方法論記事

LC-TIMS-TOF MS/MS を用いたフェンタニルアナログスクリーニング

DOI：

10.3791/65562

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2024年11月8日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フェンタニル類似体の保持時間、移動度、および質量分析のフラグメンテーションパターンに基づいてフェンタニル類似体をスクリーニングする方法。

要約

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ここ数十年にわたるフェンタニルの使用とフェンタニル類似体の出現は、コミュニティ全体にとってますます懸念されています。フェンタニルとその類似体は、米国における致命的および非致命的な過剰摂取の主な原因です。フェンタニル関連の過剰摂取の最近の事例は、違法に製造されたフェンタニルとそれに関連する極端な効力に関連しています。本研究では、フェンタニル類似体のスクリーニングのためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。補完型液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析法、およびタンデム質量分析法を使用すると、1回のスキャンで1つのサンプルから数百のフェンタニル類似体を分離し、割り当てることができます。説明されたアプローチは、モビリティトラップでの並列蓄積とそれに続く衝突誘起解離を使用した逐次フラグメンテーションを使用したデータ依存取得およびデータ非依存取得の最近の開発を利用しています。フェンタニル類似体は、保持時間、移動度、および MS フラグメンテーションパターンに基づいて、自信を持って割り当てられます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フェンタニルとその類似体は、米国における致命的および非致死的な過剰摂取の主な原因です1,2。米国疾病管理予防センター(CDC)は、2013年から2021年までの合成オピオイド関連の過剰摂取による死亡者数が258,000人を超えたと報告しました。2021年だけでも、68,000人以上の過剰摂取による死亡が合成オピオイドに起因する可能性があり、これは全米の過剰摂取関連死亡の82%を占めています3。2013年以降、数百種類のフェンタニル類似体が同定されており、その効力はさまざまです4。違法に製造されたフェンタニル類似体の出現により、スケジュールII合成オピオイド自体は、米国で入手可能な最も人気のある合成オピオイドであり続けています3。法医学研究教育センター(CFSRE)によると、2022年に報告されたフェンタニル類似体のトップはフルオロフェンタニルであり、現在、フェンタニルに関連しない合成オピオイドが急速に揮発性薬物市場に導入されています5。

麻薬市場ではフェンタニルおよびフェンタニル関連の類似体が圧倒的に大量に流通しているため、麻薬取締局(DEA)は、これらの化合物の合成に使用された方法論を追跡し、薬物の押収をその起源に結びつけることを期待して、オペレーション・デス・ドラゴン(Operation Death Dragon)と題したフェンタニル署名プロファイリングプログラムを実施しました6。2018年には、薬物押収の94%がヤンセン法で合成されたと特定され、残りの6%はジークフリート法で合成されました6。2つの方法の主な違いは、ヤンセン法では不純物として検出されるフェンタニル類似体であるベンジルフェンタニルが存在するのに対し、フェンタニルの代謝物/前駆体であるデスプロピオニルフェンタニル(4-ANPP)の存在は、ジークフリート法7で合成するときに検出される不純物です。

合成オピオイドの標的スクリーニングと定量のために、ガスクロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーを質量分析(それぞれGC-MSおよびLC-MS)と組み合わせて使用することは、毒物学研究室で定期的に実施されています。GC-MSは、生体試料中の乱用薬物検出のゴールドスタンダードとされています。一般に入手可能な質量スペクトルライブラリ8およびプラグアンドプレイシステム9として販売されている装置へのアクセスは、GC-MSが包括的なスクリーニングと標的定量9,10の両方においてラボで不可欠な部分であり続けている理由の一部です。しかし、文献に記載されている現在の GC-MS 定量法は、分析種の範囲が限られている傾向があり11、すぐに古くなり、現在のケースワークには適用できなくなっています。さらに重要なことは、検出と定量の限界が LC-MS 分析法(< 1 ng/mL)12 と比較できないため、偽陰性の結果が出る可能性が高くなることです。死後検体を調べた GC-MS と LC-MS の比較の 1 つでは、これまでに最も強力な合成オピオイドの 1 つであるカルフェンタニルの 134 例が陽性と同定され、そのうち 104 例が GC-MS を使用してカルフェンタニルのスクリーニングで陰性であったことが指摘されました13。薬物分析ラボでは、GC-MS はより頻繁に使用され、分析されたサンプルの濃度が高いため、合成オピオイドに対して修正可能です。それでも、GC-MSは、これらの化合物を確認するために、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)や走査型電子顕微鏡(SEM)などの追加の技術と組み合わせて利用されています14。法医毒物学における生体試料の分析にGC-MSを適用するには、液液抽出(LLE)または固相抽出(SPE)15のいずれかを使用してこれらの化合物を抽出することを含むサンプル調製方法が必要です。LLEはさまざまな溶媒で実施できますが、高生産性のラボでは、LLEは費用対効果が高くなく、タイムリーではない場合があります。LLEは大量の溶媒とサンプル量を消費しますが、代替のSPEは自動化でき、最小限のサンプル量で済みます16。最近のGC-MS研究では、3つの別々のGCサーマルプログラム17を使用して、20の異なる異性体フェンタニル類似体の分離が報告されています。異性体間のベースライン分離は成功しましたが、この分析法が関連する法医学的ケースワークやワークフローに適用できる可能性は限られています。

