背根神経節痛の圧迫を伴うラットモデルに対する推拿の鎮痛効果

サマリー

本稿では、推拿療法を用いたラットの後根神経節の慢性圧迫を治療するためのマニピュレーションと、疼痛挙動と病理組織学的結果に基づいてその有効性を評価する方法を紹介します。

要約

神経因性疼痛は、人口の6.9%〜10%が罹患し、腰椎椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症、椎間孔狭窄症などのさまざまな病因による神経損傷に起因する一般的な状態です。中国の伝統的な手技療法である推拿は、神経因性疼痛の治療のための臨床診療で鎮痛効果を示していますが、その根底にある神経生物学的メカニズムは不明のままです。動物モデルは、推拿の基本原理を解明するために不可欠です。この研究では、後根神経節(DRG)を圧迫したラットの標準化された推拗プロトコルを提案し、ステンレス鋼の棒を椎間孔に挿入してDRG圧迫を誘導し、制御された環境で場所、強度、頻度の特定のパラメーターで推拿操作を実行し、 推拿治療の行動および組織病理学的結果を評価します。この記事では、この研究の潜在的な臨床的意味と限界についても議論し、推拿に関する将来の研究の方向性を提案します。

概要

臨床現場では、様々な原因による神経根圧迫による神経病理学的疼痛を観察することが一般的です。この神経障害性疼痛の最も典型的な形態は腰椎椎間板ヘルニア(LDH)であり、これはしばしば持続し、再発し、治癒が困難です。世界人口の約9%がLDHに罹患しており、大きな社会的・経済的負担をもたらしています¹。このタイプの神経障害性疼痛の発生率は年々増加しており、人間の生産とライフスタイルの変化により、患者は若年化する傾向にあります²。非ステロイド性鎮痛剤を使用しても、患者の症状を完全に緩和することはできません。その結果、LDHによる疼痛を治療するための推拿などの代替療法がますます注目されています。

LDHの保存的治療の一種である推拿療法は、腰痛の予防と治療のために世界中のさまざまな臨床診療ガイドラインで広く推奨されています^3,4。研究によると、推拿はLDH患者の血清IL-6や腫瘍壊死因子α(TNF-α)などの炎症因子を有意に低下させ、患者の痛みや腰機能障害を改善することができます⁵。しかし、推拿療法の鎮痛効果の背後にある具体的なメカニズムは不明のままです。

動物モデルは、LDH⁶によって引き起こされる神経障害性疼痛を研究するための貴重なツールです。これらは、推拿療法の有効性を評価するための行動測定を可能にし、LDHの病理学的生理学のサンプルを提供します。例えば、大腿部の背根神経節からサンプルを採取して、後根神経節細胞の変化を確認することができます。後根神経節(CCD)モデルの慢性圧迫は、椎間板ヘルニアによる神経圧迫の臨床症例で見られる病理学的変化と一致する後根神経節細胞の形態に損傷を与えるため、LDHの病理学的生理機能を評価するために一般的に使用されています⁷。

多くの学者が指圧鎮痛についていくつかの動物実験を行っています^8,9,10。しかし、動物モデルに指圧手術を行う場合、人間の指圧を模倣することがよくあります。指圧の治療効果は、加えられる力の大きさ、頻度、方向などの要因によって影響を受ける^11、12、13。実験に、手術の力、頻度、持続時間など、統一された指圧基準がない場合、実験結果に多少の偏差が生じる可能性があります。本稿では、CCDラットの特徴を踏まえた指圧治療計画群を紹介し、動物モデルにおける標準化された指圧手術の開発を促進する。

プロトコル

この研究は、復旦大学神経生物学研究所の疼痛研究室で実施されました。実験は承認され、すべての外科的処置と動物の取り扱いについて、国際疼痛学会(LASP)によって確立された実験動物保護のためのガイドラインに厳密に準拠しました。本研究では、40〜50日齢の32匹の雄で構成され、平均体重220〜1.38 gのクリーングレード±Sprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。これらのラットは、中国科学院上海生命科学院実験動物センターから入手しました。動物は適切に世話され、独立した換気、調節温度(22±1°C)、湿度(40%〜50%)を備えた専用の部屋に収容されました。ネズミはケージの中で十分な餌と水を得ることができました。実験動物室は、ラットの概日リズムの規則性を維持するために12時間の明暗サイクルに従い、指定された担当者が定期的にパッドを交換しました。X線検査は、上海中医薬大学附属岳陽中医薬統合病院放射線科で行われました。

