骨髄由来マクロファージ由来の微小細胞外小胞ペプチドの同定

Summary

このプロトコルは、示差超遠心によってマクロファージから小さな細胞外小胞を単離し、質量分析による同定のためにペプチドームを抽出する手順を説明しています。

Abstract

小さな細胞外小胞(sEV)は、通常、多胞小体(MVB)のエキソサイトーシスによって分泌されます。直径<200nmのこれらのナノベシクルは、さまざまな体液中に存在する。これらのsEVは、タンパク質、DNA、RNA、代謝物などの貨物を介して、遺伝子の転写と翻訳、細胞の増殖と生存、免疫と炎症などのさまざまな生物学的プロセスを調節します。現在、sEVの絶縁のためにさまざまな技術が開発されています。その中で、超遠心分離ベースの方法はゴールドスタンダードと見なされており、sEVの分離に広く使用されています。ペプチドは、長さが50アミノ酸未満の天然の生体高分子です。これらのペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、細胞成長因子などの生物学的活性を有する様々な生物学的プロセスに関与している。ペプチドドームは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によって特定の生物学的サンプル中の内因性ペプチドを体系的に分析することを目的としています。ここでは、示差超遠心法によってsEVを単離するプロトコルを導入し、LC-MS/MSによる同定のためにペプチドドームを抽出しました。この方法により、骨髄由来マクロファージから数百のsEV由来ペプチドが同定されました。

Introduction

直径200nm未満の小さな細胞外小胞(sEV)は、ほぼすべての種類の体液に存在し、尿、汗、涙、脳脊髄液、羊水など、あらゆる種類の細胞から分泌されます¹。当初、sEVは細胞廃棄物を処分するための容器と見なされていたため、その後の10年間で最小限の研究につながり^{ました2。}最近、sEVに特定のタンパク質、脂質、核酸、およびその他の代謝物が含まれていることを示す証拠が増えています。これらの分子は標的細胞³に輸送され、細胞間コミュニケーションに寄与し、それを介して組織修復、血管新生、免疫4および炎症^5,6、腫瘍の発生および転移^7,8,9などの様々な生物学的プロセスに関与する。

sEVの研究を容易にするには、複雑なサンプルからsEVを分離することが不可欠です。sEVの密度、粒子サイズ、表面マーカータンパク質など、sEVの物理的および化学的特性に基づいて、さまざまなsEV分離方法が開発されています。これらの技術には、超遠心ベースの方法、粒子サイズベースの方法、イムノアフィニティー捕捉ベースの方法、sEV沈殿ベースの方法、およびマイクロフルイディクスベースの方法が含まれる¹⁰、^11、12。これらの技術の中で、超遠心分離ベースの方法は、sEV分離のゴールドスタンダードとして広く認識されており、最も一般的に使用されている技術です¹³。

ますます多くの証拠が、様々な生物のペプチド中に未発見の生物学的に活性なペプチドが多数存在することを示唆している。これらのペプチドは、成長、発達、ストレス応答14、^15、およびシグナル伝達¹⁶を調節することにより、多数の生理学的プロセスに大きく貢献します。sEVのペプチドドームの目的は、これらのsEVが担うペプチドを明らかにし、その生物学的機能の手がかりを提供することです。ここでは、示差超遠心によってsEVを単離し、続いてこれらのsEVからペプチドを抽出してペプチドドームをさらに分析するプロトコルを紹介します。