LC-MSは、特に不揮発性で熱に敏感な化合物18,19に関するGC-MSの制限により、法医学検査で人気を博しています。トリプル四重極(QQQ)とイオントラップ装置を用いたLC-MSスクリーニングは、低濃度(<1 ng/mL)での合成オピオイドの検出に成功しています12,20,21,22,23,24。通常、これらのLC-MS分析法は、イムノアッセイおよび/またはGC-MSの結果を補完するための二次確認法として使用されます。2017 年、マイアミ・デイド郡検死官部門(MDME)毒物学研究所の Shoff らは、超高圧液体クロマトグラフィー(UHPLC)-イオントラップMS n 13 を使用して、44 のオピオイド関連化合物の包括的なスクリーニング法を開発しました。ターゲットMRM法と同様に、このイオントラップ法では、保持時間、プリカーサーターゲットイオン、および可能な場合はMS3スペクトルフラグメンテーション用のプライマリードーターイオンを含むスケジュールされたプリカーサーリスト(SPL)を利用しました。このスクリーニング法がトリプル四重極イオントラップやリニア四重極イオントラップで開発された方法と異なるのは、スペクトルデータで得られる追加の詳細点です。このスクリーニング法では提供できないのは、イオントラップ装置ではめったに開発されない定量分析や、未知化合物の同定です13。合成オピオイドの LC-QQQ 分析法では、事前定義されたターゲットリストを同時にスクリーニングし、定量化できます。化合物の同定および定量のための多重反応モニタリング(MRM)トランジションの使用は、信頼できるデータ収集技術であり、合成オピオイドの検出に関する文献で利用されている最も一般的な技術である12,20。合成オピオイドのアレイの定量に関する報告された線形範囲は 0.01 〜 100 ng/mL で、カルフェンタニルなどのより強力な合成オピオイドは1 1,24,25,26,27 未満で検出されます。

異性体合成オピオイドの分離は、LC-MS 分析法で取り組まれています。そのような方法の1つは、ビフェニルカラムを使用して16分間の実行時間内に174の異性体フェンタニル類似体を分離した28。さらに、カラム効率、移動相のpH、圧力変化などのLC依存パラメーターの変動により、一貫したモニタリングとより大きな収集ウィンドウ(>0.4分)を備えたターゲットアッセイでは、保持時間のシフトを考慮する必要があります。これにより、一度分離したこれらの異性体がオーバーラップする可能性があります。異性体を分離するための追加のクロマトグラフィー技術が検討されており、これには2次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)の使用が含まれます29。また、この手法には化合物の直交的な分離を提供する能力がありますが、欠点は、過剰な分析時間、コスト、メソッド開発の難しさ、および代替の分離と比較した有用性などの利点を上回ります30。

高分解能質量分析(HRMS)は、合成オピオイドの同定においてますます信頼性が高まっています。いくつかの機器製造会社は、複雑な生物学的マトリックス中の広範囲の合成オピオイドを同定する目的で開発された標的分析法を販売している19,28,31。これらの方法は、前に説明した方法とは異なり、遡及分析のために分析データを保存できます。したがって、以前に分析され、結果が未確定であった標本は、新たに同定された化合物の発見のために後で再検討することができます。HRMS と QQQ の違いは、正確な質量同定です。どちらのMS技術も低濃度で正確に定量できますが、HRMSは未知化合物32,33,34の初期スクリーニングと発見により効果的であることが証明されています。HRMS、特に飛行時間型(TOF)MS分析装置は、NPS発見の最前線に立っており、法医学検査ラボが新しい化合物に関する時間的制約のあるデータを法執行機関と科学界の両方に提供し、これらの化合物の一部の拡散を拡大しながら、意識と教育を向上させることを可能にしています33。乱用薬物の検出にTOFを使用することは、10分間のクロマトグラフィープログラム内で分離された600以上の化合物を含む分析法により、非常に包括的になりました。以前の研究では、異性体オピオイドの検出と分離のためのTOFと組み合わせたトラップイオンモビリティー分光法(TIMS)の利点が報告されています35。

