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方法論記事

食道扁平上皮がんに対する大要の開発

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DOI:

10.3791/65480

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2024年4月12日

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、癌の重大な分子変化を特定するための有用なツールを説明し、食道扁平上皮癌の新しい診断および治療アプローチの開発につながります。

要約

食道がん(EC)は、最も侵攻性の高い悪性腫瘍の8位 にランクされており、早期発見を促進するバイオマーカーがないため、その治療は依然として困難です。ECは、腺がん(EAD)と扁平上皮がん(ESCC)の2つの主要な組織型で発現し、どちらも地理的に異なる集団間で発生率にばらつきを示します。ハイスループットテクノロジーは、がんを含む疾患の理解を変革しています。科学界にとって大きな課題は、文献に散在するデータを扱うことです。これに対処するために、公開されているマイクロアレイデータセットの解析と、がんと正常状態との間の差動制御分子の収集のための簡単なパイプラインが提案されています。このパイプラインは、がんと正常組織間、または異なるがんサブタイプ間で差次的に発現する遺伝子を同定する、差次的遺伝子発現解析の標準的なアプローチとして機能します。パイプラインには、データの前処理(サンプル間の技術的なばらつきを取り除くための生の遺伝子発現データの品質管理と正規化を含む)、差次的発現分析( t検定などの統計的検定を使用して、2つ以上のサンプルグループ間で差接する遺伝子を特定する)を含むいくつかのステップが含まれます、ANOVA、または線形モデル)、機能解析(バイオインフォマティクスツールを使用して、発現差のある遺伝子の濃縮された生物学的経路と機能を特定する)、およびバリデーション(独立したデータセットまたはqPCRや免疫組織化学などの実験的方法を使用したバリデーションを含む)。このパイプラインを使用すると、食道がんを含むあらゆる種類のがんに対して、差次的に発現する分子(DEM)のコレクションを生成できます。この大要は、がんの潜在的なバイオマーカーと薬剤標的を特定し、疾患の根底にある分子メカニズムの理解を深めるために利用できます。さらに、このパイプラインを使用した食道がんの集団特異的スクリーニングは、異なる集団の特定の薬物標的を特定するのに役立ち、疾患の個別化治療につながります。

概要

ECが世界で8番目に多いがんであり、死因の第6位であることは憂慮すべきことです。中国、インド、イランは、驚くほど高い発生率と死亡率を示しています。ECには、食道腺がん(EACまたはEAD)と食道扁平上皮がん(ESCC)の2つの主要なタイプがあります1。EACは西洋諸国でより一般的ですが、ESCCは東側諸国、特に中国とイランでより一般的です2。ECには、タバコやアルコールの使用、肥満、胃食道逆流症(GERD)など、いくつかの危険因子が関連しています。さらに、果物や野菜の不足、温かい飲み物や食品の消費などの食事要因は、リスクの高い地域でのESCCリスクと関連しています。早期の診断と治療は、EC 3,4 患者の転帰を改善するために重要です。そのため、ECのリスク因子や徴候、症状に対する意識を高め、ハイリスクな人の定期的なスクリーニングを促すことが大切です。さらに、タバコやアルコールの使用、不健康な食生活など、修正可能なリスク要因に対処する努力は、ECの発生率を減らすのに役立つ可能性があります。これは、胃酸と内容物が食道に戻るGERDと関連していることがよくあります。対照的に、ESCCは、食道の上部を覆う平らで薄い細胞から発生します5。中国やイランなど、タバコやアルコールの使用が広まっている地域でより一般的です。

食道に関連するさまざまな状態の中で、食道の内壁が腺細胞に置き換わる状態であるバレット食道(BE)は、EAC6の前駆体として知られています。BEはGERDなしで発症する可能性があることは注目に値しますが、GERDの存在はBEを発症するリスクを3〜5倍増加させます。さらに、BEの存在はEACを発症するリスクを50〜100倍増加させます7。さらに、温かい食べ物や辛い食べ物や液体はESCCに関連していますが、EACには関連付けられていません。ECのリスク要因を理解することは、ECの予防と早期発見のために重要です。タバコの使用、アルコール摂取、肥満、不健康な食生活など、修正可能なリスク要因に対処する努力は、ECの発生率を減らすのに役立つ可能性があります。さらに、嚥下障害(BE)などの高リスク者に対する定期的なスクリーニングとサーベイランスは、早期発見と治療を可能にすることで転帰を改善する可能性がある。

ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メチロミクス、ミラルアオミクス、メタボロミクスなどのオミクス主導の研究が、EC、特にESCC 8,9,10,11,12,13の理解に大きく貢献していることは確かです。これらの研究により、ESCCの発症と進行に関与する新規バイオマーカー、潜在的な治療標的、および新しい経路の特定が可能になりました。しかし、これらの研究から得られたデータは文献全体に散らばっているため、科学界がこの情報にアクセスして使用することは困難です。したがって、特定のがんに関するハイスループットまたはロースループットの研究から得られたデータをまとめたリポジトリまたはデータベースを作成することが重要です。このようなパッケージは、いくつかの基本的なガイドラインを実装することで合理化および作成できます。これらのガイドラインには、関連する研究の選択、これらの研究からのデータの抽出と整理、データの品質と一貫性の確保が含まれます。さらに、大要は定期的に更新して、新しい研究やデータが利用可能になったときにそれらを含める必要があります。研究者は、単一のプラットフォームを使用して、さまざまな研究のデータを組み合わせた大要またはデータベースを作成することにより、特定のがんに関するデータを取得および分析できます。これにより、研究活動が加速し、最終的にはがん患者にとってより効果的な治療とより良い結果につながります。

がん大要の開発には、ロースループット研究とハイスループット研究の両方のデータが組み込まれています。この大要は、がんの潜在的な診断または治療標的を特定しようとしている研究者にとって貴重なリソースになります。このコレクションを構築する1つの方法は、Gene Expression Omnibus(GEO)などの一般にアクセス可能なリポジトリで利用可能なマイクロアレイ研究をレビューすることです。マイクロアレイ研究は、がん細胞の遺伝子発現レベルに関する情報を提供することができ、これらのデータを使用して、がんの発生と進行に関与する可能性のある差次的に発現する遺伝子(DEG)を特定することができます。

ただし、研究が異なれば、データの分析方法も異なる可能性があり、それが異なるDEGの特定につながった可能性があることに注意する必要があります。したがって、各研究を慎重にレビューし、大要のデータをプールする際には、潜在的なバイアスや制限を考慮することが重要です。データが共通のプラットフォームで収集されると、研究者はそれを使用して、さらなる研究のための潜在的な分子標的を特定できます。これには、臨床サンプル中の特定の遺伝子の発現を調べたり、特定の遺伝子やタンパク質ががんの発生や進行にどのように関与しているかを理解するための機構研究を実施したりすることが含まれます。全体として、がんデータセットの作成は、がん研究者にとって貴重なリソースとなり、診断や治療介入のための新たな標的を特定するのに役立ちます。

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プロトコル

1. ESCCにおける差動制御分子の手動キュレーション

  1. PubMedを使用した関連するロースループット研究の検索
    注: 低スループットと高スループットの手法の基本的な違いを理解することが重要です。前者では、限られた数のサンプルのみが研究され、プロセスは通常時間がかかりますが、対照的に、後でより速く、サンプル数を一度に分析できるため、ノーザンブロットなどのロースループット法よりも大幅に多く、ウェスタンブロットはロースループット技術であり、cDNAマイクロアレイ、およびLC-MS / MSベースの定量的プロテオミクスはハイスループット技術です14。NCBI-PubMed( 資料表を参照)のような検索エンジンは、生物医学科学者がESCCのようなあらゆる疾患に関する文献を見つけるための公的に利用可能なリソースであるため、あらゆるがんに関連する研究を見つけるための優れた情報源です。関連する研究を見つけるには、以下のステップを踏む必要がある。
    1. Google検索エンジン(資料表を参照)をクリックして開きます。これは、PubMedにインデックスされていないジャーナルがあるにもかかわらず、質の高い記事であるため、研究者によっても使用されます。重要な記事を見逃す可能性を無効にするために、複数の検索エンジンを検索することは常に良いことです。
    2. PubMedの検索バーを選択し、ブール演算子(AND、OR、NOT)を使用します。ブール演算子は、研究者が結果を見つけるために使用する関連キーワードに検索者を絞り込みます。

2. PubMedを使用して関連する研究を見つける

  1. NCBIのウェブアドレス(資料表を参照)を入力し、クリックして開きます。
  2. 左側のサイドバーメニューから[すべてのデータベース]タブから[PubMed]を選択します。
  3. 検索バーに関連 キーワードを入力すると、関連する記事が取得されます。キーワードは、問題の癌/疾患(食道扁平上皮癌など)に密接に関連する記事を取得するのに役立つ可能性があるため、ブール演算子と組み合わせて使用する必要があります。

