方法論記事

食道扁平上皮がんに対する大要の開発

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DOI:

10.3791/65480

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2024年4月12日

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、癌の重大な分子変化を特定するための有用なツールを説明し、食道扁平上皮癌の新しい診断および治療アプローチの開発につながります。

要約

食道がん(EC)は、最も侵攻性の高い悪性腫瘍の8位 にランクされており、早期発見を促進するバイオマーカーがないため、その治療は依然として困難です。ECは、腺がん(EAD)と扁平上皮がん(ESCC)の2つの主要な組織型で発現し、どちらも地理的に異なる集団間で発生率にばらつきを示します。ハイスループットテクノロジーは、がんを含む疾患の理解を変革しています。科学界にとって大きな課題は、文献に散在するデータを扱うことです。これに対処するために、公開されているマイクロアレイデータセットの解析と、がんと正常状態との間の差動制御分子の収集のための簡単なパイプラインが提案されています。このパイプラインは、がんと正常組織間、または異なるがんサブタイプ間で差次的に発現する遺伝子を同定する、差次的遺伝子発現解析の標準的なアプローチとして機能します。パイプラインには、データの前処理(サンプル間の技術的なばらつきを取り除くための生の遺伝子発現データの品質管理と正規化を含む)、差次的発現分析( t検定などの統計的検定を使用して、2つ以上のサンプルグループ間で差接する遺伝子を特定する)を含むいくつかのステップが含まれます、ANOVA、または線形モデル)、機能解析(バイオインフォマティクスツールを使用して、発現差のある遺伝子の濃縮された生物学的経路と機能を特定する)、およびバリデーション(独立したデータセットまたはqPCRや免疫組織化学などの実験的方法を使用したバリデーションを含む)。このパイプラインを使用すると、食道がんを含むあらゆる種類のがんに対して、差次的に発現する分子(DEM)のコレクションを生成できます。この大要は、がんの潜在的なバイオマーカーと薬剤標的を特定し、疾患の根底にある分子メカニズムの理解を深めるために利用できます。さらに、このパイプラインを使用した食道がんの集団特異的スクリーニングは、異なる集団の特定の薬物標的を特定するのに役立ち、疾患の個別化治療につながります。

概要

ECが世界で8番目に多いがんであり、死因の第6位であることは憂慮すべきことです。中国、インド、イランは、驚くほど高い発生率と死亡率を示しています。ECには、食道腺がん(EACまたはEAD)と食道扁平上皮がん(ESCC)の2つの主要なタイプがあります1。EACは西洋諸国でより一般的ですが、ESCCは東側諸国、特に中国とイランでより一般的です2。ECには、タバコやアルコールの使用、肥満、胃食道逆流症(GERD)など、いくつかの危険因子が関連しています。さらに、果物や野菜の不足、温かい飲み物や食品の消費などの食事要因は、リスクの高い地域でのESCCリスクと関連しています。早期の診断と治療は、EC 3,4 患者の転帰を改善するために重要です。そのため、ECのリスク因子や徴候、症状に対する意識を高め、ハイリスクな人の定期的なスクリーニングを促すことが大切です。さらに、タバコやアルコールの使用、不健康な食生活など、修正可能なリスク要因に対処する努力は、ECの発生率を減らすのに役立つ可能性があります。これは、胃酸と内容物が食道に戻るGERDと関連していることがよくあります。対照的に、ESCCは、食道の上部を覆う平らで薄い細胞から発生します5。中国やイランなど、タバコやアルコールの使用が広まっている地域でより一般的です。

食道に関連するさまざまな状態の中で、食道の内壁が腺細胞に置き換わる状態であるバレット食道(BE)は、EAC6の前駆体として知られています。BEはGERDなしで発症する可能性があることは注目に値しますが、GERDの存在はBEを発症するリスクを3〜5倍増加させます。さらに、BEの存在はEACを発症するリスクを50〜100倍増加させます7。さらに、温かい食べ物や辛い食べ物や液体はESCCに関連していますが、EACには関連付けられていません。ECのリスク要因を理解することは、ECの予防と早期発見のために重要です。タバコの使用、アルコール摂取、肥満、不健康な食生活など、修正可能なリスク要因に対処する努力は、ECの発生率を減らすのに役立つ可能性があります。さらに、嚥下障害(BE)などの高リスク者に対する定期的なスクリーニングとサーベイランスは、早期発見と治療を可能にすることで転帰を改善する可能性がある。

ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メチロミクス、ミラルアオミクス、メタボロミクスなどのオミクス主導の研究が、EC、特にESCC 8,9,10,11,12,13の理解に大きく貢献していることは確かです。これらの研究により、ESCCの発症と進行に関与する新規バイオマーカー、潜在的な治療標的、および新しい経路の特定が可能になりました。しかし、これらの研究から得られたデータは文献全体に散らばっているため、科学界がこの情報にアクセスして使用することは困難です。したがって、特定のがんに関するハイスループットまたはロースループットの研究から得られたデータをまとめたリポジトリまたはデータベースを作成することが重要です。このようなパッケージは、いくつかの基本的なガイドラインを実装することで合理化および作成できます。これらのガイドラインには、関連する研究の選択、これらの研究からのデータの抽出と整理、データの品質と一貫性の確保が含まれます。さらに、大要は定期的に更新して、新しい研究やデータが利用可能になったときにそれらを含める必要があります。研究者は、単一のプラットフォームを使用して、さまざまな研究のデータを組み合わせた大要またはデータベースを作成することにより、特定のがんに関するデータを取得および分析できます。これにより、研究活動が加速し、最終的にはがん患者にとってより効果的な治療とより良い結果につながります。

がん大要の開発には、ロースループット研究とハイスループット研究の両方のデータが組み込まれています。この大要は、がんの潜在的な診断または治療標的を特定しようとしている研究者にとって貴重なリソースになります。このコレクションを構築する1つの方法は、Gene Expression Omnibus(GEO)などの一般にアクセス可能なリポジトリで利用可能なマイクロアレイ研究をレビューすることです。マイクロアレイ研究は、がん細胞の遺伝子発現レベルに関する情報を提供することができ、これらのデータを使用して、がんの発生と進行に関与する可能性のある差次的に発現する遺伝子(DEG)を特定することができます。

ただし、研究が異なれば、データの分析方法も異なる可能性があり、それが異なるDEGの特定につながった可能性があることに注意する必要があります。したがって、各研究を慎重にレビューし、大要のデータをプールする際には、潜在的なバイアスや制限を考慮することが重要です。データが共通のプラットフォームで収集されると、研究者はそれを使用して、さらなる研究のための潜在的な分子標的を特定できます。これには、臨床サンプル中の特定の遺伝子の発現を調べたり、特定の遺伝子やタンパク質ががんの発生や進行にどのように関与しているかを理解するための機構研究を実施したりすることが含まれます。全体として、がんデータセットの作成は、がん研究者にとって貴重なリソースとなり、診断や治療介入のための新たな標的を特定するのに役立ちます。

プロトコル

1. ESCCにおける差動制御分子の手動キュレーション

  1. PubMedを使用した関連するロースループット研究の検索
    注: 低スループットと高スループットの手法の基本的な違いを理解することが重要です。前者では、限られた数のサンプルのみが研究され、プロセスは通常時間がかかりますが、対照的に、後でより速く、サンプル数を一度に分析できるため、ノーザンブロットなどのロースループット法よりも大幅に多く、ウェスタンブロットはロースループット技術であり、cDNAマイクロアレイ、およびLC-MS / MSベースの定量的プロテオミクスはハイスループット技術です14。NCBI-PubMed( 資料表を参照)のような検索エンジンは、生物医学科学者がESCCのようなあらゆる疾患に関する文献を見つけるための公的に利用可能なリソースであるため、あらゆるがんに関連する研究を見つけるための優れた情報源です。関連する研究を見つけるには、以下のステップを踏む必要がある。
    1. Google検索エンジン(資料表を参照)をクリックして開きます。これは、PubMedにインデックスされていないジャーナルがあるにもかかわらず、質の高い記事であるため、研究者によっても使用されます。重要な記事を見逃す可能性を無効にするために、複数の検索エンジンを検索することは常に良いことです。
    2. PubMedの検索バーを選択し、ブール演算子(AND、OR、NOT)を使用します。ブール演算子は、研究者が結果を見つけるために使用する関連キーワードに検索者を絞り込みます。

2. PubMedを使用して関連する研究を見つける

  1. NCBIのウェブアドレス(資料表を参照)を入力し、クリックして開きます。
  2. 左側のサイドバーメニューから[すべてのデータベース]タブから[PubMed]を選択します。
  3. 検索バーに関連 キーワードを入力すると、関連する記事が取得されます。キーワードは、問題の癌/疾患(食道扁平上皮癌など)に密接に関連する記事を取得するのに役立つ可能性があるため、ブール演算子と組み合わせて使用する必要があります。

3. 遺伝子発現オムニバス(GEO)を用いた関連研究の探索

注:Gene expression Omnibus(GEO)は、DNAマイクロアレイにデータを保存するための無料で利用できるリポジトリです。GEOで利用可能な大量のデータは、がん/疾患と正常状態の間で異なる制御分子を特定するためのデータマイニングに適したリソースです。

