骨髄由来マクロファージ由来の微小細胞外小胞ペプチドの同定

Summary

このプロトコルは、示差超遠心によってマクロファージから小さな細胞外小胞を単離し、質量分析による同定のためにペプチドームを抽出する手順を説明しています。

Abstract

小さな細胞外小胞(sEV)は、通常、多胞小体(MVB)のエキソサイトーシスによって分泌されます。直径<200nmのこれらのナノベシクルは、さまざまな体液中に存在する。これらのsEVは、タンパク質、DNA、RNA、代謝物などの貨物を介して、遺伝子の転写と翻訳、細胞の増殖と生存、免疫と炎症などのさまざまな生物学的プロセスを調節します。現在、sEVの絶縁のためにさまざまな技術が開発されています。その中で、超遠心分離ベースの方法はゴールドスタンダードと見なされており、sEVの分離に広く使用されています。ペプチドは、長さが50アミノ酸未満の天然の生体高分子です。これらのペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、細胞成長因子などの生物学的活性を有する様々な生物学的プロセスに関与している。ペプチドドームは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によって特定の生物学的サンプル中の内因性ペプチドを体系的に分析することを目的としています。ここでは、示差超遠心法によってsEVを単離するプロトコルを導入し、LC-MS/MSによる同定のためにペプチドドームを抽出しました。この方法により、骨髄由来マクロファージから数百のsEV由来ペプチドが同定されました。

Introduction

直径200nm未満の小さな細胞外小胞(sEV)は、ほぼすべての種類の体液に存在し、尿、汗、涙、脳脊髄液、羊水など、あらゆる種類の細胞から分泌されます¹。当初、sEVは細胞廃棄物を処分するための容器と見なされていたため、その後の10年間で最小限の研究につながり^{ました2。}最近、sEVに特定のタンパク質、脂質、核酸、およびその他の代謝物が含まれていることを示す証拠が増えています。これらの分子は標的細胞³に輸送され、細胞間コミュニケーションに寄与し、それを介して組織修復、血管新生、免疫4および炎症^5,6、腫瘍の発生および転移^7,8,9などの様々な生物学的プロセスに関与する。

sEVの研究を容易にするには、複雑なサンプルからsEVを分離することが不可欠です。sEVの密度、粒子サイズ、表面マーカータンパク質など、sEVの物理的および化学的特性に基づいて、さまざまなsEV分離方法が開発されています。こ....

Protocol

1. 小細胞外小胞の単離

注意: 1.1°Cでステップ1.1-1.11のすべての遠心分離を実行します。

1. sEVフリーウシ胎児血清(FBS)の調製:FBSを超遠心分離機(材料表を参照)を介して4°Cで110,000 × gで一晩遠心分離し、内因性sEVを除去します。上清を回収し、0.2 μm限外ろ過膜でろ過滅菌し、-20°Cで保存します。
2. 150 mm培養皿に約3 x 10⁷ 不死化骨髄由来マクロファージ(iBMDM)をプレートし、20 mLのDMEM培養液を加え ます(材料表を参照)。
3. sEVを収集する前に、メディアを廃棄してください。細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水; 材料表)10%sEVフリーのFBSを含む培地と交換します。
4. 実験の必要性に応じて、細胞上清を収集し、50 mL遠沈管に移します。
5. 細胞上清を300 × g で10分間遠心分離して細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい50 mL遠沈管に移します。
6. 上清を2000 × g で10分間遠心分離して死細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい高速遠心チューブに移します(

Results

示差超遠心法で単離したsEVについて(図1)、国際細胞外小胞学会(ISEV)¹⁷に従って形態、粒度分布、タンパク質マーカーを評価しました。

まず、sEVの形態をTEMで観察したところ、典型的なカップ状の構造が示されました(図2A)。NTAは、単離されたsEVが主に136 nmに集中していることを示し(図2B)、これは報告されたサイズ(30-150 nm)^{と一致していました1}。最後に、sEVのタンパク質マーカーをウェスタンブロットで同定しました。その結果、単離されたsEVは、CD9、βアクチン、TSG101などのsEVのマーカーが有意に濃縮されていることが示されました。小胞体マーカーGRP94は、細胞ライセート全体でのみ検出されました(図2C)。これらの.......

Discussion

sEVの機能を調べる際には、潜在的な汚染を避けるために、複雑な生物学的サンプルから高純度のsEVを得ることが不可欠です。sEVの分離にはさまざまな方法が開発されており¹³、これらの方法の中で、示差超遠心ベースの方法は比較的高い純度のsEVを示しています。本研究では、200 mLの細胞上清を6時間回収し、示差超遠心により約200〜300 μgのsEVが得られた。ただし、超遠心分離中はsEVペレットが見えない場合があることに注意してください(ステップ1.8)。したがって、チューブの底をできるだけピペットで固定することをお勧めします。このステップは重要であり、sEVの歩留まりに直接影響します。さらに、sEVが110,000 × g で沈殿した場合の遠心分離時間や細胞上清収集期間の延長など、収量を向上させるためにはプロトコルのさらなる最適化が必要です(ステップ1.8および1.9)。示差超遠心で単離されたsEVは純度が高いですが、時間がかかります。

現代の質量分析技術と遺伝子データベースの進歩により、さまざまな生物の組織や体液.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCAタンパク質アッセイキット	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
遠心フィルターチューブ	ミリポア	UFC5010BK
遠心分離機ボトル ポリプロピレン	ベックマン・コールター	357003	高速遠心分離機
化学発光基質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	34580
ジチオスレイトール	Solarbio	D8220	100 g
DMEM 培養液	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)ヨー
ドアセトアミド	Sigma	l1149	5 g
マイクロチューブ ポリプロピレン	ベックマン コールター	357448	1.5 mL 卓上型超遠心分離機
ナノ高性能LCシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EASY-nLC 1000
ナノ粒子トラッキング分析	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X 質量分析計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N/A
リン酸緩衝生理食塩水	Solarbio	P1020
ポリアロマー遠心チューブ	ベックマン・コールター	326823	超遠心分離
機 プロテアーゼ阻害剤	Bimake	B14002
SpeedVac 真空濃縮器	エッペンドルフ	濃縮器と
卓上型超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ MAX-XP	超遠心ローター (TLA 55)
透過型電子顕微鏡	日立	H-7650B
TSG101	シグマ	AF8258
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ XPN-100	超遠心分離機ローター(SW32 Ti)
超音波細胞攪乱器	Scientz	SCIENTZ-IID
ウェスタンブロットイメージ	ャーBio-Rad	ChemiDocXRs	イメージラボ4.0(ベータ7)
β-アクチン	シグマ	A3853