3. 遺伝子発現オムニバス(GEO)を用いた関連研究の探索

注:Gene expression Omnibus(GEO)は、DNAマイクロアレイにデータを保存するための無料で利用できるリポジトリです。GEOで利用可能な大量のデータは、がん/疾患と正常状態の間で異なる制御分子を特定するためのデータマイニングに適したリソースです。

  1. GEOを入力します web アドレス(資料の表を参照)をクリックし、クリックして開きます。
  2. 食道扁平上皮がんとホモサピエンスと入力し、Enterキーを押します。
    注:がんの差次的に制御される遺伝子の大要を作成するには、研究者ががんと正常状態の間で差次的に調節される分子を選択する関連研究を選択することが重要です 。 主な側面は、倍率変化に基づいて分子を選択するための基準を設定することです。フォールド変化は、遺伝子/タンパク質がアップレギュレーションされているかダウンレギュレーションされているかを示します。フォールドの変化と p値のカットオフ値は、マイクロアレイRNAseqやプロテオミクス研究15を含む特定の実験におけるデータの意味を大幅に変える可能性があります。

4. GEO2Rを用いたマイクロアレイ解析

注:まず、ブール演算子(AND、OR、NOT)を使用して関連する研究を見つけることです。これらは、「食道扁平上皮がん」、「ESCC」、または「食道扁平上皮がん」というキーワードと組み合わせて使用 されます。GEO2R( Table of Materials参照)は、GEOと統合された無料のR言語パッケージで、ユーザーはマイクロアレイ研究のデータをユーザーフレンドリーな方法で分析することができます。GEO エントリ ID と対話し、バックエンドの Bioconductor R パッケージを使用して DEG を識別するための複雑な R ベースの解析を実行するためのインターフェイスを提供します。このパッケージは、GEOデータを変換するだけでなく、その出力を.txtテーブルの形で表示し、ユーザーのニーズに応じてさらに変更することができる16。GEO2Rパッケージは、 p値に基づく統計的有意性の順序で遺伝子を表示しますが、その順序は対数2倍の変化に基づいて並べ替えることができます。また、遺伝子発現プロファイルをGEOプロファイル画像として閲覧することができます。他の解析ツールとは異なり、GEO2Rは選択したデータセットレコードから独立しており、研究者が提出した実際のデータを直接調査することができます。GEO研究の90%以上がこの方法を使用して分析できます17。 図1に、GEO2Rを使用したマイクロアレイデータの解析に関連するステップを含むGEO2Rのワークフローを示します。

  1. GEO2RのWebサイトを開きます。
  2. 「GEO accession」とラベル付けされたサーチスペースに GEO を使用して GSE アクセッション を入力し、 Set ボタンをクリックします。 ラベル癌 を作成し、 次に正常にします。
  3. タイプに基づいてサンプルを割り当てるには、最初に Cancer を割り当て、次に Normal を割り当てます。
  4. デフォルトのパラメータを変更せずに [分析 ]をクリックします。
  5. 全遺伝子リストをクリックし、.tsvファイル形式でデータをダウンロードします。.tsv は、データをさらに処理する前に .xlsx に変換する必要があります。
  6. Excelで数式[=(2)^(Nx)、Nはセルの位置]を使用して、log2のfold changeをfold changeに変換します。
  7. さらに、ステップ4.6で得られたデータを対象とすると、5%の偽発見率(FDR)または調整されたp値(調整済みp値)<0.05を適用し、アップレギュレーションされた遺伝子については>2.0倍の変化、ダウンレギュレーションされた遺伝子については<0.5倍の変化を適用することにより、DEGを得る。
    注:FDRは、多重検定を説明するために p値に適用される補正であり、これら2つを互いに同義として扱うことはできません。FDRの調整は、多数の仮説検定を実行する際に誤発見の割合を制御するために重要です。
  8. オンラインで自由に利用できるベン図生成ツール(Pangloss)を使用してDEGを採取し、一般的なDEGと固有のDEGを分離するためのベン図を生成することにより、以前に発表された研究と比較して固有の遺伝子リストを特定します( 材料の表を参照)。
  9. さらに、Gene Ontologyを特定するために、固有の遺伝子リストを対象とする。
    注:Gene Ontology:Molecular Function(GO:MF)、Gene Ontology:Biological Processes(GO:BP)、およびGene Ontology:Cellular Component(GO:CC)などのさまざまなGO機能は、g:Profiler( 資料表を参照)またはPANTHER( 資料表を参照)のいずれかを使用して生成できます。g: Profiler を使用して行われる GO ベースの分析。
  10. 個々の染色体上のゲノム中のDEGの分布を取得するには、ShinyGOを使用します( 資料の表を参照)。
  11. GEO2Rから取得したユニークな遺伝子リスト全体をShinyGOの検索タブに貼り付けると、最も一致する種がホ モサピエンスでした。使用されたFDRカットオフは5%でした。
  12. GEO2Rから得られたDEGの選択を行い、タンパク質レベルでのさらなる検証研究を行います。DEG に関する追加の重要な情報を抽出するワークフローを 図 2 に示します。