  1. GEOを入力します web アドレス(資料の表を参照)をクリックし、クリックして開きます。
  2. 食道扁平上皮がんとホモサピエンスと入力し、Enterキーを押します。
    注:がんの差次的に制御される遺伝子の大要を作成するには、研究者ががんと正常状態の間で差次的に調節される分子を選択する関連研究を選択することが重要です 。 主な側面は、倍率変化に基づいて分子を選択するための基準を設定することです。フォールド変化は、遺伝子/タンパク質がアップレギュレーションされているかダウンレギュレーションされているかを示します。フォールドの変化と p値のカットオフ値は、マイクロアレイRNAseqやプロテオミクス研究15を含む特定の実験におけるデータの意味を大幅に変える可能性があります。

4. GEO2Rを用いたマイクロアレイ解析

注:まず、ブール演算子(AND、OR、NOT)を使用して関連する研究を見つけることです。これらは、「食道扁平上皮がん」、「ESCC」、または「食道扁平上皮がん」というキーワードと組み合わせて使用 されます。GEO2R( Table of Materials参照)は、GEOと統合された無料のR言語パッケージで、ユーザーはマイクロアレイ研究のデータをユーザーフレンドリーな方法で分析することができます。GEO エントリ ID と対話し、バックエンドの Bioconductor R パッケージを使用して DEG を識別するための複雑な R ベースの解析を実行するためのインターフェイスを提供します。このパッケージは、GEOデータを変換するだけでなく、その出力を.txtテーブルの形で表示し、ユーザーのニーズに応じてさらに変更することができる16。GEO2Rパッケージは、 p値に基づく統計的有意性の順序で遺伝子を表示しますが、その順序は対数2倍の変化に基づいて並べ替えることができます。また、遺伝子発現プロファイルをGEOプロファイル画像として閲覧することができます。他の解析ツールとは異なり、GEO2Rは選択したデータセットレコードから独立しており、研究者が提出した実際のデータを直接調査することができます。GEO研究の90%以上がこの方法を使用して分析できます17。 図1に、GEO2Rを使用したマイクロアレイデータの解析に関連するステップを含むGEO2Rのワークフローを示します。

  1. GEO2RのWebサイトを開きます。
  2. 「GEO accession」とラベル付けされたサーチスペースに GEO を使用して GSE アクセッション を入力し、 Set ボタンをクリックします。 ラベル癌 を作成し、 次に正常にします。
  3. タイプに基づいてサンプルを割り当てるには、最初に Cancer を割り当て、次に Normal を割り当てます。
  4. デフォルトのパラメータを変更せずに [分析 ]をクリックします。
  5. 全遺伝子リストをクリックし、.tsvファイル形式でデータをダウンロードします。.tsv は、データをさらに処理する前に .xlsx に変換する必要があります。
  6. Excelで数式[=(2)^(Nx)、Nはセルの位置]を使用して、log2のfold changeをfold changeに変換します。
  7. さらに、ステップ4.6で得られたデータを対象とすると、5%の偽発見率(FDR)または調整されたp値(調整済みp値)<0.05を適用し、アップレギュレーションされた遺伝子については>2.0倍の変化、ダウンレギュレーションされた遺伝子については<0.5倍の変化を適用することにより、DEGを得る。
    注:FDRは、多重検定を説明するために p値に適用される補正であり、これら2つを互いに同義として扱うことはできません。FDRの調整は、多数の仮説検定を実行する際に誤発見の割合を制御するために重要です。
  8. オンラインで自由に利用できるベン図生成ツール(Pangloss)を使用してDEGを採取し、一般的なDEGと固有のDEGを分離するためのベン図を生成することにより、以前に発表された研究と比較して固有の遺伝子リストを特定します( 材料の表を参照)。
  9. さらに、Gene Ontologyを特定するために、固有の遺伝子リストを対象とする。
    注:Gene Ontology:Molecular Function(GO:MF)、Gene Ontology:Biological Processes(GO:BP)、およびGene Ontology:Cellular Component(GO:CC)などのさまざまなGO機能は、g:Profiler( 資料表を参照)またはPANTHER( 資料表を参照)のいずれかを使用して生成できます。g: Profiler を使用して行われる GO ベースの分析。
  10. 個々の染色体上のゲノム中のDEGの分布を取得するには、ShinyGOを使用します( 資料の表を参照)。
  11. GEO2Rから取得したユニークな遺伝子リスト全体をShinyGOの検索タブに貼り付けると、最も一致する種がホ モサピエンスでした。使用されたFDRカットオフは5%でした。
  12. GEO2Rから得られたDEGの選択を行い、タンパク質レベルでのさらなる検証研究を行います。DEG に関する追加の重要な情報を抽出するワークフローを 図 2 に示します。