Protocol

1. 小細胞外小胞の単離

注意: 1.1°Cでステップ1.1-1.11のすべての遠心分離を実行します。

1. sEVフリーウシ胎児血清(FBS)の調製:FBSを超遠心分離機(材料表を参照)を介して4°Cで110,000 × gで一晩遠心分離し、内因性sEVを除去します。上清を回収し、0.2 μm限外ろ過膜でろ過滅菌し、-20°Cで保存します。
2. 150 mm培養皿に約3 x 10⁷ 不死化骨髄由来マクロファージ(iBMDM)をプレートし、20 mLのDMEM培養液を加え ます(材料表を参照)。
3. sEVを収集する前に、メディアを廃棄してください。細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水; 材料表)10%sEVフリーのFBSを含む培地と交換します。
4. 実験の必要性に応じて、細胞上清を収集し、50 mL遠沈管に移します。
5. 細胞上清を300 × g で10分間遠心分離して細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい50 mL遠沈管に移します。
6. 上清を2000 × g で10分間遠心分離して死細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい高速遠心チューブに移します( 材料表を参照)。
7. 上清を10,000 × g で高速遠心分離機で30分間遠心分離し、細胞破片や微小胞を除去し、ペレットを廃棄して、上清を新しい超遠心チューブに移します( 材料表を参照)。開放型超遠心管の容量は38.6mLです。35 mLの細胞上清を各チューブに入れます。
8. 上清を110,000 × g のスイングバケットローター遠心分離機( 材料表参照)で70分間遠心分離し、粗sEVペレットを得る。
9. 上清を捨て、sEVが豊富なペレットを1 mLのPBSで洗浄します。卓上超遠心分離機で110,000 × g で70分間遠心分離します( 材料表を参照)。上清を捨て、1 mLのPBSを超遠心チューブに加えます。
10. 次に、沈殿物を連続的にピペットで移動し、1 mLのPBSを別の超遠心チューブに移し、ピペッティングによってすべての超遠心チューブが混合されるまで続けます。
11. 上清を捨て、ペレットをsEVである100 μLのPBSに再懸濁します。
12. 以下の手順に従って、ビシンコニン酸(BCA)法を使用してsEVの総タンパク質を測定します( 材料表を参照)。
    1. タンパク質標準液の調製:標準プロテインチューブ(BSA30 mg)に1.2 mLのタンパク質調製液を加えて完全に溶解し、タンパク質標準溶液(25 mg/mL)を調製します。次に、PBSで最終濃度0.5 mg/mLに希釈します。
    2. 0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、および20 μLのタンパク質標準物質を96ウェルプレートに加え、PBSを加えて20 μLを構成します。同時に、18 μLのHEPES溶解バッファー(20 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM NaF、0.5% Triton X-100)と2 μLのsEVサンプルをテスト対象のサンプルウェルに追加します。
    3. 製造元の指示に従って必要なBCA作業溶液を調製し、各ウェルに200μLのBCA作業溶液を追加し、室温(RT)で20〜30分間置きます。
    4. マイクロプレートリーダーで波長562nmの吸光度を測定し、標準曲線と希釈倍率に従ってsEVの総タンパク質濃度を算出します。
       注:このプロトコルによって40 mLの上清から抽出されたsEVは、その後のタンパク質マーカーの同定に使用できます(ウェスタンブロット)。しかし、200 mLの細胞上清から抽出したsEVは、形態観察(透過型電子顕微鏡、TEM)と粒子径分析(ナノ粒子追跡分析、NTA)の両方に使用することができます。具体的には、ステップ1.11で採取したsEVについては、100μLのPBSで再懸濁します。形態観察(TEM)のために20〜30 μLを取り、粒子サイズ分析(NTA)のために残りのサンプルを1 mL PBSに再懸濁します。すべての遠心分離機は事前に予冷されています。ステップ1.8では、これらの超遠心チューブは厳密にバランスが取れており、少なくとも4分の3が満たされている必要があります。そうでない場合は、メイクにミディアムを追加します。ステップ1.11の場合、sEVは4°Cで短期間(12時間)保管できます。それ以外の場合は、ペプチドの抽出を妨げるタンパク質分解を避けるために、-20または-80°Cで保存する必要があります。ただし、形態の観察や粒子径の測定に使用するサンプルについては、4°Cで短期間(12時間)保存することをお勧めします。

2. 透過型電子顕微鏡によるsEVの形態観察

1. パラフィルム上に新鮮なsEVサンプル(約20〜30μL)を一滴置き、銅メッシュのナンバー側をsEVの液滴に置き、3分間吸収させます。
2. 余分な液体をろ紙で吸収し、銅グリッドを蒸留水滴の上に置き、2回洗います。
3. 余分な液体をろ紙で吸収します。次に、銅グリッドを0.5%酢酸ウラニル液滴の上に置いて、5秒間陰性染色します。
4. 手順 2.2 を繰り返します。
5. 用意した銅メッシュをサンプルロッドに置き、サンプルステージに挿入します。
   1. 倍率を20,000x〜25,000xに調整して、テストするサンプルを見つけます。次に、倍率を100,000倍に調整し、適切な位置とグレースケールを調整して透過型電子顕微鏡(TEM; 材料表)。画像取得時の加速電圧は80kVに設定されています。
      注:ステップ2.1では、sEVサンプルの濃度が低い場合(<50 μg/μL)、吸着時間を5分以上に延長できます。あるいは、ステップ1.10では、少量のPBS(50 μL)を再懸濁に使用できます。ステップ2.3では、負の染色時間は長すぎてはいけません。そうしないと、sEVの3次元(3D)構造を観察することは困難です。