液体クロマトグラフィー、トラップドイオン移動度分析法、質量分析法の直交性を利用して、提示された分析法は、保持時間、同位体パターン、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいてフェンタニル類似体の広範な特性評価を提供します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. サンプル調製

  1. フェンタニルアナログスクリーニングキットを受け取ったら、-20°Cで保管してください。500 μL の純粋な LC/MS グレードのメタノールを添加して、各サンプルを最終濃度 400 μg/mL まで再懸濁します。
  2. プレートミキサーまたはボルテックスを使用して400rpmで1時間、または中速で15分間ボルテックスして混合します。再懸濁後、バイアルを-20°Cで保存してください。
  3. 純粋なLC/MSグレードのメタノールを使用して、各標準試料を最終濃度1 ng/mLに希釈します。
  4. 標準をグループにグループ化して、各グループに異性体標準が含まれないようにします。フェンタニル基準の14グループの内訳については、 補足表1 を参照してください。

2. HPLC移動相の調製

  1. 5 mM/L ギ酸アンモニウム(NH4HCO2)と H2O 中、0.05% ギ酸(85%)を使用して移動相 A(MPA)を調製します。
    1. 0.078 gのNH4HCO2を秤量し、250 mLのメスフラスコに注ぎ、約2/3rdまで水で満たします。よく混ぜるために渦巻きます。
    2. 完全に溶解したら、0.125 mLのギ酸(85%)を加えます。充填ライン(250mL)まで水を入れて混合します。
  2. 1:1 メタノールアセトニトリル混合物に 0.05% ギ酸を使用して移動相 B(MPB)を調製します。
    1. 125 mLのアセトニトリルをメスフラスコに注ぎ、充填ラインに達するまでメタノールを加えます。
    2. よく混ぜるために渦巻きます。0.125mLの0.05%ギ酸をフラスコに加え、混合して均質化します。

3. HPLC法開発

  1. LCソフトウェアをホーム画面に開きます。ウィンドウの中央にあるサンプル テーブルで、新しいプロトコルを作成します。
    1. バイアルカラムにサンプルの位置をアノテーションします。サンプル ID 列に YYYYMMDD_NAME (代表記述子) の形式で注釈を付けます。容量カラムに希望の注入量(15 μL)をアノテーションします。
  2. データ パス列に、データの保存先の場所を注釈します。
  3. HPLCメソッドインプット
    1. 画面の中央にあるサンプル テーブルのバーから [新規 ] を選択します。分離方法の下で、 ドロップダウン矢印 を選択し、ポップアップウィンドウで 新しい方法 をクリックします。
    2. 分離法とラベル付けされた新しいウィンドウがポップアップしますので、ここで取得時間または装置制御フレームワーク(ICF)システムメソッドを編集します。
    3. ICFシステムの 「Edit Method 」ボタンをダブルクリックして、ポップアップを開き、バイナリ・グラデーションを編集します( 図1を参照)。
    4. バイナリグラジエントタブでは、グラディエントの視覚的表現が左側にあり、グラジエントの内訳が右側にあり、タイムスタンプ、流量、MPAおよびMPB濃度を設定します。
    5. 停止時間が 18 分、流量が 0.400 mL/分、圧力制限が 0 psi と 6000 psi に設定されていることを確認します。
    6. タイムスタンプの濃度を次のように設定します。
      0.00分で、B濃度を20.0に設定します。
      1.50分で、B濃度を25.0に設定します。
      3.00分に、B濃度を27.0に設定します。
      6.00分に、B濃度を27.0に設定します。
      6.50分にB濃度を30.0に設定します。
      7.00分に、B濃度を95.0に設定します。
      16:00 分に B 濃度を 95.0 に設定します。
      16.50分にB濃度を20.0に設定します。

