP/mScarletIのシミュレーション時間が40ms、LED電力が15%、Hzが0.5Hzです。
4. SysConソフトウェアと顕微鏡を制御するイメージングソフトウェアを開きます。
5. カメラウィンドウで、キャリブレーションタブを選択し、光遺伝学的タンパク質と互換性のあるレーザー波長を選択します。bPAC-nLucを刺激するには、445nmの波長を使用します。
6. 毎回使用する前に、システムを校正してください。セットアップの小さな変化や、室温(RT)の変化でさえ、刺激の精度を変える可能性があるため、これは重要です。
7. カメラウィンドウで、[カメラ]タブを選択し<取得の開始>をクリックして、想像ソフトウェアからの取得を開始します。
8. Image Viewerウィンドウで、イメージングソフトウェアから取得した細胞の蛍光のライブまたは以前の取得を視覚化し、刺激オブジェクトの位置をガイドします。
9. クリック&ファイアモードを使用すると、実験を開始する前に個々の細胞の応答性を迅速に評価できます。
10. 「Sequence-Manager」ウィンドウを使用して、「を選択し、新しいシーケンスを作成します。
    注:適切なシステムキャリブレーションを確認するには、Image Viewerウィンドウでさまざまな形状とサイズを描画します。これらは、細胞に投影される刺激パターンに正確に対応し、意図したデザインとの正確な位置合わせを確保する必要があります。
11. Image Viewer ウィンドウ で、左側のツールバーにある円形アイコンを選択して、円形の刺激オブジェクトを描画します。
12. 複数の小さな同一の円を作成し、それらを均等に分散させて、刺激する細胞の細胞質全体を均一にカバーします。
13. それぞれを右クリックして、円形刺激オブジェクトの均質性を確認します。ウィンドウが表示されます。それを使用して、半径、位置などを調べます。
14. 半径は、使用する目標とセルのサイズに応じて、1 から 5 の間で設定します。
15. 円の間隔と配置を均等にするには、[表示] サブウィンドウの <グリッドにスナップ> ボタンを使用します。さらに、 ボタンを使用してグリッドのプロパティを設定します。
16. 等間隔に配置された円形刺激物体のグリッドまたはマトリックスがセルを完全に覆い、そのサイズ(6 x 6または10 x 10など)がセルのサイズによって決定されることを確認します。細胞イベントをトリガーしないヌル刺激のコントロールとして、細胞の外側に配置されたいくつかの円を含めます。
17. 「Image Viewer」ウィンドウで作成した各オブジェクトは、「Timeline」ウィンドウに表示されます。
    1. [オブジェクトタイミング]サブウィンドウで、各スティミュレーションオブジェクトの時間プロパティ(開始時間、持続時間、遅延)を設定します。
    2. [Lightsource] サブウィンドウで、各オブジェクトの波長と強度を設定します。このプロトコルでは、各オブジェクトが同じ波長を使用し、持続時間と強度が同じであることを確認してください。開始時間はオブジェクトごとに異なり、それらの間の遅延は、異なる刺激の影響が重ならないように、予想される結果に応じて変更できます。
18. タイムラインウィンドウで、必要に応じて各スティミュレーションオブジェクトをアクティブにするシーケンスを変更します。特定の実験に応じて、通常のパターン(左から右、上から下など)またはランダムなパターンで刺激を設定します。
19. シーケンスをシステムにアップロードし、システムが実行するシーケンスサイクル (実行) の数を設定します。
20. イメージングソフトウェアの関心領域(ROI)を目的の位置に配置します。
21. 顕微鏡で蛍光画像の取得を開始し、UGA-42ウィンドウで<再生>を押します。

3. データ分析

1. 刺激システムが提供するソフトウェアでは、シーケンスを後で使用するために保存することができますが、実際の実験情報は記録されません。したがって、実験中に使用された刺激スポットとシーケンスに関連するすべての詳細を、位置、強度、持続時間、実行回数などのパラメーターを含めて、細心の注意を払って文書化します。薬理学的薬剤や特定の溶液など、その他の関連する実験条件を文書化します。
2. 実験中に、指定されたROIをイメージングソフトウェアに配置して、細胞全体または細胞内の特定の位置からの蛍光強度の変化を捕捉します。
3. 刺激スポットに対するROIの位置に特に注意してください。刺激された領域内または刺激領域から離れた蛍光強度の変化を測定します。実験後にROIの位置を調整し、ROI強度値だけでなく、実験中に取得した画像を保存できるイメージングソフトウェアを提供します。