3. ナノ粒子追跡分析によるsEVの粒度分布と濃度の測定

1. ステップ1.11で採取したsEVについては、ナノ粒子追跡分析(NTA)のために溶液を1 mLに希釈します。まず、視野に不純物がなくなるまで蒸留水で機器を洗浄します。次に、1 mLの滅菌シリンジを使用して、サンプルをゆっくりと押します(注入量:0.5〜1 mL)。
2. サポートソフトウェアを使用してサンプルを分析します( 材料表を参照)。具体的には、[カメラ の開始 ]をクリックし、 カメラレベル を適切なサイズ(通常は14〜16単位の強度)に調整してから、測定方法である 標準測定 (3回または5回)を選択し、[ 実行 ]をクリックして粒子を収集します。
3. 粒子を収集した後、コンピューターは移動するsEV粒子を観察できます。同時に、 検出しきい値 (通常は5)を設定して粒度分布を分析し、最終的にカウントされた粒子がすべてバックグラウンドではなく移動しているsEVになるようにします。粒子を分析した後、分析結果を保存してエクスポートします。
4. 使用後は、視野に明らかな粒子がなくなるまで蒸留水で機器を洗浄し、レーザーの電源を切ってください。
   注:TEM用のsEVサンプルとは異なり、NTA用のsEVサンプルは濃縮しすぎず、より多くのサンプル量(少なくとも1 mL)を必要とします。さらに、フローサイトメトリーやチューナブル抵抗パルスセンシング(TRPS)などの代替方法を使用して、sEVのサイズ分布を分析できます。NTA測定(ナノサイトLM10)に推奨されるパーティクル/フレーム数は40です。

4. ウェスタンブロットによるsEVのタンパク質マーカーの検出

注:細胞外小胞の研究のための最小情報(MISEV)2018ガイドライン^17,18によると、sEVの特性評価には5つのカテゴリーのタンパク質が推奨されています。sEV調製のための各カテゴリー1〜4の少なくとも1つのタンパク質マーカーを評価する。

1. ステップ1.9で回収したsEVについて、上清を注意深くピペッティングし、15 μLのHEPES溶解バッファーを5分間加えます。次に、等量のローディングバッファーを追加し、沸騰したお湯で15分間調理します。
2. このプロトコルでは、sEVのタンパク質の負荷は8〜10μgでした。10%ゲル中のタンパク質を80 V(約30分)の定電圧で電気泳動します。
   1. サンプルが分離ゲルに入ったら、電圧を120V(約45分)に調整します。サンプルがガラス板の底から2〜3 cm離れたら、電源を外し、エレクトロポレーションのためにサンプルストリップを切断します。電気泳動溶液の組成は、サブステップ4.2.1.1に記載されています。
      1. 5倍電気泳動溶液を調製するには、トリス、SDS、グリシンをそれぞれ15.1 g、5 g、94 gと秤量し、脱イオン水で1 Lに希釈します。使用するときは、水で5倍に希釈する必要があります。
3. エレクトロポレーション装置を組み立て、十分なエレクトロポレーション溶液(約1L)を入れ、ニトロセルロース(NC)膜上に90mAの定電流で氷上で3.5時間エレクトロポレーションします。
   注意: 10倍のエレクトロポレーション溶液を調製するには、それぞれ30.25 gと144.1 gのトリスとグリシンを量り、脱イオン水で1 Lに希釈します。使用する場合は、脱イオン水:メタノール:エレクトロポレーション溶液の7:2:1の比率で調製する必要があります。
4. エレクトロポレーション後、NCメンブレンをブロッキング溶液(50 mLのトリス緩衝生理食塩水に2.5 gの脱脂粉乳を0.1%Tween 20(TBST)で1〜2時間、RTで1〜2時間、または4°Cで一晩入れます。 TBSTの構成については、サブステップ4.4.1で説明します。
   1. 10x TBSTを調製するには、それぞれ60.56 gと175.32 gのトリスとNaClを量り、次に10 mLのTween-20と34 mLの濃塩酸を加えます。濃塩酸でpH = 7.6を調整し、イオン交換水で2 Lにメイクアップします。使用するときは、水で10倍に希釈する必要があります。
5. 3つのsEVマーカー(分化クラスター9 [CD9]、βアクチン、腫瘍感受性遺伝子 [TSG101])と1つの非sEVマーカー(グルコース調節タンパク質94 [GRP94])によってタンパク質マーカーを同定します。
   1. 上記の抗体2 μLをピペットで入れ、1:500で希釈した後、NCメンブレンをRTで3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 希釈液は、ステップ4.4のブロッキング溶液です。
   2. 一次抗体とのインキュベーション後、シェーカー上で1x TBSTで毎回10分間3回洗浄します。
6. NCメンブレンを希釈した二次抗体(1:500)に入れ、RTのシェーカーで45〜50分間ゆっくりと振とうします。シェーカーで1x TBSTで毎回10分間3回洗います。
7. 化学発光基質AとB(材料表参照)を1:1で混合し、混合試薬をNCメンブレンに加え、RTで5分間インキュベートします。
8. ブロットイメージャーを使用したNCメンブレンイメージング( 材料表参照)
   1. Image Lab ソフトウェアを開き、[新しい実験プロトコル] を選択します。
   2. ブロッティング比色法アプリケーションを選択し、ハイライトをキャンセルし、実験プロトコルの実行をクリックしてマーカーを取得し、保存します。
   3. 次に、アプリケーションプログラム Blotting-chemiを再選択し、 画像の総数 と 露光時間を それぞれ30秒と300秒に設定します。
   4. [ 実験プロトコルの実行] をクリックし、イメージを取得して保存します。最後に、NCメンブレンを取り外し、コンピューターの電源を切ります。
      注:ステップ4.6の場合、二次抗体のインキュベーション時間は50分を超えてはなりません。そうしないと、背景が暗すぎます。