5. 遺伝子/タンパク質のエイリアスを見つける

  1. HPRDページ( 材料表を参照)を開き、 クエリ ボタンをクリックします。
  2. それぞれの検索タブにタンパク質名またはHPRD識別子を入力し、下部の [検索 ]ボタンを押します
    注:「ALTERNATE NAMES」とラベル付けされたタブがあるページが開いているので、それをクリックすると、この遺伝子またはタンパク質のエイリアスが表示されます。

6. DEGの公式遺伝子シンボルを見つける

  1. 公式の遺伝子記号を見つけるには、HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)を開いてください( 資料の表を参照)。
  2. GEO2R解析で取得した名前をHGNCページの検索バーに入力し、 検索 記号をクリックします。検索結果には、どの公式の遺伝子記号、用語が完全に一致するかが表示されます。
  3. そのリンクをクリックして、そこにある公式の「遺伝子記号」を見つけてください。

7. DEGの遺伝子座の探索

  1. NCBIのリンクから遺伝子ページを開いてください。
  2. 遺伝子の公式遺伝子記号を入力し、 検索をクリックします。
  3. 結果として、遺伝子とそれが属する生物を慎重に確認してください。正しい一致を確認したら、 リンク をクリックしてさらに進めます。
    注:要約すると、「ゲノムコンテキスト」という見出しの下には、実際には遺伝子座である場所があります。

8. DEGのOMIM Pagegene遺伝子座でDEGに関する情報を見つける

  1. OMIMページを開きます( 資料の表を参照)。
  2. 遺伝子情報 の名前 または 遺伝子記号 、特に「gene-phenotype」を入力します。
  3. 検索ボタンをクリックすると、目的の遺伝子の結果が表示されます。「遺伝子と表現型の関係」に関する情報が表示されます。

9. 遺伝子にコードされるタンパク質の局在、ドメイン、モチーフ、分泌性を発見

  1. HPRDページを開きます( 資料の表を参照)。
  2. 開いたら、それぞれの検索タブに タンパク質名 または HPRDインデチフィア を入力し、下部にある 検索 ボタンを押します。
  3. 「概要」というラベルの付いたタブがあるページが開きます。ページの一番下まで進み、[ ローカライゼーション ] タブを確認して、プライマリローカリゼーションと代替の "セカンダリ" ローカリゼーションを確認します。
    注:同じページの「ローカリゼーション」の下には、「ドメインとモチーフ」のタブがあり、目的のタンパク質のドメインとモチーフがリストされています(存在する場合)。同じページにも、「ドメインとモチーフ」タブの隣に「表現」タブがあり、「表現」タブとサブタブ「表現サイト」があります。任意の生体液中で脱テトされることが報告されているタンパク質は、本質的に「分泌性」と見なすことができます。目的のタンパク質が血漿、血清、精液、涙液などの生体液のいずれかで報告されている場合、それはそこにリストされます。

10. 検証のためのタンパク質のチェリーピッキング、および目的の悪性腫瘍の診断または予後のためのさらなる評価

注:ユニークな分子が特定されたら、最大の課題はそれらをどのように検証するかです。通常、マイクロアレイ研究ではmRNAレベルでの発現が得られますが、疾患の診断や予後のためには、タンパク質レベルの読み取りが重要です。同様に、患者または患者に由来する同じがんのサンプルまたは細胞株をスクリーニングして、分子が実際にそこで発現しているかどうか、がん と 正常、予後の良い か 悪いかを区別できるかどうか、または病気の初期段階と後期段階を区別できるかどうかを知る必要があります。候補分子を検証するために、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ 、すなわち、 ELISA、免疫沈降、免疫組織化学、免疫細胞化学、またはアッセイが有用な技術である18、19、20。同時に、これらすべてのアッセイには、サンプル中に存在する抗原を検出するための抗体が必要です。抗体は高価なアイテムであるため、次の点に基づいて抗体を選択することをお勧めします。