Results

図1で示された結果は、細胞核に向けられた刺激のみが測定可能なcAMP上昇を生成することができたことを示しています。このことから、NLS-bPAC-nLucはHC-1細胞の核コンパートメント内でのみ発現していることが確認されています。このグリッド/マトリックスパターンを使用して光遺伝学的タンパク質を正確に刺激し、その細胞内分布をマッピングすることが可能です。さらに、核中心に向かってcAMPの高度が高いことは、核周辺に配置されたものと比較して、中心スポットによってシミュレートされたbPAC-nLucの質量が高いことを反映しています(図1)。

図1:グリッド刺激プロトコルとcAMP応答マップ。NLS-H208(cAMPセンサー)およびNLS-bPAC-nLucをトランスフェクトしたHC-1細胞に対する連続的な青色光刺激(445 nm、パルス間隔30秒、パルス列:50 ms、合計持続時間500 ms、10 Hz、レーザー出力7%)。左のパネルは、H208の黄色蛍光タンパク質(YFP)蛍光を、sCMOSカメラで捉えた実際の光パルスと重ね合わせて1枚の画像に表示したものです。右側のトレースは、各刺激スポットでのNLS-bPAC-nLuc刺激によって引き起こされる一過性のcAMPの増加を示しています。バックグラウンドを差し引いたNLS-H208蛍光を、全核をカバーする単一のROIを用いて測定し、正規化比(R/R0)を算出しました。外側の領域(行1と7、列AとG)の回答は陰性であり、表示されていません。Bar = 3 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

この研究の目的は、光遺伝学的タンパク質の細胞内分布を正確に監視し、特定の細胞質コンパートメント内でのその性能を評価することでした。また、光遺伝学的タンパク質を発現する細胞に対するポイントスキャンシステムの精密な刺激能力も示しました。これを達成するために、発現レベルは高いが、核に限定された分布が非常に限定された核標的bPAC-nLucを採用しました。結果は、光遺伝学的タンパク質の細胞分布に応じて、わずか~1μm離れた刺激スポットがcAMP産生を引き起こすかどうかのいずれかを示しました。核に向けられた刺激のみがcAMPレベルを上げることができました。このプロトコルでは、目標は、局所的なcAMP上昇を生成することではなく、短時間の光刺激が周囲のタンパク質を刺激することなく、細胞の非常に制限された領域で光遺伝学的タンパク質を活性化するのに十分な精度を示すことでした。ただし、このアプローチは、びまん性分布を有する他の光遺伝学的タンパク質の研究および/または局所的なcAMP上昇の生成に必要な制御を構成します。これは、光遺伝学的タンパク質の発現レベル、刺激の強度と頻度などを変えることによって達成できます。これらの局所的な信号を正確に測定するには、取得パラメータとセンサー特性を慎重に考慮することが重要です。これには、適切なROI位置とサイズの選択、取得周波数の決定、最適な親和性、強度、ダイナミックレンジ、解離定数を備えたFRET/強度センサーの選択が含まれます。

最近発表された論文では、同様の戦略を使用して、核標的bPAC-nLucの分布と、甲状腺由来^細胞株のcAMP上昇を廃止する修飾ホスホジエステラーゼ(PDE;ΔRI-PDE8)の能力を機能的に実証しました9。本稿では、グリッドではなく直線に沿って細胞刺激を行い、照明スポットは体系的なパターンではなく、細胞のランドマーク(核中心、核端など)を基準に配置しました。驚くべきことに、核端に向けられた刺激でさえ、検出可能なcAMP応答を引き起こすには不十分でした。これはおそらく、NLS-bPAC-nLuc⁹の不十分な質量を刺激したためであると推測しました。しかし、本プロトコルでは、核端の近傍に向けられたいくつかの刺激は、検出可能なcAMPの増加を誘発した。この不一致は、bPAC-nLucの発現レベル、刺激の特性、核の形態、内因性偏微分方程式、緩衝タンパク質の存在など、さまざまな要因に起因する可能性があります。

他の標的または非標的光遺伝学的タンパク質はより拡散分布を示す可能性がありますが、この体系的なアプローチは、実験を慎重に設定し、データを分析することで、有意義な結論を導き出すことをサポートします。さらに、このアプローチにより、特殊な細胞構造(層状足、樹状突起、初代繊毛など)を標的とすることができ、これらの構造および/または細胞体の遠位および近位領域における応答の比較が容易になります。