5. 遺伝子/タンパク質のエイリアスを見つける

  1. HPRDページ( 材料表を参照)を開き、 クエリ ボタンをクリックします。
  2. それぞれの検索タブにタンパク質名またはHPRD識別子を入力し、下部の [検索 ]ボタンを押します
    注:「ALTERNATE NAMES」とラベル付けされたタブがあるページが開いているので、それをクリックすると、この遺伝子またはタンパク質のエイリアスが表示されます。

6. DEGの公式遺伝子シンボルを見つける

  1. 公式の遺伝子記号を見つけるには、HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)を開いてください( 資料の表を参照)。
  2. GEO2R解析で取得した名前をHGNCページの検索バーに入力し、 検索 記号をクリックします。検索結果には、どの公式の遺伝子記号、用語が完全に一致するかが表示されます。
  3. そのリンクをクリックして、そこにある公式の「遺伝子記号」を見つけてください。

7. DEGの遺伝子座の探索

  1. NCBIのリンクから遺伝子ページを開いてください。
  2. 遺伝子の公式遺伝子記号を入力し、 検索をクリックします。
  3. 結果として、遺伝子とそれが属する生物を慎重に確認してください。正しい一致を確認したら、 リンク をクリックしてさらに進めます。
    注:要約すると、「ゲノムコンテキスト」という見出しの下には、実際には遺伝子座である場所があります。

8. DEGのOMIM Pagegene遺伝子座でDEGに関する情報を見つける

  1. OMIMページを開きます( 資料の表を参照)。
  2. 遺伝子情報 の名前 または 遺伝子記号 、特に「gene-phenotype」を入力します。
  3. 検索ボタンをクリックすると、目的の遺伝子の結果が表示されます。「遺伝子と表現型の関係」に関する情報が表示されます。

9. 遺伝子にコードされるタンパク質の局在、ドメイン、モチーフ、分泌性を発見

  1. HPRDページを開きます( 資料の表を参照)。
  2. 開いたら、それぞれの検索タブに タンパク質名 または HPRDインデチフィア を入力し、下部にある 検索 ボタンを押します。
  3. 「概要」というラベルの付いたタブがあるページが開きます。ページの一番下まで進み、[ ローカライゼーション ] タブを確認して、プライマリローカリゼーションと代替の "セカンダリ" ローカリゼーションを確認します。
    注:同じページの「ローカリゼーション」の下には、「ドメインとモチーフ」のタブがあり、目的のタンパク質のドメインとモチーフがリストされています(存在する場合)。同じページにも、「ドメインとモチーフ」タブの隣に「表現」タブがあり、「表現」タブとサブタブ「表現サイト」があります。任意の生体液中で脱テトされることが報告されているタンパク質は、本質的に「分泌性」と見なすことができます。目的のタンパク質が血漿、血清、精液、涙液などの生体液のいずれかで報告されている場合、それはそこにリストされます。

10. 検証のためのタンパク質のチェリーピッキング、および目的の悪性腫瘍の診断または予後のためのさらなる評価

注:ユニークな分子が特定されたら、最大の課題はそれらをどのように検証するかです。通常、マイクロアレイ研究ではmRNAレベルでの発現が得られますが、疾患の診断や予後のためには、タンパク質レベルの読み取りが重要です。同様に、患者または患者に由来する同じがんのサンプルまたは細胞株をスクリーニングして、分子が実際にそこで発現しているかどうか、がん と 正常、予後の良い か 悪いかを区別できるかどうか、または病気の初期段階と後期段階を区別できるかどうかを知る必要があります。候補分子を検証するために、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ 、すなわち、 ELISA、免疫沈降、免疫組織化学、免疫細胞化学、またはアッセイが有用な技術である18、19、20。同時に、これらすべてのアッセイには、サンプル中に存在する抗原を検出するための抗体が必要です。抗体は高価なアイテムであるため、次の点に基づいて抗体を選択することをお勧めします。

  1. 抗体が他の悪性腫瘍で以前に発表された研究論文をすでに報告しているかどうかを確認します。
  2. そうでない場合は、抗体提供会社に問い合わせて、ブロットの写真、免疫細胞化学、免疫組織化学の画像が記載されたデータシートが提供されていないか確認してください。
    注:免疫組織化学を行いたいが、抗体がELISAアッセイにのみ利用可能である場合、標的分子がシグナルペプチドではなく膜貫通ドメインを持つ分子である場合、抗体を特に使用するリスクとなる可能性があります。また、抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である場合、モノクローナル抗体を好む方が良い。

結果

一例として、GEOアクセッションGSE161533は、ESCCで差次的に探索された遺伝子を研究するために使用されました。解析の代表的な結果を 図3に示します。GEO2R は、実験対象の 2 つのグループ間で大きく異なるイベントを特定するのに役立つ火山プロットを生成します。ボルケーノプロットは、y軸に-log10 の変換された有意性(p値)、x軸にfold changes(log2 transformed fold change)を持つ遺伝子全体の分布を示しており(図3A)、差次的に発現する遺伝子を可視化するのに有用です。強調表示された遺伝子は、デフォルトの調整済みp値カットオフ値0.05(青=ダウンレギュレーション、赤=アップレギュレーション)で有意に異なる発現を示します。

