ヒト幹細胞由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの表現型プロファイリング

Summary

このプロトコルは免疫学の汚損および得られた顕微鏡のハイコンテント画像からのニューロンの表現型のプロフィールの生成に先行している人間の中脳のdopaminergicニューロンの細胞の培養を、記述し、遺伝か化学調節による表現型の変化の同一証明を可能にする。

Abstract

パーキンソン病(PD)は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失を引き起こすさまざまな細胞生物学的プロセスに関連しています。現在の 多くのin vitro PD細胞モデルは複雑さに欠けており、複数の表現型を考慮していません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンの表現型プロファイリングは、PD関連細胞タイプのニューロン表現型の範囲を同時に並行して測定することで、これらの欠点に対処することができます。ここでは、市販のヒトmDAニューロンから表現型プロファイルを取得して解析するためのプロトコルについて説明します。ニューロン特異的蛍光染色パネルを使用して、核、α-シヌクレイン、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および微小管関連タンパク質2(MAP2)関連の表現型を可視化します。記載された表現型プロファイリングプロトコルは、384ウェルプレート、自動リキッドハンドリング、ハイスループット顕微鏡を使用するため、スケーラブルです。プロトコルの有用性は、健康なドナーmDAニューロンおよびロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子のPD結合G2019S変異を有するmDAニューロンを用いて例証される。両細胞株をLRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360で処理し、表現型の変化を測定した。さらに、クラスタリングまたは機械学習主導の教師あり分類手法を使用して、多次元表現型プロファイルを分析する方法を示します。記載されたプロトコルは、神経疾患のモデリングに取り組んでいる研究者や、ヒトニューロンにおける化合物効果の研究に特に興味を引くでしょう。

Introduction

パーキンソン病(PD)では、さまざまな細胞生物学的プロセスが妨げられています。例えば、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、タンパク質分解の欠陥、小胞輸送の破壊、およびエンドリソソーム機能は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失と関連しており、^PD1で一般的に観察されます。したがって、PDには、互いに相互作用して悪化する可能性のある複数の疾患メカニズムが関与しているようです。この機構の相互作用を調査する有用な方法の1つは、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの包括的な表現型フィンガープリントまたはプロファイルの作成です。

表現型プロファイリングは、測定可能な特性のコレクションに基づいてサンプルのプロファイルを作成するアプローチであり、次に、このプロファイルに基づいてサンプルに関する予測を行うことが含まれます^2,3。プロファイリングの目的は、多様な特徴を捉えることであり、その一部はこれまで疾患や治療と関連付けられていなかった可能性がある³。その結果、プロファイリングにより、予期しない生物学的プロセスを明らかにすることができます。表現型プロファイリングは、通常、蛍光染色された細胞に依存しており、表現型プロファイルを作成するために、セルペインティングなどの....

Protocol

1.ニューロン播種用の培地とプレートの準備(1日目)

1. 1日目にニューロン播種用のプレートを準備するには、使用直前にラミニンを室温(RT)に温めます。ラミニン原液(0.1 mg/mL)を冷たいPBS+/+(Ca2⁺ および^Mg2+)で1/10に希釈して、ラミニン溶液を調製します。
   注:すべての試薬は 材料表に記載されています。溶液および緩衝液の組成を 表1〜4に記載する。
2. 次に、ポリ-D-リジン(PDL)プレコートした384ウェルプレートの各ウェルに25 μLのラミニン溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 コーティングされたプレートは、4°Cで最大1週間保存できます。
   注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。プラスチックフィルムを使用したシールプレートです。
3. コンプリートメンテナンス培地を調製し、4°Cで最長1ヶ月間保管します(表1)。

2.ニューロンの融解(0日目)

1. 0日目にニューロンを融解するには、ウォーターバスを37°Cに予熱し、完全維持培地を光から保護したRTに平衡化します。
2. 市販の凍結ニューロン( 材....

Results

mDAニューロンの表現型プロファイリングは、細胞生物学の複数の側面と実験変調中のそれらの変化を定量化するための効率的な方法です。この方法論を実証するために、この研究では、凍結保存されたLRRK2 G2019Sと健康なドナーmDAニューロンを利用しました。これらのニューロンは約37日間分化しており、有糸分裂後および発現ニューロンマーカー(TUBB3およびMAP2)およびFOXA2と組み合わせたチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を含むドーパミン作動性ニューロンマーカーであるが、グリアマーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)は存在しない¹⁴。記載されたプロトコルに従って、両方の細胞株を6日間培養し、LRRK2キナーゼ阻害剤である0.1μMのPFE-360で処理しました。ニューロンは、核染色剤Hoechstと、α-シヌクレイン、TH、およびMAP2に対する抗体を使用して染色しました(図2)。

次に、画像をセグメント化し、表現型の特徴を抽出しました。126の定量的特徴を決定し、適.......

Discussion

表現型プロファイリングは、蛍光染色、顕微鏡、画像解析を適用することにより、細胞内の多数の表現型を測定する技術です³。表現型プロファイルを取得し、細胞株やその他の実験条件で比較することで、単一の読み出しでは見過ごされがちな細胞生物学の複雑な変化を理解することができます。ここでは、PD細胞生物学のモデル化によく使用される細胞型であるヒトiPS細胞由来mDAニューロンへの表現型プロファイリングの応用について説明します17,18,19。mDAニューロンの表現型プロファイリングは、一般的な蛍光染色4、非ニューロン細胞タイプ^5,6、またはスケーラブルではない^7,8

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アンチチキン–Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	免疫蛍光
抗チロシンヒドロキシラーゼ	メルク	T2928	免疫蛍光
抗アルファ;-シヌクレイン	アブカム	138501	免疫蛍光
ブラボー 384STヘッド付き自動リキッドハンドリングプラットフォーム	アジレント		リキッドハンドラーが利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
共焦点顕微鏡	横河	CV7000	画質の一貫性を確保するために、自動共焦点蛍光顕微鏡の使用をお勧めします。
Countess 自動セルカウンター	Invitrogen		播種前の細胞カウント。手動計数チャンバーを使用して行うこともできます。
DPBS +/+	Gibco	14040-133
EL406 ウォッシャーディスペンサー洗浄用バッファー	BioTek(アジレント)		リキッドハンドラーが利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
ホルムアルデヒド溶液 (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	染色前の固定
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	核染色
iCell ベース培地 1	富士フイルム	M1010	ニューロン用ベース培地
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	富士フイルム	C1087	明らかに健康なドナー
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	富士フイルム	M1031	塩基培地用サプリメント
iCell Neural Supplement B	富士フイルム	M1029	塩基用培地
用サプリメント Jupyter Python Notebook	自社開発	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	生データから表現型プロファイルの可視化と分類を行うためのノートブックです。
Laminin	Biolamina	LN521	プレートコーティング
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 キナーゼ阻害剤
PhenoLink	画像解析用社内	開発	https://github.com/Ksilink/PhenoLink
PhenoPlate 384w, PDL コーティング	Perkin Elmer	6057500	細胞培養およびイメージング用のプレコートプレート。このプレートは、横河電機CV7000顕微鏡のすべての対物レンズを使用して、すべてのウェルのイメージングを可能にします。
保存プレートAbgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Vprepピペッティングシステムを使用した化合物分注に必要です。利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
Triton	Sigma	T9284	溶解前の透過処理
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	生細胞の測定
Vprep ピペッティングシステム	アジレント		培地の変更とコンパウンドディスペンス。また、電動マルチチャンネルピペットを使用することもできます。