LipidUNet-機械学習に基づくiPS細胞由来網膜色素上皮を用いた脂質沈着物のキャラクタリゼーション・定量法

Summary

眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。

Abstract

網膜色素上皮(RPE)は、目の後ろにある六角形の細胞の単層です。光受容体と脈絡膜毛細血管に栄養とサポートを提供し、光受容体外側セグメント(POS)の食作用を行い、外網膜の恒常性を維持するために二極的にサイトカインを分泌します。突然変異、加齢、環境要因によって引き起こされる機能不全のRPEは、他の網膜層の変性をもたらし、視力喪失を引き起こします。変性RPEの特徴的な表現型の特徴は、細胞内および細胞内の脂質リッチ沈着物です。これらの沈着物は、さまざまな網膜変性疾患に共通の表現型です。単遺伝子網膜変性の脂質沈着表現型を in vitroで再現するために、患者の線維芽細胞から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を作製した。Stargardtおよび遅発性網膜変性症(L-ORD)の患者から作製した細胞株にPOSを7日間与えて、RPE生理機能を再現し、これらの疾患でPOS食作用誘発病理を引き起こしました。代替補体活性化に関連する多遺伝子性疾患である加齢黄斑変性症(AMD)のモデルを生成するために、iRPEは代替補体アナフィラトキシンで挑戦されました。細胞内および細胞内脂質沈着物は、ナイルレッド、ホウ素ジピロメテン(BODIPY)、およびアポリポタンパク質E(APOE)を使用して特徴付けられました。脂質沈着物の密度を定量化するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが開発されました。このソフトウェアは、培養表面上のiRPEの最大強度投影画像でトレーニングされました。将来的には、3次元(3D)画像を解析し、脂肪滴の体積を定量化するように訓練される予定です。LipidUNetソフトウェアは、疾患モデルにおける脂質蓄積を減少させる薬剤を発見するための貴重なリソースとなるでしょう。

Introduction

網膜色素上皮(RPE)は、網膜光受容体に隣接する眼の後ろに位置する細胞の単層です。RPEは、光受容体に代謝的および構造的サポートを提供することにより、適切な視力を維持する上で重要な役割を果たします。健康なRPE細胞は、明確な六方晶形態によって特徴付けられる。それらはタイトジャンクションによって接続されており、RPEはその基底側に位置する絨毛毛細血管と頂端に位置する光受容体との間の障壁として作用することを可能にする。網膜生態系を維持するために、RPEは、RPE¹におけるグルコース消費を最小限に抑える方法で、主要な代謝産物、例えばグルコースを光受容体にシャトルする。この制限により、RPEは、β酸化によってケトンに変換する脂肪酸を含む、代謝ニーズを維持するために他の代謝物に依存しています²。視細胞外帯(POS)消化からリサイクルされる可能性が高い脂肪酸をエネルギー源として利用するRPEの傾向を考えると、RPEの脂質処理経路の有害な変化は、単遺伝子性および多遺伝子性変性網膜疾患の両方につながるか、関与することがよくあります³。

RPE変性を引き起こす多遺伝子性変性眼疾患である加齢黄斑変性症(AMD)も、RPE単層における異常なオートファジーおよび脂質代謝に関連しています。機能不全のRPE単層がPOSを処理し、他の重要な機能を実行できないと、RPEとブルッフ膜の間に位置する基底線形沈着物(BLinD)と呼ばれる細胞外(サブRPE)沈着物が発生します-AMD病理の特徴です。BLinDの主成分にはリポタンパク質が含まれ、その中で最も豊富なのはアポリポタンパク質E(APOE)⁴です。BLinDの薄層の蓄積は、AMD ^5,6の臨床症状として認識されている柔らかいドルーセンにつながる可能性があります。

いくつかのグループは、RPE機能障害を引き起こす幹細胞由来のin vitro疾患モデルがサブRPE脂質蓄積を特徴とすることを示しています⁷、^8、9。Hallam et al. (2017)は、CFH遺伝子の多型によりAMDのリスクが高い患者から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を生成しました。iRPEはAPOEでマークされるようにドルーゼン蓄積を示し、高リスクRPEは低リスク患者から生成されたiRPEよりも大きな沈着物を蓄積しました¹⁰。