平均差(MD)プロットは、対数2 の倍率 変化を表示します。平均log2 発現値であり、差次的に発現する遺伝子を視覚化するのに役立ちます。MD-plotでは、log2 が形質転換した遺伝子はy軸で変化し、x軸で平均値の発現を記録します(図3B)。強調表示された遺伝子は、デフォルトの調整済みp値カットオフ値0.05(青=ダウンレギュレーション、赤=アップレギュレーション)で有意に異なる発現を示します。ボルケーノプロットは、一度に2つの処理からの情報のみを表示するという点で、MAプロットと同じ問題に直面します21。

さらに、Uniform Manifold Approximation and Projection(UMAP)22 を使用して、ESCCと正規サンプルとの関連性を評価しました(図3C)。ほとんどのサンプルはそれぞれのカテゴリーに属していましたが、通常のサンプルには2つのESCCサンプルが見つかりました。

GEO2Rは、データセット内の発現密度を効果的に示す2Dインタラクティブ発現密度プロット(図3D)を提示しました。このプロットは、DEG に正規化が必要かどうかを判断するのに役立ちます。このプロットでは、y軸は密度を示し、x軸はESCC(緑色)と法線(紫色)の両方の強度を示します。

ESCCと法線を含むさまざまなサンプル間の値の分布は、箱ひげ図に示されています。これらの分布は、サンプルが実際に差次的発現解析に適しているかどうかのヒントとなります。中央値中心の値は、データが正規化され、相互比較可能であることを明確に示します(図3E)。

同定された遺伝子は、p < 0.05およびfold-change基準に基づいてフィルタリングされます。変化しない遺伝子(<2.0〜>0.50の倍率変化)は分析から除外されました。さらに、以前に発表された研究と比較すると、見つかった一般的な遺伝子はわずか514個ですが、得られた遺伝子の一意の数は1193個です。GEO2Rを使用してユニークな遺伝子を同定すると、冗長性を減らすだけでなく、大要を充実させるのに役立つことに注意することが重要です。

DEG の部分的なリストは表 1 に記載されていますが、DEG の完全なリストは補足ファイル 1 に記載されています。MMP1 8,23,24、MMP1223,25、SPP1 8,26、POSTN9、VCAN 8,27など、アップレギュレーションされた遺伝子の一部は細胞外マトリックスに属します。表1にリストされている他の遺伝子の中には、CMPK2、AURKA28,29、CHEK127、およびCDK130がアップレギュレーションされ、EMP127、PTK631,32、GPX327、DPT33、FHL134,35、およびCRNN 8,36が含まれますは、正常な上皮と比較してESCCでダウンレギュレーションされます。.POSTN(ペリオスチン)はESCCでアップレギュレーションされており、食道腺癌の場合にも報告されています。.ESCCに関する先行研究では、POSTNタンパク質の発現が間質領域だけでなく腫瘍細胞でも観察されたことが報告されており、腫瘍と微小環境の間には相互作用があることが示唆されている9。ペリオスチンは、主に間葉系細胞から分泌されるタンパク質で、骨芽細胞の調節、接着、分化、創傷修復に重要な役割を果たしています。さらに、ペリオスチンは、ESCCを含むさまざまながんの腫瘍の進行と転移に関与しています。研究によると、ペリオスチンはがんや腫瘍血管新生における上皮間葉転換(EMT)に関与し、腫瘍の細胞遊走、運動性、接着、転移性細胞増殖を促進します。食道の前癌状態であるバレット食道では、正常な食道組織と比較して、ペリオスチンをコードする遺伝子であるPOSTNの有意なアップレギュレーションがある37。食道の炎症性疾患である好酸球性食道炎では、正常な食道上皮と比較して、ペリオスチンmRNAとタンパク質の発現レベルの両方がアップレギュレーションされます。同様に、ESCCでは、遺伝子発現解析においてPOSTNが11倍アップレギュレーションされることがわかりました9。これらの知見は、POSTNがESCCや他のがんのバイオマーカーとして役立つ可能性を示唆している。さらに、血清POSTNレベルの上昇は、骨転移を伴う対角線化された乳がん患者で報告されており、POSTNはESCC患者の血清中の潜在的な転移性バイオマーカーとしてもさらに調査できる可能性があることを反映しています。全体として、POSTNは腫瘍の進行に重要な役割を果たしていると考えられており、がんの診断、予後、および治療に臨床的に潜在的な影響を与える可能性がある。

