ヒト幹細胞由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの表現型プロファイリング

サマリー

このプロトコルは免疫学の汚損および得られた顕微鏡のハイコンテント画像からのニューロンの表現型のプロフィールの生成に先行している人間の中脳のdopaminergicニューロンの細胞の培養を、記述し、遺伝か化学調節による表現型の変化の同一証明を可能にする。

要約

パーキンソン病(PD)は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失を引き起こすさまざまな細胞生物学的プロセスに関連しています。現在の 多くのin vitro PD細胞モデルは複雑さに欠けており、複数の表現型を考慮していません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンの表現型プロファイリングは、PD関連細胞タイプのニューロン表現型の範囲を同時に並行して測定することで、これらの欠点に対処することができます。ここでは、市販のヒトmDAニューロンから表現型プロファイルを取得して解析するためのプロトコルについて説明します。ニューロン特異的蛍光染色パネルを使用して、核、α-シヌクレイン、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および微小管関連タンパク質2(MAP2)関連の表現型を可視化します。記載された表現型プロファイリングプロトコルは、384ウェルプレート、自動リキッドハンドリング、ハイスループット顕微鏡を使用するため、スケーラブルです。プロトコルの有用性は、健康なドナーmDAニューロンおよびロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子のPD結合G2019S変異を有するmDAニューロンを用いて例証される。両細胞株をLRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360で処理し、表現型の変化を測定した。さらに、クラスタリングまたは機械学習主導の教師あり分類手法を使用して、多次元表現型プロファイルを分析する方法を示します。記載されたプロトコルは、神経疾患のモデリングに取り組んでいる研究者や、ヒトニューロンにおける化合物効果の研究に特に興味を引くでしょう。

概要

パーキンソン病(PD)では、さまざまな細胞生物学的プロセスが妨げられています。例えば、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、タンパク質分解の欠陥、小胞輸送の破壊、およびエンドリソソーム機能は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失と関連しており、^PD1で一般的に観察されます。したがって、PDには、互いに相互作用して悪化する可能性のある複数の疾患メカニズムが関与しているようです。この機構の相互作用を調査する有用な方法の1つは、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの包括的な表現型フィンガープリントまたはプロファイルの作成です。

表現型プロファイリングは、測定可能な特性のコレクションに基づいてサンプルのプロファイルを作成するアプローチであり、次に、このプロファイルに基づいてサンプルに関する予測を行うことが含まれます^2,3。プロファイリングの目的は、多様な特徴を捉えることであり、その一部はこれまで疾患や治療と関連付けられていなかった可能性がある³。その結果、プロファイリングにより、予期しない生物学的プロセスを明らかにすることができます。表現型プロファイリングは、通常、蛍光染色された細胞に依存しており、表現型プロファイルを作成するために、セルペインティングなどの標準化されたアッセイが開発されています⁴。最近では、表現型プロファイリングは、例えば、低分子の特性評価や、患者由来の線維芽細胞のみに基づくPDサブタイプの正確な予測に適用されています^5,6。これらの進歩にもかかわらず、表現型プロファイリングは、LRRK2 G2019SなどのPD関連変異を発現するヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンなど、有糸分裂後の分化細胞に適用されることはめったにありません。iPS細胞由来モデルの重要な課題には、分化バッチまたは遺伝子型にわたって微妙または可変の病理学的特徴が存在すること、および単離されたPD表現型が疾患の複雑さを完全に捉えていないという事実が含まれます。さらに、iPS細胞の神経モデルは生理学的に関連性があるが、技術的な複雑さが懸念されるため、PD創薬プロセスで使用されることはほとんどない^7,8。

私たちは以前、遺伝的および化合物による表現^{型の変化に}敏感なヒトmDAニューロンにおける複数のPD関連の病態生理学的表現型を測定するための堅牢な方法論を開発しました9。本稿では、mDAニューロンから表現型プロファイルを作成するために、この方法論をさらに最適化したバージョンについて詳しく説明します(図1)。このプロトコルには、高品質のmDAニューロンの使用や技術的な再現性など、前述の表現型プロファイリングアプローチに比べていくつかの利点があります。このプロトコルは、化学的摂動後の生理学的に関連する有糸分裂後mDAニューロンの表現型プロファイリングを、初めて拡張可能な方法で可能にします。完全に分化して凍結保存されたmDAニューロンが市販されており、バッチ間の分化のばらつきが大幅に減少しています。第二に、明確に定義された実験計画(培養期間やエッジウェルの回避など)、自動リキッドハンドリング、自動顕微鏡を使用することで、技術的なばらつきをさらに減らすことができます。さらに、教師なしクラスタリングまたは教師あり分類アプローチを使用した表現型プロファイル分析の最初のステップをここで概説し、表現型プロファイリングデータを分析する方法を示します。このプロトコルは、遺伝的または化学的摂動によって引き起こされるmDAニューロンの表現型の変化に関心のある研究者にとって、特に、スクリーニングキャンペーン中など、非常にスケーラブルな研究セットアップが必要な場合、または毒性作用を決定するために少数の化合物の効果を研究する場合などに使用されます。要約すると、ヒトニューロンの表現型プロファイリングの応用は、複雑な疾患関連の表現型を研究し、薬剤候補の細胞効果を特徴付けるための貴重な技術であると予想されます。