脂肪滴やドルーゼン沈着などのAMDの細胞の特徴を再現する in vitro モデルを作成するために、患者の血液サンプルから生成されたiRPEラインを、以前に公開された発達ガイドプロトコル¹¹を使用して確立しました。iRPEは、AMDの考えられる原因の1つである代替補体シグナル伝達の増加を模倣するアナフィラトキシンを含む溶液である補体コンピテントヒト血清(CC-HS)に供されました⁸。得られた脂質沈着物の細胞内沈着を、一般的に使用される脂質およびリポタンパク質マーカー、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYを用いて測定した。これらのマーカーを通じて、CC-HSを介した活性化補体シグナル伝達がiRPE細胞⁸における脂質蓄積を悪化させることが示された。

単遺伝子網膜変性疾患の疾患モデルを開発するために、RPEの ABCA4 遺伝子の変異によって引き起こされる疾患であるスターガルト病の患者からiRPE株を開発しました。 ABCA4 がノックアウトされると、高レベルのリン脂質と光依存性脂質過酸化生成物を含むことが知られている細胞内沈着物であるA2EリポフスチンがRPE¹²の内部に蓄積することが以前に示されています。 ABCA4 ノックアウトラインは患者ラインと一緒に開発され、両方ともPOS給餌を受けました。Stargardt iRPEは、POS食作用誘発病理を示し、BODIPY染色によって定量化された脂質蓄積の増加を示しました。 ABCA4 KO由来のRPEをCC-HS処理した。BODIPYシグナルの定量化は、同様にスターガルト病モデルにおける脂質取り扱いの欠陥を示した⁹。

これらの疾患の有病率と効果的な治療法の必要性を考えると、上記の関連する疾患モデルとともに、潜在的な治療法の有効性を定量化するための堅牢な方法を確立する必要があります。客観的、自動化、標準化された方法で脂質沈着を定量するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが作成され、マスク分析ツールと組み合わせると、一般的なマーカーであるNile Red、BODIPY、およびAPOEを使用して脂質沈着を迅速かつ効果的に識別できます。この分析パイプラインを使用して得られた要約統計量は、分析してグラフィカルに表示することができ、治療条件の比較が容易になります。プロトコルの回路図を 図1に示します。

図1:プロトコルの概略図:RPE細胞を96ウェルプレート上で増殖させ、活性ヒト血清または精製ウシ外側セグメントでチャレンジして、in vitroでさまざまな種類の網膜変性をモデル化します。RPE細胞は、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEでリポタンパク質沈着物について固定および染色されます。共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識された脂質粒子のZスタックを取得し、その後、2D最大強度投影に加工します。機械学習アルゴリズムは、リポタンパク質粒子を認識して正しくセグメント化するようにトレーニングされました。粒子数とさまざまな形状メトリックを含むサマリーテーブルが生成され、その後のプロットと統計分析に使用できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

すべてのプロトコルステップは、NIHの人間研究倫理委員会によって定められたガイドラインに準拠しています。幹細胞の研究と患者のサンプル収集は、米国政府の45 CFR 46ガイドラインに従って、NIHの人間研究保護局(OHRP)の下の複合神経科学施設内審査委員会(CNS IRB)によって承認されました。患者サンプルは、プロトコル番号NCT01432847(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1)の下でヘルシンキ宣言によって設定された基準に従って、CNS IRB承認の同意書を使用して収集されました。

1. iRPE の生成

1. Sharmaらによって公開されたプロトコルに従って、患者の血液由来iPS細胞からiRPEを生成します, 2022¹¹ (図2 および 図3)。

図2:iRPEの分化と成熟の概略図。iRPEを生成するために、確立された分化プロトコルに従い、細胞を5週間成熟させました。得られた細胞培養は、AMDやスターガルト病などの疾患におけるRPE機能障害を模倣するために様々な処理で操作することができるin vitroモデルとして機能します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:RPEの分化と成熟の成功と失敗の代表的な画像。 TJP1 RPEの倍率10倍の2つの明視野画像が、iRPEプロトコルの42日目に表示されます。(A)分化と成熟が成功すると、色素沈着と多角形の形態を伴うコンフルエントなRPEが示されます。(B)分化と成熟の失敗は、ここに示すように、死にかけている細胞のクラスターを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. RPE メンテナンス メディア (RPE-MM) の準備

1. N2サプリメントを4°Cで一晩解凍します。他のすべての試薬を室温(RT)で解凍します。
2. 無菌条件下で、Sharmaら、2022¹¹によって確立されたプロトコルに従って、表1にリストされている試薬をリストされた希釈係数で追加します。
3. 培地をよく混合し、0.22 μmのろ過ユニットを使用してろ過します。
   注意: メディアは、2°Cで保管した場合、4週間以内の使用に適しています。