個々の染色体上のDEGの染色体分布は、遺伝子の最大数が染色体1〜6、およびXからのものであることを示しています(図4)。ShinyGOベースの経路解析では、DEGs解析時にいくつかの重要な経路が現れることが示されました。これらのいくつかは、IL-17シグナル伝達経路、タンパク質の消化吸収、ECM受容体相互作用、TNFシグナル伝達経路、Toll様受容体シグナル伝達経路、ケモカインシグナル伝達経路、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、アルコール肝疾患、癌におけるマイクロRNA、癌における転写調節不全、細胞周期、およびESCCにおけるNONO様受容体シグナル伝達経路であった。さらに、DEGにおけるGO項の濃縮は、g:Profiler解析を用いて行われました。分子機能(GO:MF)、細胞成分(GO:CC)、および生物学的プロセス(GO:BP)のさまざまなGO用語が濃縮されました(図5)。これらのGO条件のリストは、 表2に示されています。

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図1:GEO2Rプログラムを使用した遺伝子発現オムニバスで利用可能な食道扁平上皮がんの研究の処理の概略図。 このスキーマでは、倍率変化に基づくDEGの選択基準、アップレギュレーション>2.0倍と p <0.05、ダウンレギュレーションの<0.5と p値<0.05など、差次的に制御される遺伝子(DEG)または異なる制御分子(DEM)の同定に関与するさまざまなステップが示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:他の公開されているリソースを使用して利用可能な食道扁平上皮がんの差次的に制御された遺伝子に関する追加情報を見つけるための概略図。 さらに、DEGsは、臨床現場でのさらなる検証と評価のために選択する必要があるDEGを決定する上で重要です。エイリアスの抽出、公式の遺伝子記号、染色体の位置/遺伝子座、OMIM、ドメイン/モチーフ、タンパク質の分泌性、タンパク質レベルでの検証に適した抗体の利用可能性などの情報は、さまざまなオンラインリソースから入手できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:ESCC と 正常の間のDEGの同定のためのGEO2Rプログラムを使用したGEOアクセッションGSE161533を用いた研究の分布。 GEO2Rプログラムは、(A)y軸に-log10 の変換された有意性(p値)、x軸にfold changes(log2 transformed fold change)を持つ遺伝子分布を表すVolcanoプロット、(B)log2 のfold change と 平均log2 発現値を表示するMDプロットプロット、差次的に発現する遺伝子を視覚化するためのデフォルトのパラメータで使用されました。 (C)UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)は、サンプルのタイプに基づく分離を示し、(D)発現密度プロットは、差次的発現解析の前にデータの正規化をチェックするため、発現密度プロットは補完的であり、(E)データの正規化が相互比較可能であることを示すために、サンプル全体の中央中心値を示す箱ひげ図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:ShinyGOエンリッチメントツールを使用した異なる染色体遺伝子座上のDEGの分布 (A)現在と以前に発表された研究を比較するためのベン図を生成することにより、ユニークな遺伝子を同定した。(B)ゲノム内の異なる染色体上のDEGの分布。(C)ShinyGOベースの濃縮分析を使用したDEGの経路濃縮。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:マンハッタンプロットにより、g:Profilerを使用した標的遺伝子のGO項濃縮を図 示。差次的に発現した遺伝子をg:ProfilerとGO用語での濃縮(MF:molecular function;BP:生物学的プロセス;CC: cellular component) と Reactome pathways (REAC)、WiKi-Pathways (WP)、転写因子 (TF)、microRNA 標的塩基 (MIRNA) の KEGG 経路をマンハッタンプロットにグラフィカルに示しました。ここで、x 軸はカテゴリ別に色分けされた GO 機能用語です。各色付きのドットは GO 用語を表します。Y 軸は、調整された -log10p 値を示します。ESCC で統計的に有意な GO 項が X 軸に示されています。MF:分子機能;BP:生物学的プロセス;CC:細胞成分;MIRNA:マイクロRNA;HP:ヒューマン表現型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ESCCで差次的に発現する遺伝子の部分的なリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 2: g: Profiler を使用した ESCC での GO 用語のエンリッチメントこの表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:ESCCで差次的に発現する遺伝子の完全なリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

がん生物学にハイスループットOMICS技術が関与して以来、データの生成速度は大幅に向上しています。これは、研究者、特にコンピューターに精通していない研究者にとって課題となります。何年にもわたって克服するために、バイオインフォマティシャンは、データを組織的に提供するためのデータベースを開発するというアイデアを思いつきます。これは、研究者、特にテクノロジーに興味のない研究者から肯定的な反応を生み出しました。さらに、文献のあちこちに散らばったOMICSデータは、誰にとっても役に立ちません。そのため、それをうまく活用するためには、専門的な関心を持つ研究者がデータにアクセスできる共通のプラットフォームが常々必要でした。ONCOMINE38、ESCC ATLAS39、膵臓がんデータベース(PCD)40、DDEC41など、さまざまながんに関するデータベースが多数あります。