5. sEVのペプチドの抽出

1. sEVを110,000 × g 、4°C、70分間超遠心して2回洗浄し、500 μLのPBS( 材料表を参照)を加えて再懸濁し、5 μLの100倍プロテアーゼ阻害剤( 材料表を参照)を追加します。
2. 超音波破砕のためにサンプルを置きます( 材料の表を参照)。超音波均質化の設定は次のとおりです:電力:40 W、合計時間:10分、超音波時間:3秒、およびインターバル時間:5秒。
3. 粉砕した混合物を13,700 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
4. 遠心分離後、ジチオスレイトール(DTT; 材料表)上清を最終濃度50 mmol / Lにし、56°Cの水浴中で30分間インキュベートします。
5. 続いて、50μLのヨードアセトアミド(IAA; 材料表)上清に1 mol/Lの濃度で加え、暗所で20分間RTで反応させます。
6. 混合物を13,700 × g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収し、粗ペプチド抽出物とする。後で使用するために-20°Cで保管してください。
7. 得られたペプチド粗抽出物を10 kDa限外ろ過管¹⁹( 材料表参照)でウルトラフィルターしてタンパク質を除去し、13,700 × g で4°Cで1時間遠心分離した。流出液を収集し、45°Cの真空遠心濃縮機( 材料表を参照)で乾燥させます。
8. 手順5.8.1〜5.8.8に従って、乾燥したサンプルを脱塩します。試薬の溶媒として質量分析グレードの純水を使用してください。
   1. 各サンプルに100 μLの0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、乾燥したペプチドを完全に溶解します。
   2. 各脱塩カラムに100 μLの100%アセトニトリル(ACN)を加え、400 × g でRTで3分間遠心分離し、廃液を廃棄します。次に、100 μLの50%ACNを添加し、400 × g で3分間遠心分離し、廃液を廃棄します。
   3. 各脱塩カラムに100 μLの0.1%TFAを添加し、400 × g で3分間遠心分離し、廃液を廃棄します。
   4. 手順 5.8.3 を繰り返します。
   5. ステップ5.8.1で溶解したペプチドを脱塩カラムにピペットで入れ、400 × g で3分間遠心分離し、廃液を回収します。サンプルローディングステップを繰り返して、ペプチドサンプルを脱塩カラムに吸着させます。
   6. 手順 5.8.3 を 2 回繰り返します。
   7. 50 μLの50%ACN(0.1%TFAを含む)を脱塩カラムに加え、400 × g で3分間遠心分離し、流出液(ペプチド)を新しい質量分析グレードの遠沈管に回収します。

6.脱塩ペプチドの乾燥

1. 脱塩したペプチドを真空遠心濃縮装置(設定: V-AQ モード、温度:45°C、時間:50分)で乾燥させ、その後の質量分析分析に使用します。
   注:sEVのペプチドの抽出プロセスは、タンパク質の分解を避けるために、可能な限り氷上で実行する必要があります。使用したすべての試薬は、プラスチック汚染を避けるために質量分析グレードの水で調製されました。ステップ5.8では、脱塩によりペプチドサンプルが必然的に失われます。この損失は、手順5.8.5と5.8.7を繰り返すことで減らすことができます。

7. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析

注:液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)、特にEASY-nLC 1000ナノ高性能LCシステムに接続されたOrbitrap QエクスアクティブHF-X質量分析計( 材料表を参照)でペプチドのサンプルを分析します。