1. 研究参加者とグループ分け

1. 32匹のラットを、ナイーブ(対照)、偽(偽手術)、CCD(慢性後根神経節圧迫)、CCD+推拿(8ラット/群)の4つのグループに割り当てます。ネズミは動物施設で餌と水を自由に入手できました。
   注:ナイーブラットには介入がなかったが、偽グループはCCDグループのラットと同じ外科的処置を受けたが、L4およびL5椎間孔に「L」字型のステンレス鋼棒を残さなかった。CCD群のラットは、完全な慢性後根神経節圧迫モデル手術を受けた。CCD+推拿群のラットは、CCD手術後4日目から推拿療法を受けた。

2. 動物モデルの構築

1. イソフルオランを投与してラットに麻酔をかけます。ラットが意識を失ったら(尾振り反射や脚屈曲反射がない)、カミソリを使用して手術部位の毛を剃ります。
   注:鎮痛薬は手術の15分前に適用され、ラットはトラマドール20 mg / kgを皮下注射されました。.
2. ネズミを発泡スチロールボード( 材料表を参照)に固定し、輪ゴムを使用して手足と切歯を固定します。準備した領域を、アルコールとヨウ素の交互の滅菌調製で最低3サイクル拭きます。
3. 「L」字型のプローブを挿入します( 材料表を参照)。
   1. はさみを使用して、皮膚、表在性筋膜、深部筋膜を2〜3cmずつ切開します。まず、第5腰椎に対応する上前腸骨棘を見つけます。次に、3番目と4番目の有棘突起を順番に見つけます。
   2. 歯付き鉗子で棘突起をクランプし、持ち上げてハサミを棘突起の右側に近づけ、棘突起の右側に付着している筋肉を切断します。
   3. 次に、椎体プレートの外面に付着した筋肉を、右側に抵抗があるまで鈍く解剖します。突起は頬骨接合部です。同様に、頬骨関節の筋肉と筋膜を鈍く解剖します。
      注:ラットの頭の方向を指す横突起は、頬骨接合部の下部外側前面で最初に触れられます。横突起の下には椎間孔があり、神経根と周囲の軟部組織で満たされており、通常は見つけるのは容易ではありません。
   4. まず、「L」字型のプローブを使用して椎間孔の位置を決定し、次に「L」字型のステンレス鋼棒(直径0.4mm、長さ4mmで作成する必要があります)を使用して椎間孔に挿入します。
   5. 後根神経節の圧迫に成功すると、ラットは尾をはじき、脚の屈曲反射を示します。ステンレス鋼棒を第4および第5腰椎椎間孔に挿入します。次に、筋肉、筋膜、皮膚を層ごとに縫合(3-0、 材料表を参照)します。
4. ネズミが目を覚ますまでサーモスタットボックスに入れます。起床後、ラットの右後肢の機能が正常かどうかを観察します。引きずっている場合は、操作が運動神経を損傷したことを意味し、ラットは廃棄する必要があります。右後肢の機能が正常であれば、ラットを使用してケージに入れて給餌することができます。

