アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

Summary

このプロトコルは Acinetobacterのbiofilmsのinoculum、水紫色の染料、biofilmsの生存可能な計算および視覚化を使用してmicrotitterの版のbiofilmの定量化の準備を記述する。

Abstract

アシネトバクター は院内感染を引き起こし、そのバイオフィルム形成は病院環境などの乾燥した表面での生存に寄与する可能性があります。したがって、バイオフィルムの定量化と可視化は、 アシネトバクター 株が院内感染を引き起こす可能性を評価するための重要な方法です。マイクロプレートの表面に形成されるバイオフィルムは、体積と細胞数で定量化できます。バイオフィルムの量は、クリスタルバイオレットを使用した染色、洗浄、エタノールによる脱色、およびマイクロプレートリーダーを使用した可溶化色素の測定によって定量化できます。バイオフィルムに埋め込まれた細胞の数を定量化するために、バイオフィルムを細胞スクレーパーを使用してスクラップし、生理食塩水で回収し、ガラスビーズの存在下で激しく攪拌し、アシネトバクター寒天培地に広げます。次に、プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。インキュベーション後、赤いコロニーを列挙して、バイオフィルム内の細胞数を推定します。この実行可能な計数法は、混合種バイオフィルム中の アシネトバクター 細胞を計数するのにも有用です。 アシネトバクター のバイオフィルムは、蛍光色素を用いて可視化することができます。顕微鏡分析用に設計された市販のマイクロプレートを使用して、バイオフィルムを形成します。次に、底面に付着したバイオフィルムをSYTO9およびヨウ化プロピジウム色素で染色し、洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化します。

Introduction

アシネトバクターは院内感染を引き起こすことが知られており、特に医療施設でのヒト感染の報告が増えています¹。病院、医療施設、食品関連環境で広く普及しています^2,3,4。ベッドの手すり、ベッドサイドテーブル、人工呼吸器の表面、シンク4などの病院の表面を含む環境で長期間生存^{できます。}このような環境表面への残留性は、アシネトバクター4の院内感染に寄与する重要な要因の1つである可能性があります。

バイオフィルムは微生物の生命形態であり、生きた微生物細胞と細胞由来^の細胞外高分子物質(EPS)で構成される微生物マトリックスである5。微生物細胞はマトリックスに埋め込まれており、多くの場合、熱、塩分、乾燥、抗生物質、消毒剤、せん^{断力などの}環境ストレスに対して高い耐性があります^6,7。

アシネトバクター

Protocol

1.細菌接種物の調製

1. -80°Cで保存したグリセロールストックバイアルを取り出します。
2. 滅菌ピペットチップを使用してバイアルから細菌株(2〜10 μL)を除去します。.
   注:アシネトバクター株、A. bouvetii(13-1-1)、A. junii(13-1-2)、A. pittii(13-2-5)、A. baumannii(13-2-9)、A. radioresistens (20-1)、およびA. ursingii(24-1)は、このプロトコルで使用されます。
3. 市販の血液寒天プレート(5%羊の血液を添加したトリプシン大豆寒天、 材料表参照)に細菌を接種します。
   注:栄養寒天やマッコンキー寒天などの他の培地も使用できます。
4. 断続的に燃え上がる滅菌ループを使用して寒天の表面を縞模様にして薄くします。
5. 寒天プレートを逆さまにしてインキュベーターに入れ、30°Cで一晩20〜24時間インキュベートします。
6. 滅菌針で細菌培養の単一コロニーを選別し、5 mLの滅菌脳心臓輸液ブロス(BHI、 材料表を参照)を培養液に接種します。
7. 接種した培養液を30°Cの振とうイン....

Results

プロトコールに従って、厨房の表面から単離された アシネトバクター 分離株のバイオフィルムをポリスチレン製の96ウェルプレート上に形成し、クリスタルバイオレットで染色し、色素をエタノールに可溶化し、バイオフィルムの質量を測定しました(図1)。バイオフィルムの数は、OD0.04から1.69の範囲で株によって大きく異なります(図1)。Stepanovićらによって確立された基準に基づいて¹⁶、 A. bouvetii を除くすべての分離株がバイオフィルムを形成しました。 A.放射性レジステンは 弱いバイオフィルムを形成した。A. junii と A. baumannii は中程度のバイオフィルムを形成し、A. pittii と A. ursingii は強いバイオフィルムを形成した。

バイオフィルム.......

Discussion

記載されたプロトコルを使用して、さまざまな程度の アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成を測定、視覚化し、バイオフィルム内の生細胞を推定しました(図1、図 2、 および図3)。

このプロトコルでは、アシネトバクターの増殖に30°C、バイオフィルム形成に25°Cの2つの異なる温度を使用しました。30°Cが用いられたのは、多くの研究がアシネトバクターの最適な増殖のために30°C以上を使用したためであり、これは十分な接種菌を得るのに適切であろう^12,13,14,17。ただし、この温度は一般に、病院の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェル細胞培養プレート	SPL	30096	ポリスチレン 96ウェルプレート
BHI (Brain Heart Infusion) ブロス	Merck KGaA	1.10493.0500
血液寒天培地 ベースプレート	KisanBio	MB-B1005-P50	アシネトバクター用増殖培地
CHROMagar アシネトバクター	CHROMagar	AC092	アシネトバクター用選択プレート
クリスタルバイオレットsolution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant Biofilm	measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	CLSM用のマイクロプレート