4. HPLCの初期化

  1. HPLCカラムセクションに、LCカラム(モノリシックC18 HPLCカラム100 mm x 4.6 mm)とカラムガード(ガードカラム5 mm x 4.6 mm)を挿入します。最小および最大カラム圧力に注意してください。
  2. サンプルブランク(同じバッファー溶液)を実行してリークがないかテストし、ベースラインを作成します。漏れを探します。漏れは、カラムの圧力変動によって観察される可能性があります。漏れがある場合は、漏れがどこから来ているのかを特定し、接続を締めます。
  3. 目的のLCプログラムを使用してサンプルブランク(同じバッファー溶液)を実行し、カラムを前処理します。

5. timsTOF MS/MSメソッド開発

  1. timsControl アプリケーションを開きます。ウィンドウの左側には、MS と TIMS の設定があります。
    1. MS設定で、スキャンの開始と終了をそれぞれ50 m/zと1800 m/zに設定します。イオン極性にはポジティブモードを選択し、スキャンモードにはパラレルアキュムレーションシリアルフラグメンテーションを選択します。
    2. [TIMS 設定] で [モード] を [カスタム] に設定し、[1/K0 開始] を 0.40 Vs/cm2 に、[1/K0 終了] を 1.85 Vs/cm2 に、[ランプ時間] を 150.0 ミリ秒に、MS 平均化を 1 に設定します。
  2. [ソース] の下のタブの選択で、2 つの設定ボックスで次の変更を行います。
    1. ソースで、エンドプレートオフセットを500 Vに、キャピラリーを4500 Vに、ネブライザーを3.0 barに、乾燥ガスを10.0 L / minに、乾燥温度を200°Cに設定します。
    2. シリンジポンプの設定で、シリンジがHamilton 1 mLで、アクティブが有効で、流量が80.0μL/hに設定されていることを確認します。
  3. 「Tune」タブで、「General」、「Processing」、「TIMS」の設定タブで以下の変更を行います。
    1. [General settings] タブで、転送、コリジョン セル、四重極、フォーカス プリ TOF、検出の各セクションを設定します。
      1. 転送設定で、偏向 1 デルタを 70.0 V、ファンネル 1 RF を 341.0 Vpp、CID エネルギーを 0.0 eV、ファンネル 2 RF を 300.0 Vpp、マルチポール RF を 300.0 Vpp に設定します。
      2. コリジョン セルの設定で、コリジョン エネルギーが 6.0 eV に設定され、コリジョン RF が 1200.0 Vpp に設定されていることを確認します。
      3. 四重極設定では、イオンエネルギーが 6.0 eV に、低質量が 250.00 m/z に設定されていることを確認します。
      4. フォーカスプリTOF設定で、転送時間を75.0μsに、プリパルスストレージを5.0μsに設定します。
    2. [解析設定]タブで、質量スペクトルピーク検出と移動度ピーク検出のセクションを設定します。
      1. マススペクトルのピーク設定で、強度の合計(面積)の選択を解除し、絶対しきい値を667に設定します。
    3. TIMSタブで、オフセット、イオン交換制御、および詳細パラメータのセクションを設定します。
      1. オフセット設定では、Δt1 を -20.0 V、Δt2 を -100.0 V、Δt3 を 40.0 V、Δt4 を 80.0 V、Δt5 を 0.0 V、Δt6 を 120.0 に設定し、コリジョン セルを 250.0 V に設定します。
      2. イオン電荷制御設定の下で、ボックスをクリックして有効にし、目標強度を5.00 Mに設定します。
      3. 詳細パラメータで、移動度範囲へのロック蓄積を有効にします。
  4. MS/MSタブで、スキャンモードをparallel accumulation-serial fragmentationに設定し、プリカーサーイオン、スケジューリング、アクティブエクスクルージョン、コリジョンエネルギー設定、分離幅設定、TIMSステッピングの各セクションを設定します。
    1. プリカーサーイオンの下で、並列蓄積シリアルフラグメンテーションランプの数を 8 に、最小電荷を 1 に、最大電荷を 5 に設定します。
    2. スケジュール設定で、前回繰り返しを有効にします。[アクティブ除外] で、チェックボックスをオンにして有効にし、リリースを 0.40 分後に設定します。
    3. 衝突エネルギー設定とアイソレーション幅の設定は調整しないでください。 TIMS ステッピング ボックス をクリックして有効にします。