この戦略は、プロテインキナーゼA(PKA)やcAMPによって直接活性化された交換タンパク質(EPAC1)など、cAMP経路の下流要素の活性化を評価するためにも使用できます。さらに、bPAC-nLucは、タンパク質や他の因子との局所的な相互作用によって影響を受ける可能性のある内因性ACと同じモジュレーターの影響を受けないため、同じレベルの発現が与えられた場合、一貫して同じ量のcAMPを生成すると想定できます。このアプローチは、cAMP 上昇の減少または一時的な上昇後の cAMP レベルの低下を調べることにより、cAMP の分解、拡散、または内因性またはトランスフェクトされた PDE の機能と分布の評価を可能にします。この戦略は、さまざまな細胞位置での光遺伝学的タンパク質の挙動を評価するのに特に有用であることが証明されており、細胞質内に刺激スポットを任意に配置することによるバイアスを回避するのに役立ちます。

刺激スポットのサイズとそのエネルギーは、最終的には使用するセットアップの特定の特性(光路、対物レンズ、スキャンシステムなど)に依存することを考慮に入れることが重要です。正確な結果を得るためには、光遺伝学的タンパク質の相対的な発現、使用される波長に対する細胞の感度、およびその他のパラメーターを、特定のシステムごとに各実験を行う際に考慮する必要があります。また、より小さな細胞構造をより正確に体系的に評価するために、より小さな刺激スポットおよび/またはより密度の高いグリッド(つまり、より間隔の少ない刺激スポット)を実装する際に、システムを駆動できる範囲を完全に研究していないことに注意することも重要です。さらに、UGA-42 ジオ ポイント スキャン システムのみを使用してこの戦略をテストしました。このアプローチは、等間隔の局所スポットを再現可能に生成できる限り、さまざまなシステムを使用して可能である可能性があります。同様の結果が得られるように、各システムを最適化する必要があります。

最後に、刺激システムによる FRET センサーの潜在的な刺激を慎重に評価する必要があります。例えば、シアン蛍光タンパク質(CFP)は、このプロトコルで使用される445nmレーザーによって確実に刺激され、さらには漂白されます。より高いレーザー効力 (またはより高い透過率の中性密度 (ND) フィルター) を使用すると、蛍光センサーが刺激され、実験に誤った情報が導入されたり、データ分析に問題が生じたりする可能性が高まります。FRET/強度センサーの通常の光退色も慎重に評価する必要があります。最後に、bPACは周囲光に敏感であり、暗い条件下でもcAMPを生成する可能性があるため(bPACの暗活性はタンパク質³の33 ± 5 pmol/min/mgとして測定されています)、bPAC-nLUCをトランスフェクトした後は、光汚染を避けるために細胞を慎重に操作する必要があります(例えば、インキュベーターで、実験前および/または実験中など)。任意選択で、細胞をPDE阻害剤(例えば、3−イソブチル−1−メチルキサンチン;IBMX¹⁰)を使用して、bPAC-nLucのベースライン活性を決定し、使用される照明条件が適切に暗いことを確認します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13 W琥珀色のコンパクト蛍光電球 - 低ブルーライトフォト	ニック開発
3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)	Sigma	I7018
6ラインマルチLEDルーメンコールSpectra X	Lumencor		6ラインマルチLEDライトエンジン
コーニング - DMEM	サーモフィッシャー	MT10013CMEA
コーニング - 定期的なウシ胎児血清	サーモフィッシャー	MT35011CV
カバーメガネ:サークルサー	モフィ	ッシャー12545102P
GBX-2ダークレッドセーフライトフィルター5.5インチ	コダック	1416827	赤色のセーフライトランプ
ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) 10x	サーモフィッシャー	14185052	1x に希釈、調整された pH
LDI-7	89 North
L-Glutamine	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	Thermo Fischer	L3000001	トランスフェクションキット
オリンパスIX83電動 2デッキ 顕微鏡	オリンパスの		電動2段式顕微鏡
Opti-MEM、フェノールレッド不使用	サーモフィッシャー	11058021
ORCA-fusionデジタルCMOSカメラ	浜松	C14440-20UP
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	サーモフィッシャー	15140122
リン酸緩衝液 (1x)	ロンザ	17516F
Prior emission filter wheel and filter sets	Prior Scientific, Inc.		エミッションフィルターホイール
前 プロスキャンXYステージ	プライアーサイエンティフィック社		XYステージ
Slidebook 6	Intelligent Imaging Innovations		デジタル顕微鏡ソフトウェア
SysCon ソフトウェア	SysCon ソフトウェア
UGA-42 ジオ	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA オイル対物レンズ (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc 二色性	Chroma Technology Corp		BS、波長(CWL): 498 nm