図1:ヒトiPS細胞由来のmDAニューロンから画像ベースの表現型プロファイルを生成するための実験プロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1.ニューロン播種用の培地とプレートの準備(1日目)

1. 1日目にニューロン播種用のプレートを準備するには、使用直前にラミニンを室温(RT)に温めます。ラミニン原液(0.1 mg/mL)を冷たいPBS+/+(Ca2⁺ および^Mg2+)で1/10に希釈して、ラミニン溶液を調製します。
   注:すべての試薬は 材料表に記載されています。溶液および緩衝液の組成を 表1〜4に記載する。
2. 次に、ポリ-D-リジン(PDL)プレコートした384ウェルプレートの各ウェルに25 μLのラミニン溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 コーティングされたプレートは、4°Cで最大1週間保存できます。
   注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。プラスチックフィルムを使用したシールプレートです。
3. コンプリートメンテナンス培地を調製し、4°Cで最長1ヶ月間保管します(表1)。

2.ニューロンの融解(0日目)

1. 0日目にニューロンを融解するには、ウォーターバスを37°Cに予熱し、完全維持培地を光から保護したRTに平衡化します。
2. 市販の凍結ニューロン( 材料表を参照)が入ったバイアルを液体窒素タンクから取り出し、ドライアイスの上に置きます。次に、バイアルをウォーターバスに2分間入れます。液体が完全に解凍されたら、バイアルを70%エタノールで消毒します。.
3. 融解したニューロンをP1000ピペット(約370 μL)で吸引し、上下ピペッティングなしで50 mLの遠心チューブに移します。次に、バイアルを630 μLのコンプリートメンテナンス培地ですすぎ、50 mLチューブに一滴ずつ(45°の角度で)分注します。分注しながらゆっくりと攪拌します。
   注:細胞の浸透圧破裂を避けるために、培地を一滴ずつゆっくりと分注することが重要です。45°の角度と軽い撹拌により、ピペッティング中の局所浸透圧の高さが最小限に抑えられます。
4. 同様に、P1000ピペットで50 mL遠心分離管に1 mLの完全維持培地を加えます。次に、2 mLの完全維持培地をゆっくりと加えます。分注中は慎重に攪拌してください。
5. セルを数えます。10 μLのトリパンブルーと10 μLの細胞懸濁液を入れたマイクロチューブを調製し、計数チャンバースライド(10 μL)に加えます。自動セルカウンター( 材料表を参照)または手動で計数します。
6. カウント後、ニューロンを含む50 mLチューブを400 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を除去します。P1000ピペットと1 mLの完全維持培地を使用して、ペレットを慎重に再懸濁します。次に、必要な容量を添加して目的の濃度(300,000細胞/mL、次のステップも参照)にします。

3.準備したプレートへのニューロンの播種(0日目)

1. 0日目に調製したプレートにニューロンを播種するには、コーティングされたプレートを冷蔵庫から取り出し、細胞培養フードの下に置き、RTに約30分間平衡化させます。
2. 播種直前に、15 μLのコーティング溶液を自動リキッドハンドラーまたは16チャンネルピペットで吸引します。コーティングの損傷を防ぐために、ウェルあたり約10 μLを残します。
3. 次に、ウェルあたり300,000細胞/mL(ステップ2.6で調製)を含む細胞溶液50 μLを16チャンネルピペットで分注し、ウェルあたり15,000個の播種ニューロン、ウェルあたりの最終容量60 μLになります。
4. 384ウェルプレートでは、1列目、2列目、23列目、24列目、列A、B、O、Pの使用は避けて、表現型プロファイルに影響を与える可能性のあるエッジ効果を最小限に抑えます。未使用の空のウェルに 80 μL の PBS を充填します。プレートを 37 °C および 5% CO₂ でインキュベートします。

4.培地交換または複合処理(3日目)

1. ウェルの数に応じて、RTで適切な量の完全メンテナンス培地を予め温めます。
2. 中程度の変更が必要な場合は、手順4.4に進みます。化合物処理をご希望の場合は、化合物のストック濃度と使用する溶媒(水、DMSO、メタノールなど)を確認してください。
3. 1.5倍濃縮の化合物溶液を調製し、必要なすべての濃度を試験します。コンパウンド希釈液は、完全維持培地を使用して調製します。
   注:中性コントロールとして、試験した化合物と同じ濃度の溶媒を使用してください。異なる濃度の複数の化合物または未知の化合物を使用する場合は、表現型プロファイルに対する溶媒の影響を測定するために、別の用量反応実験を実施することをお勧めします。
4. 自動ピペッティングシステムを使用する場合は、1.5倍の複合溶液60 μLを384ウェル保存プレートに加えます。または、16チャンネルピペットを使用します。培地の交換が必要な場合は、代わりに60 μLの完全維持培地を追加してください。
5. 自動ピペッティングシステムを使用して、ニューロン含有プレートからウェルあたり40 μLの培地を吸引して廃棄し、20 μL/ウェルを保持します。次に、40 μL/ウェルの 1.5 倍化合物溶液を 384 ウェル保存プレートから各ウェルに添加し、目的の最終濃度を得ます。
   注:完全な培地交換を行うのではなく、ニューロンカーペットやコーティングの損傷を防ぐために、常にウェルに残留培地を残すことが重要です。
6. 神経細胞培養がこのプロトコルに記載されている6日を超えて行われる場合は、2〜3日ごとに培地を交換してください。