差次的に発現する遺伝子(DEG)の概念は、RNAシーケンシングデータの解析から生まれ、2つ以上の疾患(がん と正常、 治療 と コントロールなど)で発現レベルに大きな変化がある遺伝子が特定されます。DEGを決定するためにいくつかのツールが開発されており、生のRNA-seqリードの計算解析から評価された発現遺伝子の定量化、またはプローブとがん 群と 正常群の標的配列との間で生成された強度比に基づいて統計的検定を実行します。これらのツールは、各遺伝子の発現レベルとペアワイズの差の大きさに関連する情報を提供します。差次的遺伝子発現(DGE)解析は、生物の表現型の違いに寄与する遺伝的メカニズムを理解するのに役立ちます。DGE分析は、腫瘍起源の検出やマイクロバイオーム分析など、さまざまな生物学的プロセスの研究に適用されています。DEGを同定することにより、この分析は、ESCC腫瘍形成に関与するこれらの生物学的プロセスに寄与する根本的な遺伝的要因についての洞察を提供することができます21。

GEO2Rツール法は、一般に公開されており、文献で利用可能なほとんどの研究が異なるアルゴリズムを使用して分析されているため、データ分析に大きな違いが生じているため、最も好ましい方法です。したがって、これらの違いを回避するために、このユーザーフレンドリーなプラットフォームは無料で使いやすいため、使用されました。これにより、「がんと正常」、または「治療と無治療」などの状態を比較できます。

この場合、ESCCが選ばれたのは、ESCCがインドと中国で新たに発生した消化管(GI)がんであるためです。GEOアクセッションGSE161533を選択し、GEO2Rを使用して解析し、ESCC とESCCの間のDEGを特定します。正常。この研究が選択されたのは、以前に化学療法または放射線療法を受けたことのあるESCC患者が含まれていなかったためです。分析には、可能であれば対応のあるサンプル(ESCCおよび同じ患者からの隣接する正常)を使用することが望ましいです。これは、ESCCのゲノムと同じ患者の正常組織が、同じ遺伝的背景から来ており、組織が同じ環境にあるため、非常に類似していると予想されるためです。ペアとなるサンプルを使用すると、異なる遺伝的背景を持つ異なる患者のESCC組織と正常組織を比較する場合に生じる可能性のある解析のバイアスを避けるのに役立ちます。ペアサンプルを使用することで、同じ患者内のESCCと正常組織との間の遺伝子発現の違いをより正確に特定することができ、結果の特異性を向上させることができます。このアプローチは、個々のばらつきを制御し、分析能力を高めるために、遺伝子発現研究で頻繁に利用されています。

研究に参加した被験者からすべてのサンプルデータを取得し、GEO2Rプラットフォームを使用して遺伝子発現データを分析しました。まず、がんのサンプルを割り当て、次に正常なサンプルを割り当てました。これらのサンプルを割り当てた後、GEO2Rデータベースで利用可能なデフォルトのパラメータを使用して、がんまたは治療サンプルと正常サンプルまたは対照サンプルを特定しました。がん検体と正常検体を区別するために、アップレギュレーション遺伝子については調整 p値(調整済みP Val)閾値を0.05未満、倍率変化閾値>2.0を設定し、ダウンレギュレーション遺伝子については調整 p値(調整済み P Val)閾値を0.05未満、倍率変化閾値を<0.5に設定しました。これらの閾値は、がんと正常の間で発現差のある遺伝子を特定するための遺伝子発現研究で一般的に使用されています。有意性の閾値の選択は、差次的に発現すると同定された遺伝子の数と同一性に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。さらに、同定された遺伝子の生物学的関連性を慎重に評価し、結果を確認するためにさらなる検証研究を行うことが重要です。

文献では、特にマイクロアレイおよびプロテオミクス研究において、アップレギュレーションされた遺伝子に対して少なくとも2倍の変化、ダウンレギュレーションされた遺伝子に対して<0.5倍の変化を示す遺伝子のみを報告する傾向があった42。以前の研究では、>1.5倍の倍率変化はアップレギュレーションされ、ダウンレギュレーションされた遺伝子では<0.67倍の変化と考えられていた43,44が、過去10年間の文献の傾向は、主に、低倍率の候補に対して検証実験が行われると、mRNAとタンパク質レベルデータの間に弱いか、または相関が見られないため、より高い倍率変化が好まれることを明確に示している45.より高い倍率の変化を選択することには暗い面があり、病気や癌に生物学的に関連する一部の分子を見逃すことがありますが、DEG / DEMのリストを作成するのに適したカットオフのために省略されることがあります。さらに、文献は、DEGが特に発現不足の分子よりも、発現量の増加または過剰発現の分子を好むと報告する方向に偏っています。さらに、分子の発現が複数の研究で同じパターンのアップレギュレーションまたは過剰発現のパターンに準拠している場合、それらが同じ癌または疾患であるかどうかに関係なく、科学者の間で好まれるアプローチです。さらに、同じパターンの過剰発現が複数の疾患で観察され、文献で報告されている場合、それは再び科学界で広く受け入れられます。