6. 移動度と質量のキャリブレーション

  1. m/z ドメインと移動度ドメインの両方に対してキャリブレーションを実行します。m/z キャリブレーション設定で、ドロップダウンメニューに表示される参照リストボックスでプリロードされたチューニングミックスプロファイルの 1 つを選択します。
  2. キャリブレーションするには、TOFのシリンジにチューニングミックス溶液をロードします。ウィンドウの右側で、最高スコアを達成するために設定するさまざまなキャリブレーションタイプのキャリブレーションモードというタイトルの設定を使用します。
  3. スコアができるだけ 100% に近くなるようにします。線形、クワッド、拡張クワッドを切り替えて、最高のスコアを達成します。
  4. m / zのキャリブレーションに使用される手順6.1〜6.3に従って、モビリティのキャリブレーションを行います。
  5. キャリブレーションが完了したら、トップバーの [メソッド ]タブを選択してMSメソッドを保存します。ドロップダウンメニューで[ 名前を付けて保存 ]を選択し、新しいMSメソッドファイルを生成します。

7. データ独立集録(dia)の並列蓄積-シリアルフラグメンテーション法の作成

  1. データ依存型集録(dda)並列蓄積シリアルフラグメンテーションでデータセットが収集されたら、diaで実験を実行します。イオンモビリティーソフトウェアアプリケーションを開き、ステップ6.5で保存したddaメソッドをロードします。
  2. MS 設定については、すべての設定を同じままにして、これを parallel accumulation-serial fragmentation から dia- parallel accumulation-serial fragmentation に変更します。
  3. パネルの下部にある[ MSMS ]タブを選択し、[ Window Editor ]をクリックして、 図2に示す直径ウィンドウポップアップを開きます。
  4. ポップアップウィンドウの上部にある[解析を開く]ボタンを使用して、以前に保存したddaデータセット(.mファイル)をロードします。
  5. 左下にヒートマップが表示され、グラフを斜めに横切るウィンドウのポリゴンを持つウィンドウが表示されます。クリックしてドラッグし、ヒートマップのデータに収まるようにポリゴンのサイズを変更します(横線をダブルクリックするとコーナーが選択可能になり、ドラッグしてサイズを変更できるポイントが表示されます)。
  6. ウィンドウの右側にはウィンドウの設定があります。質量幅(50は移動先)を設定し、水平方向のオーバーラップを設定します(どちらもDaで)。
  7. 移動ウィンドウの数を質量幅と垂直方向のオーバーラップごとに設定します。
  8. ポップアップの右下にある [ウィンドウの計算 ]をクリックして、新しい設定で表示されるウィンドウを確認します。適切になったら、「 dia-PASEF Windows をメソッドに適用」をクリックします。これにより、ポップアップが閉じ、ホーム画面に戻ります。