3.推拿療法

1. 快適な環境を確立する:推拿療法を開始する前に、ラットを拘束具に30分間順応させて適応させます(図1)。この装置は、ラットの大腿部を完全に露出させて固定することができ、推拿操作を容易にします( 材料表を参照)。
   注意: 治療室の温度は22〜26°Cに維持する必要があり、湿度は40%〜50%である必要があります。
2. 推拿の標準化:セラピストが推拿の圧力と頻度を監視し、リアルタイムのフィードバックデータを提供できるワイヤレスフィンガースリーブを着用するようにします。まず、指の袖のフィードバックデータを使って、力を5Nに、周波数を2Hzに調整して、推拿を練習します。次に、ラットに対して同じ操作を行い、手順全体を通して一貫した力と頻度を維持します(図2)。
   注:以前の研究に基づいて、計算された最適なプレス力は5 Nです(詳細については、「説明」セクションを参照)。
3. 経穴を特定する:右後肢の腓腹筋をラットの推拿領域として選択し、腓腹筋の2つの頭の接合部で、BL57¹⁴の位置におよそ位置します。
4. 推拿を行う:セラピストがラットの太ももの後方を向き、ラットの右後肢を右上肢で保持するようにします。親指をBL57のツボに垂直に置き、前腕と指に力が加わり、5Nの圧力をかけながらリズミカルな小レンジの回転運動を行うようにします(図3)。
5. 治療中は、操作フィードバックの力と周波数がプリセット値に対応していることを確認してください。術後4日目から介入を開始し、推拿を1日1回15分間、18日間継続して行います。

4.疼痛の行動検査

注:行動テストは、モデリング前、モデリング後、介入1日目、介入3日目、介入7日目、介入14日目、介入17日目、および介入21日目に実施されました。

1. 以下の手順に従って、機械的刺激反応閾値(足の引き出し閾値、PWT)を実行します(図4)。
   1. von Frey法を使用して、ラットの足の機械的刺激の応答閾値を検定します。20cm×10cm×20cmの透明な強化ガラスコンパートメントにラットを入れ、高さ40cmで10mm×10mmの開口部を持つ金属製のワイヤーグリッドスタンドに置いた。室温は23±2°Cに保ち、周囲の環境は静かにしてください。
   2. 電子フォン・フレイ繊維で機械的離脱閾値を測定します( 材料表を参照)。ネズミの足の中心を、足を上げたり避けたりするなど、ネズミが目立つ動きになるまで刺激します。機械は最大圧力値(N)を自動的に記録します。
   3. 15秒以上待ってから、同じラットを再度刺激します。ラットの足の触感作を防ぐために、各刺激を5秒未満に保ちます。3つの連続した測定値の差が10 N未満になるまで、テストを5回繰り返します。
2. 熱刺激に応答してPaw Withdrawal Latency(PWL)を実行します(図5)。
   1. ハーグリーブス法^15,16を使用してPWLを評価します。20 cm x 10 cm x 20 cmの透明な強化ガラス製の小さなチャンバーにラットを置き、通気孔のある透明なガラス蓋を付けます。ガラス蓋の中央部を加熱プレートを使用して、安定した温度に達するまで45°Cに加熱します。
   2. 行動テスト段階では、環境要因がテスト結果に与える影響を最小限に抑えるために、ラットを毎日少なくとも2時間行動ラボに順応させます。
   3. 正式なテストの前に、ラットを行動ラボに30分間置いて、環境に適応し、干渉を減らすようにします。
   4. 加熱プレートを45°Cに加熱し、ラットの後肢を加熱プレートの上に置きます。
   5. 足の引き抜き潜時(PWL)は、加熱の開始から熱刺激に応答して足の引き抜き反射が現れるまでの時間として定義されました。各テストでは、同じ後肢を3回連続してテストし、その平均値を使用して、その後肢の応答潜伏時間を求めます。試験後、ラットをケージに戻し、給餌します。