1. C18分析カラム(粒径1.9 μm、長さ15 cm x 内径150 μm)で、65分のグラジエントで60 nL/minの流速でサンプルを分離します:4分間4%-15%、28分間15%-28%、10分間28%-40%、10分間40%-69%、7分間95%一定、 95%は1分間6%に減少し、5分間一定でした(溶媒A、0.1%ギ酸[FA]を含む水、溶媒B、0.1%FAを含む80%アセトニトリル、v / v)。
2. ナノエレクトロスプレーイオン化(nano-ESI)噴霧器で、毛細管温度320°C、スプレー電圧2.2kVで溶出したペプチドをイオン化します。
3. フルスキャンモードで120,000、MS /MS モードで15,000の分解能を持つデータ依存アクイジションモードを使用してマススペクトルデータを収集します。
   1. Orbitrap では、スキャン範囲 250 m/z から 1800 m/z までのフルスキャンと 1.6 m/z のアイソレーションウィンドウを実行します。
   2. 正規化された衝突エネルギーが29%の高エネルギー衝突解離(HCD)フラグメンテーションの上位20個の強度イオンを選択し、イオン分離器で測定します。
      注:典型的な質量分析条件は次のとおりです:自動ゲイン制御(AGC)ターゲットは、フルスキャンの場合は3 x 10⁶ イオン、MS / MSスキャンの場合は2 x 10⁵ イオンでした。最大注入時間は、フルスキャンで80ミリ秒、MS / MSスキャンで19ミリ秒でした。動的除外は13秒間使用されました。

Results

示差超遠心法で単離したsEVについて(図1)、国際細胞外小胞学会(ISEV)¹⁷に従って形態、粒度分布、タンパク質マーカーを評価しました。

まず、sEVの形態をTEMで観察したところ、典型的なカップ状の構造が示されました(図2A)。NTAは、単離されたsEVが主に136 nmに集中していることを示し(図2B)、これは報告されたサイズ(30-150 nm)^{と一致していました1}。最後に、sEVのタンパク質マーカーをウェスタンブロットで同定しました。その結果、単離されたsEVは、CD9、βアクチン、TSG101などのsEVのマーカーが有意に濃縮されていることが示されました。小胞体マーカーGRP94は、細胞ライセート全体でのみ検出されました(図2C)。これらの...

Discussion

sEVの機能を調べる際には、潜在的な汚染を避けるために、複雑な生物学的サンプルから高純度のsEVを得ることが不可欠です。sEVの分離にはさまざまな方法が開発されており¹³、これらの方法の中で、示差超遠心ベースの方法は比較的高い純度のsEVを示しています。本研究では、200 mLの細胞上清を6時間回収し、示差超遠心により約200〜300 μgのsEVが得られた。ただし、超遠心分離中はsEVペレットが見えない場合があることに注意してください(ステップ1.8)。したがって、チューブの底をできるだけピペットで固定することをお勧めします。このステップは重要であり、sEVの歩留まりに直接影響します。さらに、sEVが110,000 × g で沈殿した場合の遠心分離時間や細胞上清収集期間の延長など、収量を向上させるためにはプロトコルのさらなる最適化が必要です(ステップ1.8および1.9)。示差超遠心で単離されたsEVは純度が高いですが、時間がかかります。

現代の質量分析技術と遺伝子データベースの進歩により、さまざまな生物の組織や体液...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCAタンパク質アッセイキット	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
遠心フィルターチューブ	ミリポア	UFC5010BK
遠心分離機ボトル ポリプロピレン	ベックマン・コールター	357003	高速遠心分離機
化学発光基質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	34580
ジチオスレイトール	Solarbio	D8220	100 g
DMEM 培養液	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)ヨー
ドアセトアミド	Sigma	l1149	5 g
マイクロチューブ ポリプロピレン	ベックマン コールター	357448	1.5 mL 卓上型超遠心分離機
ナノ高性能LCシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EASY-nLC 1000
ナノ粒子トラッキング分析	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X 質量分析計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N/A
リン酸緩衝生理食塩水	Solarbio	P1020
ポリアロマー遠心チューブ	ベックマン・コールター	326823	超遠心分離
機 プロテアーゼ阻害剤	Bimake	B14002
SpeedVac 真空濃縮器	エッペンドルフ	濃縮器と
卓上型超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ MAX-XP	超遠心ローター (TLA 55)
透過型電子顕微鏡	日立	H-7650B
TSG101	シグマ	AF8258
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ XPN-100	超遠心分離機ローター(SW32 Ti)
超音波細胞攪乱器	Scientz	SCIENTZ-IID
ウェスタンブロットイメージ	ャーBio-Rad	ChemiDocXRs	イメージラボ4.0(ベータ7)
β-アクチン	シグマ	A3853