8. HPLCイオンモビリティーTOFデータ処理

  1. データ分析ソフトウェアを開きます。左上隅にある[ ファイル ]タブをクリックし、ドロップダウンから [開く ]を選択します。新しいファイルウィンドウで、選択したファイルを選択し、[ 開く]をクリックします。
  2. キャリブレーションを確認してください。解析ボックスの下のファイル名を右クリックし、[ プロパティ]を選択します。ファイルname_analysisのプロパティというラベルの付いたウィンドウが表示されます。 [キャリブレーション ステータス] を選択します。
  3. ドロップダウンボックスから、 質量分析計の[Instrument Calibration]を選択します。誤差が1 μg/mL以下であることを確認してください。 Initial Mobility Calibration を選択し、誤差が1 μg/mL以下であることを確認します。
  4. データ解析ソフトウェアで、以下の通りクロマトグラムを調製します。
    1. ファイル名の下の [クロマトグラム ]を右クリックし、[ クロマトグラムの編集]を選択します。[タイプ]でドロップダウンボックスをクリックし、[ 抽出されたイオンクロマトグラム]を選択します。
    2. フィルターで 「すべてのMS 」を選択し、スキャンモードで「 すべて」を選択します。これは、目的の分子のフラグメントだけでなく、そのピークを表示するためです。
    3. この下で、分子選択のための2つのフィルターオプション(質量または青色で強調表示された式)を探します。
    4. 質量を使用してイオンを抽出する場合は、目的の分子の理論上のm/zを挿入します。この場合、(代表結果の質量) m/z を選択します。
    5. 式を使用してイオンを抽出する場合は、分子の式とクロマトグラムの目的のイオン型を挿入します。この場合、プロトン化イオン[M+H]+を選択します。
    6. 極性をポジティブモードに設定します。
  5. マススペクトル
    1. コンパウンドのピークのベースラインを右クリックし、ピークのもう一方のエッジまでドラッグします。これにより、その保持時間内にフラグメントの質量スペクトルが作成されます。
  6. モビログラムの生成
    1. mobilogramというタイトルの左側のタブを右クリックし、[ Edit Mobilogram]を選択します。edit mobilogram tracesというタイトルのウィンドウが表示されます。手順8.4.2〜8.4.7に従ってクロマトグラムを編集します。
    2. 保持時間入力に、対象のピークの保持時間範囲を追加します。
    3. パラメータを選択したら、Edit mobilogram tracesウィンドウの右上にある [Add ]をクリックし、続いて [Ok ]をクリックします。
    4. 短時間で、ソフトウェアは目的の選択を処理し、クロマトグラムを出力します。混合物中のすべてのイオンについて、手順8.6.1〜8.6.3を繰り返します。
    5. 化合物スペクトルの生成
      1. スペクトルビューウィンドウの下部で、[ Profile MS ]および [Fragment MS]を選択します。これにより、フルスキャンとPASEFからのイオンを含めることができます。
      2. スペクトル表示で、右クリックして「 Copy Compound Spectra」を選択します。右側に表示されるスペクトルデータを使用して、分解能、分解能、強度、信号対雑音比(S/N)など、化合物に関する詳細情報を見つけることができます。
    6. データ処理
      1. データを処理するには、クロマトグラムと移動度ピークを手動で波形解析して、目的の分子に関する重要な情報を取得します。
      2. [検索]を右クリックし、[クロマトグラムまたはモビログラムのみを統合]を選択します。左クリックしてドラッグし、目的のピークを強調表示します。保持時間、面積、S/N、移動性などの情報が表示されます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

250種類のアナログ標準物質からなるフェンタニルアナログスクリーニングキットは、m/z干渉を避けるために、17種類のアナログからなる12グループと16種類のアナログからなる2つのグループからなる14のグループに分けられました。各アナログは、m/z、保持時間(RT)、移動度(K)、およびMS/MSフラグメンテーションパターンによってさらに特徴付けられます。

C22H28N2O2 および C21H28N2OS 化学式について、異性体分離の例を図 3 および図 4 にそれぞれ示します。

フェンタニルアナログスクリーニングキットには、C22H28N2O2 化学式の4つの異性体が含まれています( 図3を参照)。 図 4 の検査は、[M+H]+ 抽出イオンクロマトグラム、モビログラム、同位体パターン、および MS/MS フラグメンテーションパターンを示しています。メトキシアセチルフェンタニルおよびフェンタニルカルバメートは、パラメトキシアセチルフェンタニルおよびB-ヒドロキシルフェンタニルからLCおよび移動度ドメインでよく分離します。しかし、パラメトキシアセチルフェンタニルとB-ヒドロキシルフェンタニルとの間の明確な分離は、それらの断片化パターンによって達成されます。

フェンタニルアナログスクリーニングキットには、C21H28N2OS化学式の3つの異性体が含まれています。 図 4 の検査は、[M+H]+ 抽出イオンクロマトグラム、モビログラム、同位体パターン、および MS/MS フラグメンテーションパターンを示しています。a-メチルチオフェンタニルと(±)-trans-3-メチルチオフェンタニルは、LCドメインでは分離しますが、移動度ドメインでは分離しません。さらに、(±)-trans-3-メチルチオフェンタニルと(±)-cis-3-メチルチオフェンタニルは、移動度ドメインで分離し、LCドメインでは分離しません。これは、LCと移動度分離の相補性を示しており、ドメインの直交性を通じて異性体の同定を改善します。 Figure 4D は、LCとモビリティによってもたらされたこの結果をまとめたものです。