3. 96ウェルプレート播種

1. ビトロネクチンのアリコートをRTで3〜5分間、または氷が完全に溶けるまで解凍します。
2. ビトロネクチンを1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈し、1:200希釈液(ビトロネクチン:DPBS)を使用して目的の作業溶液を取得します。96ウェルプレートの場合、各ウェルに200 μLの作業溶液をコーティングします。
3. 解凍したROCK阻害剤(Y-27632二塩酸塩)とRPE-MMを1:1000の希釈で組み合わせて、最終濃度10 μMにします。RPEセルのめっき媒体です。
4. 自動細胞融解システムを使用してiRPEバイアルを解凍し、iRPE細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。
5. 細胞懸濁液を1:10希釈でめっき培地で希釈します。チューブを400 x g で5分間遠心分離します。
6. 上清を注意深く吸引し、細胞を10 mLのプレーティング培地に再懸濁します。
7. 細胞計数のために、400 μLのめっき培地を再懸濁した細胞溶液100 μLと混合します。このアリコートを使用して、細胞生存率カウンターを使用して細胞懸濁液の生細胞濃度を決定します。
8. 細胞懸濁液をプレーティング培地で最終濃度60,000細胞/mLに希釈します。
9. 96ウェルプレートからビトロネクチンコーティング溶液を完全に吸引し、200 μLの細胞懸濁液を各ウェルに分注します。約12,000セル/ウェルまたは~200セル/mm²になります。
10. 播種した細胞プレートを37°Cおよび5%_CO2で48時間インキュベートします。48時間後、培地をROCK阻害剤サプリメントなしのRPE-MMに変更します。.5週間の成熟期間中、2〜3日ごとに培地を交換してください。

4. 体外 疾患モデル

1. コンピテントヒト血清(CC-HS)治療を補完する
   1. ヒト補体コンピテントセラムを4°Cで一晩解凍します。
   2. CC-HSを調製し、無能ヒト血清(CI-HS)培地を補完します。
2. 1. 4. 
         
      8. 
         
         
   2. 2. 
         

1. 1. 
      
   2. 
      
   4. 
      
2. 3. 
      
3. 6. 
      

1. 
   

2. 
   
6. 
   

Results

このプロトコルは、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEによって染色された脂質沈着物を特定するためのワークフローを提供します。開発されたソフトウェアは、脂質沈着物を自動的に識別して定量することができ、概説されたプロトコルが最適化されたときに最高のパフォーマンスを発揮します。細胞モデルの品質は適切な画像セグメンテーションの品質に大きく影響するため、分化に成功したRPE(図3A)と低分化したRPE(図3B)の例が含まれています。

プロトコルに記載されている3つのマーカーのうち2つ、ナイルレッドとボディピーは、蛍光画像ではっきりと明るい小さな円形のポイントとして識別されます(図5および図6)。プロトコルからの「ポジティブ」画像は、これらの異なる堆積物の適切な識別です(図5A-Dおよび図5E-H)。「ネガティブ」の結果は、弱い染色(図6A-Cおよび図6D-F)または高いバックグラウンド強度(図6G-I)のいずれかのために、バックグラウンド蛍光を堆積物と間違えることにより、画像の誤ったセグメンテーションを示します。

APOE鉱床にはさまざまなサイズと形状があり、ナイルレッドやボディピーの円形の堆積物ではなく、より楕円形または不規則に見えます。これらの堆積物はまた、点状が少なく、サンプルの透過性の変動により、信号強度が堆積物間で異なる可能性があります。正しい識別は、飽和度の低いものを含む各鉱床を識別しますが(図5I-L)、誤ったセグメンテーションはこれらの鉱床を拾いません(図6J-L)。したがって、急激なばらつきを避けるために、染色およびイメージング方法を最適化することが重要です。これを行う1つの方法は、免疫染色中にサンプルの透過処理ステップに注意を払うことです。蛍光シグナルを最適化するために、APOEの固定および免疫染色の前に細胞を溶解することができ、その結果、APOE沈着物の均一な飽和とより良いセグメンテーションが得られます。

96ウェルプレート以外の培養プラットフォームで成熟した細胞のセグメント化された画像も提供される。LipidUNetソフトウェアは、トランスウェルで培養された細胞の画像で実行され、脂質沈着物が閾値化される一方で、トランスウェル膜の細孔も閾値化されます(図6M-O)。形状とサイズが類似しているため、現在の形のLipidUNetソフトウェアは、脂質沈着物とトランスウェル孔の両方を無差別にマスクします。

