モルモットから分離された右心房の収縮期機能の観察

サマリー

本プロトコルは、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を増強する薬物をスクリーニングするための効率的な方法を説明しています。

要約

一般的な慢性心不全(CHF)は、心室の充満および/または排出機能の障害を特徴とし、これが飽くなき心拍出量と発生率の増加につながります。心収縮機能の低下は、CHF の病因の重要な要因です。収縮期機能とは、単に酸素化された血液が左心室に充填され、その後、心拍中に血液が全身に送り出されることです。心臓が弱く、心臓の鼓動に合わせて左心室が適切に収縮できないのは、収縮機能が低下していることを示しています。多くの伝統的なハーブは、患者の心臓の収縮機能を強化することが提案されています。しかし、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための安定的かつ効率的な実験方法は、民族医学研究の過程でまだ不足しています。ここでは、ジゴキシンを例にとると、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための体系的かつ標準化されたプロトコルが提供されています。その結果、ジゴキシンが右心房の収縮性を著しく向上させる可能性があることが示されました。この体系的で標準化されたプロトコルは、CHFの治療におけるエスニック医薬品の有効成分をスクリーニングするための方法論的参照として機能することを目的としています。

概要

心不全は、心筋梗塞、心筋障害、血行動態過負荷、炎症、およびその他の心筋損傷の原因によって引き起こされ、心筋の解剖学的構造と活動を変化させ、最終的には心室のポンプまたは充填の失敗につながります。動悸、疲労感、体液貯留が主な主要な臨床症状^です1。CHF は慢性心不全疾患であり、時間の経過とともに維持、悪化、または代償不全を示す可能性があり、その発生率と有病率は² 歳とともに増加します。心収縮機能の低下は、CHF³ の病因の重要な要因です。この疾患の現在の治療法は、主にアンジオテンシン変換酵素阻害剤、β-アドレナリン受容体(神経ホルモン系、すなわち交感神経系とレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の過剰な活性化を阻害する)、または利尿薬(うっ血^{を軽減する)4}などの降圧薬の使用を伴います.しかし、心拍出量と予備能の減少によって引き起こされる心不全の臨床徴候は、これらの治療の影響を調べる研究ではあまり取り上げられていません⁵。

陽性変力薬は、心筋の収縮性を高めるように設計されています。強心配糖体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、およびβアドレナリン受容体アゴニストは、心不全を治療するための陽性変力薬として使用されます。強心配糖体は主に ジギタリス 誘導体です。一例は、最も一般的に使用されている ジギタリス 誘導体であり、 ジギタリス・ラナタ (白いキツネノテブクロ)⁶に由来するジゴキシンです。それらは細胞膜上のNa⁺/K⁺-ATPaseに選択的に結合して細胞内カルシウム濃度を増加させ、したがって、酸素摂取量を増加させることなく心臓の収縮性と一回拍出量を増加させ、それによって心臓の効率を改善します⁷。強心配糖体以外にも、ホスホジエステラーゼ阻害剤やβアドレナリン受容体アゴニストなどのほとんどの陽性変力薬は、心拍数と心筋酸素消費量を増加させ、心筋細胞のカルシウム負荷を増加させて心筋収縮性を高め、臨床的に重度の不整脈や低血圧を引き起こし、死亡率を増加させる可能性があります⁸.したがって、これらの変力薬の臨床応用は限られています。細胞内カルシウム濃度の上昇による合併症を避けるためには、CHFの治療薬として、より安全で効果の高い変力モジュレーターを開発する必要があります(図1)。

ここ数十年で、心臓の血行動態の正の変力特性をサポートできる化合物を生成および分析するために、多くの研究が行われてきました。Euodia rutaecarpa(Juss.)などの多くの伝統的な漢方薬(TCM)。Benth.、Apocynum venetum L.、およびSophora alopecuroides L.などは、心筋の収縮性を高めることができます^9,10,11。研究により、TCMとその活性モノマーは、変力薬と比較してさまざまなメカニズムを通じて正の変力効果を発揮できることが証明されています。例えば、_C2および_C5(四川Lovage根茎の有効成分の1つ)でメチル化されたリグストラジンの一種であるリグジンジオールは、心拍数を増加させることなく筋小胞体カルシウム過渡性を増強することにより、単離されたラットの心臓の収縮性を有意に増強し、副作用が少なく、CHF12のより良い治療法となる可能性がある。さらに、マトリンはTCM植物Sophora flavescens Aitから抽出されたアルカロイドです。マトリンは、心不全モデルラットにおいて、β_3-ARタンパク質発現のアップレギュレーションを阻害し、eNOS発現を減少させることで、心筋の収縮性を高めることができる¹³。しかし、民族医学の研究では、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための安定的かつ効率的な実験方法が不足しています。