figure-results-1
図1:ソフトウェアの勾配ランプ。 ICF システムメソッドのダイアロググラジエントは、B 濃度の割合に応じて分離中に適用されるタイムポイントです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:dia-PASEFウィンドウ設定。 dia-PASEF MSメソッドでは、MS/MSの設定は一意です。左のグラフは、dda-PASEF法で記録したデータから調整したウィンドウポリゴンを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:異性体オピオイドの典型的な抽出イオンクロマトグラム、抽出モビログラム、および増幅MSプロジェクション(A)メトキシアセチルフェンタニル、パラメトキシアセチルフェンタニル、β-ヒドロキシフェンタニル、フェンタニルカルバメートの構造、およびそれぞれの(B)典型的な保持時間、(C)典型的な移動度、(D)異性体シグナル、(E)主要なフラグメント、および(F)フラグメンテーションの表現。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:異性体オピオイドの典型的な抽出イオンクロマトグラムと抽出ビビログラム(A)α-メチルチオフェンタニル、(±)-トランス-3-メチルチオフェンタニル、および(±)-シス-3-メチルチオフェンタニルの構造。それぞれの異性体について、(B)典型的な保持時間、(C)典型的な移動度、(D)保持時間と移動度との間の直交性。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:混合群。 この表は、この手順のために作成された14の混合物のそれぞれにどのオピオイドが含まれているかを概説しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高異性体含有量を含む生体サンプルの分析分離は、分析的に困難な場合があります。この論文では、記載されている方法は、250のオピオイド標準キットから合計185の類似体に対して、29の異性体セットを特徴付けることを目的としています。試験群の準備では、実験的に区別できないm/zの類似体が2つ存在しないことを確認することが重要です。ここで説明するデータは、この方法をフィールド実験で使用する場合、人間ベースのマトリックスからではなく、標準を使用します。分析法の適用性を確保するためには、目的のマトリックスを使用した追加の試験が必要です。マトリックスは、マトリックスフリーの実験とは異なる方法で分析種をイオン化する可能性があるため、どのような一般的なイオン形態が観察されるかを決定することが不可欠です。分析では、同定は最も豊富な形態の同位体パターン([M+H]+1 および[M+Na]+1など)に基づいています。

LCプログラムの選択は、異性体が移動度ドメインで分離されていない場合に重要です。グラジエントの傾きを小さくすると、クロマトグラフィーピーク間の差が大きくなるため、分析法の特異性を高めることができます。

データ解析では、保持時間と移動度を決定する際に、関連性のない信号を無視することが重要です。HRMSの利点により、m/zウィンドウが狭くなり(標準質量分解能は~50,000)、追加の移動度フィルタリングが可能になり、化学ノイズが低減されます。

ここで説明する方法は、未知のサンプルからのフェンタニル類似体をスクリーニングするための参照ライブラリを提供します。報告されたRT、K、同位体、およびMSフラグメンテーションパターンは、データ処理および不明な割り当て中に修飾子として使用されます。従来のMRM LC-QQQ分析と比較すると、同様のLODが達成可能ですが、13、19、27、FIDキットを使用して生成されたデータベースに含まれていない代替オピオイドをスクリーニングできるという独自の利点があります。新しいオピオイドは、最終的な検証のために合成標準を使用した分析が必要になります。

開示事項

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Matthew WillettsとMelvin A. Parkは、商用楽器timsTOF Pro2のメーカーであるBruker Daltonics Inc.の従業員です。他のすべての著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

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著者は、初期のメソッド開発における Cesar Ramirez 博士の初期サポートに感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HPLC用ギ酸アンモニウムFluka17843-50G
Eppendorf スナップキャップマイクロ遠心分離機 セーフロックチューブフィッシャー05-402-25
ESI-L 低濃度チューニングミックスAgilentG1969-85000
フェンタニルアナログスクリーニング (FAS) キット ケイマンケミカル9003237、9003286、9003380、250種類のスノテティックオピオイド、210種類のフェンタニル類似体の9003381キット、1つのキットと緊急パネルバージョンに分割 1-4
ギ酸オプティマLC/MSフィッシャーA117-50
オニキスガードカラム (5 x 4.6 mm) C18カラム用PhenomenexCHO-7649
OnyxモノリシックC18 HPLCカラム(100 x 4.6 mm)PhenomenexCHO-7643相C18 LCカラム
Optimaグレードアセトニトリル フィッシャーA996-4
オプティマグレードのメタノールフィッシャーA454-4
オプティマグレードの水フィッシャーW7-4
ピペットフィッシャー05-719-510キット1-10&マイクロ;L、10-100 µL、および100-1000µLピペット
ピペットチップ10µLフィッシャー94060100
ピペットチップ 1000µLフィッシャー94056710
ピペットチップ 200µLフィッシャー94060310
プレートミキサーIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph島津製作所、日本DGU-20A5、LC-20AD、SIL-20AC、CTO-20A、SPD-M20A、CBM-20A、SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF instrument with PASEF 
ガードカラム逆

参考文献

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