図5:代表的な結果。 (A、E、I)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,F,J)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,G,K)すべての堆積物が正しく識別されるLipidUNetによって生成されたマスク。(D,H,L)マスクされた各パーティクルのアウトラインには番号が付けられます。これらのラベルを使用すると、画像内の各粒子を生データを含むスプレッドのエントリに接続できます。(A-D)はナイルレッド染色を示しており、ソフトウェアは弱い信号にもかかわらずバックグラウンドに対する堆積物を正確に認識することができます。(E-H)は、BODIPY信号とバックグラウンドの間に強いコントラストを示し、これは理想的です。LipidUNetは、画像内のすべての堆積物を正しく識別します。(I-L)は強いAPOEシグナルを示し、この染色でよく見られるシグナル飽和の変動性を表します。それにもかかわらず、画像セグメンテーションは各APOEデポジットの境界を識別することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:最適ではない結果。 (A、D、G、J、M)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,E,H,K,N)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,F,I,L,O)LipidUNetによって生成されたマスクが正しくありません。赤い円は、ソフトウェアが脂質沈着物を誤って識別した場所を示します。(A-C) ソフトウェアがバックグラウンド染色を堆積物として識別したため、Nile Redの処理が正しくありません。これは、画像にバックグラウンドは高いが脂質沈着物がほとんどない場合に、より頻繁に発生する可能性があります。BODIPY染色の2つの例が示されています:(D-F)弱いBODIPY染色による低品質の画像と(G-I)高いバックグラウンドの強いBODIPYシグナル。どちらの場合も、ソフトウェアは、核を囲む背景の円形リングから小さな円形の脂質沈着物を区別することができません。染色とイメージングはこれらのエラーを回避するために最適化する必要がありますが、最新バージョンのLipidUNetはこれらの画像に対して大幅に改善されています。(J-L)APOEセグメンテーションが正しくありません。堆積物は信号のサイズと飽和度がより可変であるため、ソフトウェアはいくつかの堆積物を認識するのが困難です。(M-O)RPEをトランスウェルに播種し、ナイルレッドで染色した。Zスタックのスライスは、ナイルレッド脂質沈着物とトランスウェル孔の両方とともにここに示されています。ソフトウェアは、トランスウェル孔を含む赤い円とナイルレッド鉱床を指す緑色の矢印で示されているように、2つを区別できません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:マスクツールの比較 。 (A、B、C)脂質沈着量が変動する96ウェルメッキRPEは、ナイルレッド(赤)で識別されます。画像は、最大検索、最大エントロピー、およびRenyiエントロピーの3つの異なる一般的なマスク方法を使用してマスクされ、LipidUNetで生成されたマスクと比較されます。元の画像には脂質沈着物の手動カウントが添付され、マスクには各セグメンテーション方法による予測カウントが表示されます。平均エラー率は、次の式を使用してセグメンテーションの各方法について計算されました:mean[(|予測カウント - 手動カウント|/手動カウント) x 100]。LipidUNetで生成されたマスクは、他のマスキング方法と比較して、沈着が変動する画像全体で脂質沈着をより正確に識別します(平均エラー率:23%LipidUnet、1164%Find Maxima、851%最大エントロピー、203%Renyiエントロピー)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

コンポーネント	猫番号	ストックコンク	最終コンク	ミリリットル
MEM アルファ	12571-063	該当なし		500
N2サプリメント	17502-048	該当なし	1%	5
熱不活性化FBS	SH30071.03	該当なし	5%	25
NMEM NEAA	11140-050	10ミリメートル	0.01ミリメートル	5
ピルビン酸ナトリウム	11360-070	100ミリメートル	1ミリメートル	5
ペニシリン-ストレプトマイシン	15140-122	10000u/mL	100U/mL	5
タウリン	T4571	50ミリグラム/ミリリットル	250グラム/ミリリットル	2.5
ヒドロコルチゾン	H6909	18.1ミリグラム/L	20ug / L	0.553
T3	T5516	20ug / L	0.013ug/L	0.33
総容量、mL				548.383

表1:RPE-MM試薬組成。 RPE-MMの試薬と最適濃度のリスト。

Discussion

このプロトコルは、変性眼疾患の単一遺伝子および多遺伝子 のin vitro 疾患モデルにおいて脂質沈着を効率的に標識、画像化、および定量する方法を提供します。AIベースのソフトウェアであるLipidUNetは、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYの3つの一般的な脂質マーカーに適用でき、定量を標準的かつ偏りのない高速自動分析方法を提供します。