5.灌流

1. 準備:事前に0.9%生理食塩水と4%パラホルムアルデヒド溶液を準備します。生理食塩水を37°Cの一定温度に設定されたオーブンに入れ、パラホルムアルデヒド溶液を後で使用するために4°Cの冷蔵庫に保管します。
2. 麻酔を行い、アクセスを確立します。
   1. まず、25%ウレタン(0.6 mL/100 g、 材料表参照)をラットの腹腔に注入し、深部麻酔を誘発します。つま先、角膜、または回転反射が観察されなくなるまで待ちます。.ネズミを発泡スチロールのボードに固定します。
   2. 胸骨をハサミで切り、皮膚と筋膜を層ごとに開きます。横隔膜をカットし、両側の肋骨を切り取り、心臓を完全に露出させます。心膜を慎重に分離します。肺を心臓から分離します。
   3. 鉗子を使用して、心臓を自分の方に引き寄せることで大動脈を引っ張り、露出させます。針、左心室、大動脈を直線的に同じ水平面上に合わせます。次に、針が大動脈の内側に見えるまで、左心室から大動脈に針を挿入します。
   4. 鉗子を使って大動脈と針を大動脈の内側に固定し、左心房をハサミで切り開きます。このとき、左心房から大量の血液が噴出します。生理食塩水のバルブを開き、生理食塩水注入を37°Cの生理食塩水に灌流し、合計約150〜200mLに接続します。
3. 生理食塩水灌流が完了したら、4%パラホルムアルデヒド溶液に切り替え、4%パラホルムアルデヒド溶液で4°Cで合計約400mLの灌流を行います。 パラホルムアルデヒド灌流を開始するときは、ラットの前歯を1対の鉗子で保持して前方に引っ張り、片手で尾を持って後方に引っ張ると、脊椎を完全に伸ばし、椎間孔を増やしてDRGサンプリングを容易にするのに有利です。
4. 灌流中、ラットの肝臓、腸間膜、および大網は、肝臓が硬くなるまで徐々に青白くなります。次に、流量を遅くし、すべてのパラホルムアルデヒドが灌流されるまで、毎秒約2滴に調整します。

6.背根神経節採取

注:灌流後、ラット脊椎の腰椎部分をすばやく切断します。この位置決め法を使用して、両側の腸骨稜の最高点をL5腰椎棘突起に接続することにより、L5およびL4椎間孔の位置を特定し、椎間孔から後根神経節を除去します。具体的な収集方法は次のとおりです。

1. 脊柱管(胸部脊柱管)の入り口から、ハサミを脊柱管に挿入し、すべての椎弓が完全に除去され、脊柱管全体が露出するまで、両側の椎弓を切り取ります。
   注意: 椎弓を切断するときは、脊柱管の外側にある脊髄や神経根を傷つけないように注意してください。
2. 脊髄と後縦靭帯を慎重に除去します。椎間孔の内穴に付着した硬膜を分離します。
3. 眼科用鉗子を使用して、真珠のような形をしていてわずかに黄色がかった後根神経節をクランプして引き抜きます。
   注:神経組織の脆弱性と靭性が低いため、後根神経節を引き抜くときは力強さと引っ張り方向を把握し、力ずくで引き抜く必要はありません。
4. 後根神経節を抜くときは、後根神経節をスムーズに引っ張るために、硬膜やくも膜などの周囲の軟部組織を事前にきれいにしてください。
5. 後根神経節を吸収紙の上に置き、刃で軸索を切り落とし、後根神経節の表面の血管をきれいにします。
6. トリミング後、後根神経節の重量を量り、濃度4%、温度4°Cの4%パラホルムアルデヒド溶液に十分な時間(通常は約2〜4時間)浸し、次に後根神経節を事前に調製した10%、20%、および30%PBスクロース溶液(4°C)に移し、段階的に脱水します。

7. 凍結切片

1. まず、後根神経節を0.01 M PBS溶液に入れます。それらを10分間振ってから、ショ糖溶液を洗い流します。後根神経節の両方のセグメントの軸索線維を慎重にトリミングします。凍結切片装置の凍結ヘッドを洗浄し、最適な切断温度(OCT)コンパウンドを添加します( 材料表を参照)。
2. 液体窒素を含む金属シェルの表面に凍結ヘッドを置き、組織が凍結するまで待ってから取り外し、平らにトリミングします。その後、スライサーの底に凍結ヘッドを置きます。後根神経節スライスの厚さは15 mmでなければなりません。スライスした薄片を木箱に順番に並べ、-20°Cの冷蔵庫で直射日光を避けて保管してください。