  1. 抗体が他の悪性腫瘍で以前に発表された研究論文をすでに報告しているかどうかを確認します。
  2. そうでない場合は、抗体提供会社に問い合わせて、ブロットの写真、免疫細胞化学、免疫組織化学の画像が記載されたデータシートが提供されていないか確認してください。
    注:免疫組織化学を行いたいが、抗体がELISAアッセイにのみ利用可能である場合、標的分子がシグナルペプチドではなく膜貫通ドメインを持つ分子である場合、抗体を特に使用するリスクとなる可能性があります。また、抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である場合、モノクローナル抗体を好む方が良い。

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結果

一例として、GEOアクセッションGSE161533は、ESCCで差次的に探索された遺伝子を研究するために使用されました。解析の代表的な結果を 図3に示します。GEO2R は、実験対象の 2 つのグループ間で大きく異なるイベントを特定するのに役立つ火山プロットを生成します。ボルケーノプロットは、y軸に-log10 の変換された有意性(p値)、x軸にfold changes(log2 transformed fold change)を持つ遺伝子全体の分布を示しており(図3A)、差次的に発現する遺伝子を可視化するのに有用です。強調表示された遺伝子は、デフォルトの調整済みp値カットオフ値0.05(青=ダウンレギュレーション、赤=アップレギュレーション)で有意に異なる発現を示します。

平均差(MD)プロットは、対数2 の倍率 変化を表示します。平均

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ディスカッション

がん生物学にハイスループットOMICS技術が関与して以来、データの生成速度は大幅に向上しています。これは、研究者、特にコンピューターに精通していない研究者にとって課題となります。何年にもわたって克服するために、バイオインフォマティシャンは、データを組織的に提供するためのデータベースを開発するというアイデアを思いつきます。これは、研究者、特にテクノロジーに興味のない研究者から肯定的な反応を生み出しました。さらに、文献のあちこちに散らばったOMICSデータは、誰にとっても役に立ちません。そのため、それをうまく活用するためには、専門的な関心を持つ研究者がデータにアクセスできる共通のプラットフォームが常々必要でした。ONCOMINE38、ESCC ATLAS39、膵臓がんデータベース(PCD)40、DDEC41など、さまざまながんに関するデータベースが多数あります。

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

MKKは、科学技術省の科学技術研究委員会(SERB)とニューデリーのインド医学研究評議会(ICMR)から、TAREフェローシップ(Grant # TAR/2018/001054)の学外助成金(Grant # 5/13/55/2020/NCD-III)をそれぞれ受賞しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NCBI-PUBMEDNCBIセクション 1 を参照。文献の検索に必要
インターネット設備と Web ブラウザを備えたラップトップ/Macbook またはパーソナル コンピューター。
g:ProfilerELIXIR infrastructurehttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostセクション 4.10 を参照。GO:MF、GO:BP、および GO:CC 遺伝子
発現オムニバスNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/セクション 3.1 を参照。マイクロアレイ研究データベース
GEO2RNCBIの検索に必要https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/セクション3.2を参照。GEO2Rツールを使用したデータの分析に必要
GoogleGoogle https://www.google.comセクション1.1を参照。文献の検索に必要
HGNCはヒトゲノム機構(HUGO)の委員会ですhttps://www.genenames.orgDEGs の公式遺伝子記号を知るために必要なセクション6.1を参照します。
HPRDバイオインフォマティクス研究所、バングルル http://hprd.orgタンパク質の構造に関する情報に必要なセクション5.1を参照 
OMIM&nbsp;ジョンズ・ホプキンス大学ボルチモア校http://www.omim.org/entry特定の遺伝子のOMIM IDを知るために必要なセクション8.1を参照 / DEG
Pangloss プログラムChris Seidelによって開発http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiセクション4.9を参照。ベン図の生成に必要
カリフォルニア大学のPANTHER Thomasラボhttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doセクション 4.10 を参照します。GO:MF、GO:BP、および GO:CC
ShinyGO サウスダコタ州立大学http://bioinformatics.sdstate.edu/goセクション4.10を参照。染色体上のDEGの割り当てに必要
https://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed の濃縮に必要 南 のエンリッチメントに必要。

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