モルモットは、他のげっ歯類と比較して、電気生理学およびカルシウムの取り扱い特性がヒトのものにより類似していることが一般に知られている¹⁴。一方では、モルモットの心電図は人間のそれと十分に類似しており、彼らの心拍Ca²⁺の取り扱いは、ラットやマウスのそれよりも人間の生理学に類似している^15,16。一方、モルモット心筋細胞の計算モデルは広範な研究が行われており、エネルギー学や活性酸素種の代謝¹⁷などの重要な細胞サブシステムが含まれています。したがって、モルモットから単離された右心房は、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするために広く使用されています。ここでは、ジゴキシンを例にとり、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための体系的かつ標準化されたプロトコルを提供します。したがって、この研究は、CHFの治療における民族医学の有効成分をスクリーニングするための方法論的参照を提供します。

プロトコル

実験プロトコルは、寧夏回族自治区医科大学の実験動物の使用および施設の動物管理および使用委員会の要件に従って実施されました。本研究では、体重300〜450gの雄のDunkin-Hartleyモルモットを使用しました。ジゴキシンの収縮性への影響は、モルモットから分離された右心房で観察されました(図2)。

1.モルモットの単離された右心房の酸素化準備

1. 生体信号取得・処理システム、JH-2筋力変換器、マグナス浴、L型換気フック、厚ハサミ、シャーレ、パラフィンなどの実験装置を準備します( 材料表参照)。
2. 1,000 mLの二重蒸留水に7.02 gのNaCl(120.0 mM)、2.10 gのNaHCO₃(25.0 mM)、0.30 gのKCl(4.0 mM)、0.07 gのMgSO4(0.6 mM)、0.07 gの_NaH2PO₄(0.6 mM)、0.28 gのCaCl₂(2.5 mM)、および1.98 gのグルコース(11.0 mM)を添加して、1,000 mLのKrebs-Henseleit溶液(K-H溶液)を調製します。 マグヌスバスを2〜3回すすぎます(表1および材料の表を参照)。
   注意: K-H溶液の温度を37°C±1°Cに保ちます。
3. 100 mLの二重蒸留水に、0.70 gのNaCl(120.0 mM)、0.21 gのNaHCO₃ (25.0 mM)、0.03 gのKCl(4.0 mM)、0.01 gのMgSO₄ (0.6 mM)、0.01 gのNaH₂PO₄ (0.6 mM)、0.01 gのCaCl₂ (0.8 mM)、および0.20 gのグルコース(11.0 mM)を加えて、100 mLの低カルシウムK-H溶液を調製します( 表1 および 材料の表を参照)。
4. 約20 mLの37 °C K-H溶液を手術槽に入れます( 材料の表を参照)。
5. ペトリ皿の底に5 mmの厚いパラフィンを広げ、次にペトリ皿に37°CのK-H溶液を入れます( 材料の表を参照)。
6. L字型の換気フックを膀胱のラテックスチューブの端に取り付け、ペトリ皿に入れて、1〜2個の泡/秒に調整します( 材料の表を参照)。
   注意: 泡をゆっくりと調整します。アクションが速すぎると、酸素がすぐに不足する可能性があります。

2.モルモットからの分離された右心房の調製

1. はかりでモルモットの体重を量ります( 材料の表を参照)。
2. 100%酸素中に5%イソフルランを含む誘導ボックスを使用して麻酔を誘発し、その後、メンテナンスのために1.5%〜3%イソフルランを含むノーズコーンに切り替えます( 材料の表を参照)。
3. 粗いハサミで頸動脈を切断し、抜血を誘発してから皿に載せます。次に、はさみを使用して胸部を開き(剣状突起から始まり、側面を完全に分離して心臓を露出させます)、心膜をはがします。
   1. 左手で心臓を持ち上げ、右手で大動脈の根元から心臓を切り取り、K-H溶液と一緒に手術槽にすばやく置きます。最後に、手で心室を2〜3回優しく押し、心室血を絞り出し、心臓をペトリ皿に入れます。
      注:アクションは活発で、2〜5分で完了し、温度は35°Cに制御する必要があります。 K-H溶液の温度は37°Cに制御する必要があります。
4. パラフィンでコーティングしたペトリ皿に心臓の先端を針で固定し、酸素を供給します(60泡/分)。
5. 適切なアトリウムを特定します。
   注:モルモットでは、心房は腹側表面で肺動脈によって分離され、背側では大動脈によって分離されています。左右の心房はどちらも「逆三角形」のように心室に付着しており、右心房は左心房よりもわずかに小さく、エッジに不均一があります。右心室の心筋は薄く、虚脱の上端は右心房です。左心室はより膨らんでおり、冠状血管の分布は豊富です¹⁸ (図3)。
6. 眼科用鉗子で右心房の端をそっと持ち上げ、房室接合部に沿って切断します( 材料の表を参照)。.
   注:洞房結節の損傷を避け、房室接合部に沿って切断しながら、心室により近くで切断するようにしてください。このステップでは、右心房の自動的なリズミカルな収縮を観察できます。
7. 4-0の外科用縫合糸( 材料の表を参照)を使用して、右心房の上部と下部(「対角線」の両端)をそれぞれ結紮し、一方の端をループさせ、もう一方の端を長い糸の端もループさせます。
   注:心房の「対角線」の両端を結紮するときは、できるだけ少ない組織を結紮するようにしてください。