さらに、疾患の類似性は、比較にマイクロアレイデータまたは文献のどちらを使用するかに左右されます。最後に、文献における差次的発現の大きさの大まかに定義された記述は、マイクロアレイの倍率変化データ46との限られた相関関係しか示していない。

さらに、大要は、NCBI Entrez gene47、HGNC48、OMIM49、HPRD50,51、Ensemble52、KEGG53、WikiPathways54、GO55、miRBase56、および DGV57 などのデータベースから追加情報を提供することができる。GEO2Rを使用している間、UMAPの評価はサンプルがどのように関連しているかを示します。現在の解析では、2 つの ESCC サンプルに正規サンプルが入力されており、サンプリング エラーがあるか、ESCC サンプルが正規サンプルのグループに表示されるほど不均一であることが示唆されています。

GEO2Rツールはユーザーフレンドリーで簡単にアクセスできますが、いくつかの制限があります。GEO2Rには、PCAプロットやヒートマップを生成したり、品質管理後にサンプルをフィルタリングしたりする機能がありません。同じ系列内のサンプル比較のための 1 つのベン図のみを提供します。GEO2R は Series Matrix ファイルに限定されているため、シリーズ間の比較ができません。さらに、GEO2Rはマイクロアレイデータのみを解析し、サンプルの正規性や相互比較可能性の品質制御は行いません。GEO2Rは、検索結果の数に制限なく、データセット内の特定のペアワイズ比較の上位250個の遺伝子のみを表示します。また、サンプルの反復が不十分なデータセットも解析し、堅牢な統計解析を実現します。GEO2R は、log fold change でデータを提供し、r または Excel シートで fold-change に変換する必要がありました。また、アップレギュレーションされた遺伝子とダウンレギュレーションされた遺伝子を表すには、ヒートマップ58,59,60を作成するために他の別のソフトウェアまたはオンラインツールを使用する必要があります。

要約すると、この記事では簡単なパイプラインが提供されており、これは、わずかな変更を加えたあらゆる種類の悪性腫瘍の大要を作成するために使用できます。大要は、特にバイオマーカーの発見のために生物医学科学者をサポートするために、予後または診断のいずれかのために使用するための臨床現場での検証のための候補分子を提供することにより、時間の必要性があります。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

MKKは、科学技術省の科学技術研究委員会(SERB)とニューデリーのインド医学研究評議会(ICMR)から、TAREフェローシップ(Grant # TAR/2018/001054)の学外助成金(Grant # 5/13/55/2020/NCD-III)をそれぞれ受賞しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NCBI-PUBMEDNCBIセクション 1 を参照。文献の検索に必要
インターネット設備と Web ブラウザを備えたラップトップ/Macbook またはパーソナル コンピューター。
g:ProfilerELIXIR infrastructurehttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostセクション 4.10 を参照。GO:MF、GO:BP、および GO:CC 遺伝子
発現オムニバスNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/セクション 3.1 を参照。マイクロアレイ研究データベース
GEO2RNCBIの検索に必要https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/セクション3.2を参照。GEO2Rツールを使用したデータの分析に必要
GoogleGoogle https://www.google.comセクション1.1を参照。文献の検索に必要
HGNCはヒトゲノム機構(HUGO)の委員会ですhttps://www.genenames.orgDEGs の公式遺伝子記号を知るために必要なセクション6.1を参照します。
HPRDバイオインフォマティクス研究所、バングルル http://hprd.orgタンパク質の構造に関する情報に必要なセクション5.1を参照 
OMIM&nbsp;ジョンズ・ホプキンス大学ボルチモア校http://www.omim.org/entry特定の遺伝子のOMIM IDを知るために必要なセクション8.1を参照 / DEG
Pangloss プログラムChris Seidelによって開発http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiセクション4.9を参照。ベン図の生成に必要
カリフォルニア大学のPANTHER Thomasラボhttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doセクション 4.10 を参照します。GO:MF、GO:BP、および GO:CC
ShinyGO サウスダコタ州立大学http://bioinformatics.sdstate.edu/goセクション4.10を参照。染色体上のDEGの割り当てに必要
https://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed の濃縮に必要 南 のエンリッチメントに必要。

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