LipidUNetの主な制限は、AIのトレーニングデータセットが96ウェルプレートで培養された細胞の40倍の倍率画像に制限されていたという事実です。トレーニング画像セットの結果として、LipidUNetは、現在の形式では、40倍の倍率画像の分析に限定されます。このソフトウェアは、96ウェルプレート以外の他の培養表面で培養された細胞の40倍の画像を分析するために使用できますが、ソフトウェアによる正確な閾値を検証するために、生成された出力マスクを調べるように注意する必要があります。分析できるサンプル/画像の範囲を拡大するには、より多くの画像セット(異なる倍率)が必要になります。

プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。脂質マーカーステップでは、ユーザーは選択した標識化合物(BODIPY、APOE、ナイルレッド)がサンプルを効果的に標識したことを確認する必要があります。成熟RPE細胞は色素沈着が強いことが多く、抗体免疫染色の蛍光シグナルを損なう可能性があります。蛍光シグナルが弱い場合やバックグラウンド染色が多すぎる場合、LipidUNetは脂肪滴を正確に識別できません。同様の理由から、プロトコルの自動イメージングステップに対して適切に選択された取得設定を使用する必要があります。取得した画像の品質が低い場合、LipidUNetは画像を適切にマスクするのに苦労するため、定量化は不正確になります(図6A-L)。最後に、LipidUNetにはソフトウェアが機能するための特定の要件があるため、画像の後処理は重要なステップです。

手動閾値を使用する脂質分析のワークフロー、またはフィジーのようなソフトウェアで自動閾値化を含む技術と比較すると、LipidUNetは、脂質粒子の同定における小さなエラー率に反映されるように、可変脂質沈着を伴う画像全体で非バイアスで信頼性の高いセグメンテーションを提供します(図7)。このソフトウェアでは、追加のトレーニング画像をユーザーが入力できるため、プロトコルで概説されているように、40倍の倍率の対物レンズを利用する画像セットや、異なる脂質マーカーを利用する画像セットの解析も可能です。将来的には、脂質沈着量の定量化が可能になるように、3D画像を解析するようにソフトウェアをトレーニングする予定です。脂質沈着を病態の主な原因とする変性眼疾患が蔓延しており、高齢者人口の拡大に伴い症例が増加すると予測されています¹³。このプロトコルで概説したように、正確な疾患モデルと効率的な分析ツールは、新しい治療介入の開発を可能にします。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 以上m Steriflip フィルターシステム	EMD ミリポア	SCGP00525
1x ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	Gibco	14190-144
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma	T5516
ウシアルブミン、フラクション V	MP バイオメディカル	160069
Alexa Fluor 555 ウサギ抗ヤギ IgG (H+L)	Invitrogen	A21431	APOE二次抗体
APOE 一次抗体	ミリポアシグマ	AB947
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	光から保護
する コンプリテンシー コンピテントヒト血清	ミリポアシグマ	S1-LITER
CTS N2 サプリメント	ライフテクノロジー	A13707-01
ウシ胎児血清	ハイクロン	SH30071.03
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	スライド封入剤
ガラスカバースリップ #1 1/2 22 mm x 22 mm	電子顕微鏡科学	72204-01
ガラス顕微鏡スライド 25 mm x 75 mm- 1.2 mm 厚さ	電子顕微鏡科学	71870-01
ヒドロコルチゾン	Σ	H0396
MEM Alpha	Life Technologies	12571-063
MEM 非必須アミノ酸	Life Technologies	11140
ナイルレッド	シグマ	72485-100MG	パラ
ホルムアルデヒド 16% 溶液、EM グレード	電子顕微鏡科学	15710
ペニシリン連鎖球菌	Life Technologies	15140-148
リン酸緩衝生理食塩水 10x	Gibco	70011-044
ロッドアウターセグメント (OS)	InVision Bioresources	98740
重炭酸ナトリウム	Sigma Aldrich	S5761
ピルビン酸ナトリウム	Life Technologies	11360-070
ショ糖	Sigma Aldrich	S1888
SYBR Green Master Mix	Bio-Rad	1725274
タウリン	シグマ	T0625
トンX-100	グマ	9002-93-1
イーン20超高純度	アフィメトリックス	9005-64-5
トロネクチン	ライフテクノロジー	ズA14701SA
Y-27632二塩酸塩	R&Dシステムズ	1254