3. モルモットから分離された右心房の収縮期機能の測定と記録

1. コンピュータの電源を入れ、生体信号取得および処理システムに入ります( 材料の表を参照)。接続チャンネル(第1チャンネル、テンション)を決定した後、ゲイン(50 mV)、時定数(DC)、フィルタ(20 Hz)、スキャン速度(1.00 s/div)を調整します。
2. 試料の一方の端をL字型の換気フックに吊るし、マグヌス浴の横にあるペトリ皿と酸素を入れます。試験片のもう一方の端をJH-2筋力変換器に吊るします( 材料の表を参照)。
3. 心房収縮期曲線を観察し、予荷重を0.5〜1.0 gに調整し、安定するのを待ちます(約30分)。
   注意: KH溶液は20分ごとに交換してください。正規の場合は、観測された曲線を基準として、「正規」とマークします。画面が少し速くスキャンされる場合は、これを遅くする必要があります。
4. 0.2mLの低カルシウムK-H溶液を投与し、曲線が下がらなくなるまで5分間観察します。
5. 0.2 mLの5%ジゴキシン( 材料表を参照)を投与し、5分間観察し、3回洗浄した後、正常に戻します。
   注: 管理をマークします。効果が明らかな場合は、画面をより速くスキャンします。曲線が上がらなくなったとき、つまり収縮振幅が増加しなくなったら、すばやく3回洗います。そうしないと、不整脈が発生し、その後の薬物実験の結果に影響を及ぼします。
6. データを収集し、フロッピー ディスクに保存します。

結果

心筋の収縮性が低下すると、心拍出量が不十分になり、CHFにつながります(図1)。このプロトコルにより、モルモットから分離された右心房の収縮期機能に対するさまざまな薬物の影響を記録し、その後、心筋の収縮性を高める民族薬からの化合物を迅速にスクリーニングすることができました。右心房、JH-2筋力変換器、生体信号取得処理システムを段階的に接続した後、パラメータを適切に設定し、収縮期曲線を観察しました(図2)。曲線の振幅は、右心房収縮の強度を表します。実験は4匹の動物で行い、データは記述統計量と度数分布で分析されました。 図4に示すように、正常条件下では明確な曲線が現れ、0.2mLの低カルシウムK-H溶液を投与すると、曲線は徐々に減少し、変化しなくなるまで、右心房の収縮性が弱まったことを示しています。しかし、5%ジゴキシンを0.2mL投与すると、弯曲が徐々に上昇し始め、右心房の収縮性が増強されたことが示唆された。

ディスカッション

心臓の正常なリズミカルな活動には、孤立した右心房の活動と同様に、適切な物理的および化学的環境が必要です。孤立した右心房は、体の神経支配と全身性体液性因子の直接的な影響から分離されているため、曝露される薬物を変更する際の右心房の活動の変化を観察できます。興奮性細胞における生体電気活性の根本的な原因は、細胞膜のイオン透過性の変化と、それに続く膜¹⁹に沿ったイオンの拡散である。したがって、心筋細胞の膜の外側のイオン濃度の変化は、心筋細胞の生体電気活性と生理学的特性に大きく影響します。イオンの中では、K⁺、Na⁺、Ca²⁺ が最も重要です。血中K⁺ の含有量が過度に高い(7.9 mmol/L以上)と、心筋の興奮性、自動性、伝導性、収縮性が低下し、収縮性の低下、徐脈、伝導ブロックに反映されます。重症の場合、拡張期²⁰で心臓が停止することがあります。血液のCa²⁺ 濃度が上昇する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-0外科用縫合糸	揚州 風田 医療 デバイス 株式会社
5%ジゴキシン(ジメチルスルホキシドに可溶)	TCI上海	D1828	CAS:20830-75-5;純度:>96.0%
BL-420N生体信号取得および処理システム	成都Tai Meng Software Co.、Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24110	CAS:10043-52-4;純度:96%
グルコース	上海yuanyeバイオテクノロジー株式会社	S11022	CAS:50-99-7;純度:99%
イソフルラン	RWDライフサイエンス株式会社	R510-22-16
JH-2筋力トランスデューサ	医学工学研究所、北京、中国
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24120	CAS:7447-40-7;純度:99.5%
マグナスバス	上海未来実験装置有限公司	L046525 MgSO
4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24253	CAS:7487-88-9;純度:98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24119	CAS:7647-14-5;純度:99.5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24161	CAS:7558-80-7;純度:99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co.、Ltd	S24153	CAS:144-55-8;純度:99.8%
手術盆地	広州テレクアン医療機器有限公司		305 mm x 230 mm
眼科用鉗子	蘇州 双路 医療 計器 株式会社
眼科手術用ハサミ	蘇州 双路 医療 計器 株式会社
パラフィン	ライカバイオシステムズ
シャーレ	コーニング	430167	100 mm x 20 mm
げっ歯類麻酔器	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		ABSタイプ(シングルチャンネル)
スケール	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
外科用プレート	鄭州 ケータイ 実験 設備 Co.,		21 cm x 31 cm
ティッシュハサミ	蘇州 双路 医療 計器 株式会社 株式会社	SL0023