8. ヘマトキシリンとエオシンの染色

1. 切片をキシレンに2分間入れ、100%、95%、80%、70%などの一連のアルコールでそれぞれ2分間脱水します。次に、切片を蒸留水に2分間、ヘマトキシリンに1分間置き、水道水を5分間すすぎ、1%生理食塩水溶液で30秒間分化を行い、続いて飽和炭酸リチウムで30秒間分化します。
2. 次に、スライスを蒸留水と水道水にそれぞれ2分間、エオシン溶液(0.5%)に5分間、蒸留水で1分間すばやくすすぎ、95%と100%アルコールでそれぞれ2分間を2回、重炭酸ナトリウムを添加した100%キシレンで30秒間、キシレンでそれぞれ3分間を3回、最後に、 中性バルサムで密封します( 材料表を参照)。

結果

推拿療法は、CCDモデリングによって引き起こされるラットの機械的および熱的刺激の閾値を下げるのに役立ちます
17日間の推拗療法後、歩痂塞療法を受けたCCDラットと未治療のCCD群の間でPWT閾値に有意差が観察された(P = 0.021、<0.05)(図6 および 表1)。

CCD群のラットは、治療開始時から疼痛閾値の改善を示し、モデリング後の14日目からCCD群と推拿療法群との間で熱痛閾値に有意差が認められました(P = 0.0047、0.0056、0.0049、<0.01)(図7 および 表2)。

推拿療法の適用は、CCDモデルによって引き起こされる細胞壊死を改善しませんでした
後根神経節のHE染色に基づき、L字型...

ディスカッション

私たちの研究グループは、初期段階の推拿操作のパラメータに関する関連研究を行ってきました。まず、推拿操作の力の強さを設定することが重要です。臨床推拿では、施術者は自分の経験や患者の主観的な感情に応じて力の強さを調整し、コミュニケーションを通じて最高の推拿効果を実現します。しかし、動物実験では実現不可能です。動物実験では、推拿操作の強度を定義するために「応答閾値」が使用されます。これらは、動物の本能的な反応に基づいて、加えられた推拿力が適切かどうかを判断します。Randall¹⁷ は、この方法を用いて、ラットの炎症モデルにおける疼痛挙動を研究しました。違いは、ランドールが局所的な炎症領域で操作したのに対し、この実験は損傷のない領域で操作したことです。トゥイナを激しく操作すると、ネズミは叫び声をあげ、反射神経から逃れることができます。この重力強度の設定は、形式的推拿力強度がこの重力強度よりも小さいことを決定します。150匹のラットの5-25N間の最大悲鳴および逃避反射の押圧値の分布に基づいて、平均と標準偏差が9.93と3.018(図11...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
「L」ステンレス鋼棒(長さ4mm、直径0.4mm)	手作り	/	CCDモデル用
ALMEMO広告測定装置	ahlborn	2450-1	機械的回収閾値試験
恒温スライサー CM-1900	ライカ	1491950C1US	試料製造用
消毒剤(ヨウ素) 100mL/ボトル	LIRCON/山東リルカン	/	消毒用
使い捨て滅菌シリンジ 5mL	上海ミーシャワ医療工業	/	注射用
電子顕微鏡 CX-31	オリンパス、日本	BJ002318	標本観察用
指圧録音	蘇州長賢 光電子技術	CX1003w	トゥイナ操作用
フォームボード (35 cm x 20 cm)	手作り	/	ネズミを固定するための自家製装置
です MERSILK W2512	Johnson &ジョンソン	/	組織縫合用
中性バルサム	シノファーム 化学試薬	10004160	試料製造
用 パラホルムアルデヒド	中国国家化学試薬	/	試料製造用
ペントバルビタールナトリウム	シグマ・アルドリッチ	P3761	ラットの麻酔用
マウスおよびラットの足底試験装置(ハーグリーブス法)	IITC 生命科学	/	足の引き出し潜伏遅延実験
用精密電子スケールJY3002	精密科学機器	/	ラットの体重測定
バリカン	フィリップ	HP6341/00	ラットの毛皮のシェ
ービングラット同	済大学(自作)	/	同済大学製の自家製装置で、ネズミを効果的に固定し、後肢を完全に露出させることができます。
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	試料作製用
浦壇中国	国家化学試薬	/	の麻酔用
XR-600	東莞Kaso Electronic Technology	/	CCDモデル
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	試料作製用