5.ニューロンの固定と染色(6〜7日目)

1. 6日目と7日目にニューロンを固定して染色するには、すべての分注および洗浄ステップに自動リキッドハンドラーを使用します。または、16チャンネルピペットを使用します。
2. Triton X-100 を 1x PBS で希釈して、10% Triton X-100 溶液を調製します。溶液が均一になるまでボルテックスします。4°Cで保存してください。
3. ニューロンを固定するには、20 μL/ウェルの 16% PFA を分注し、最終濃度が 4% になるようにします。プレートを室温で30分間インキュベートし、1x PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、20 μL/ウェルのPBSを残します。
   注意:PFAは、経口、皮膚、および呼吸器毒性を引き起こすことが知られている有害物質として認識されています。また、目にも脅威を与え、遺伝子変異や癌につながる可能性があります。PFAを適切に取り扱うには、適切な換気を確保することに加えて、目や顔の保護具などの適切な個人用保護具を使用する必要があります。PFAの環境への放出を防ぐことが重要です。
4. 透過処理とブロッキングのために、2倍ブロッキング溶液を調製します(表2)。
5. 20 μL/ウェルの2倍ブロッキング溶液(最終濃度1倍)を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで1回洗浄します。洗浄後はPBSを20 μL/ウェルに保管してください。
6. 一次抗体( 材料表を参照)染色の場合は、2x一次染色バッファー(表3)を調製します。
7. 20 μL/ウェルの2x 一次染色バッファー(最終濃度1倍)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、7日目にPBSで3回洗います。洗浄後、PBSを20 μL/ウェル残します。
8. 二次抗体( 材料表を参照)染色の場合は、2x二次染色バッファーを調製します(表4)。
9. 20 μL/ウェルの2x 二次染色バッファー(最終濃度 1x )を加え、光を避けた室温で 2 時間インキュベートし、PBS で 3 回洗浄します。最後の洗浄後、100 μLのPBS/ウェルを残します。
   1. 蒸発を最小限に抑えるために、プレートにアルミニウムシーリングを追加します。または、プラスチックフィルムとアルミホイルを使用してプレートを覆います。画像取得に進むか、プレートを4°Cで保管してください。
      注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。バックグラウンド蛍光が観察される場合は、ブロッキング時間を長くすることを検討してください。染色が不十分な場合は、一次抗体の濃度を上げるか、インキュベーション時間を増やしてみてください。

6.蛍光染色されたニューロンのイメージング(7日目)

1. 7日目に播種、培養、染色したニューロンの画像を取得します。理想的には、自動共焦点蛍光顕微鏡を使用します( 材料表を参照)。または、画像を手動で取得します。
2. 405 nm、488 nm、561 nm、647 nmのレーザーを使用して、Hoechst、TH、α-シヌクレイン、MAP2チャネルをそれぞれ取得します(図2)。
   注:表現型プロファイリングに十分な量の詳細データを生成するには、40倍の対物レンズを使用し、2 μmで分離された3つのZスライスで構成されるZスタックを使用して16フィールド/ウェルを取得します。ニューロンカーペットにピペッティング関連の損傷がある場合は、これらの領域のイメージングを避けるようにしてください。
3. 顕微鏡とカメラに応じて、4つの蛍光チャンネルのそれぞれについて露光時間と励起強度を個別に調整し、蛍光強度の最適なダイナミックレンジを取得します。
   注意: イメージングソフトウェアは、多くの場合、理想的な露光時間を決定するためのヒストグラムを提供します。低信号範囲でヒストグラムが左にシフトしすぎる場合は、露光時間が短すぎるか、励起強度が低すぎます。右側の最大信号レベルに鋭い崖がある場合、信号値は飽和しています。この場合、励起強度を下げるか、露光時間を短くしてください。
4. .tifなどのロスのないオープン形式で画像を保存します。

7. 画像処理(8日目)

1. 定量的な表現型プロファイルの作成には、画像のセグメンテーションと表現型の特徴抽出が必要です。画像のセグメンテーションと特徴抽出には、PhenoLinkソフトウェアを使用します(材料表)。PhenoLinkのインストール手順は、GitHubリポジトリ(https://github.com/Ksilink/PhenoLink)にあります。
   注:画像セグメンテーションは、画像内のさまざまなオブジェクトまたは領域を識別して分離するために使用され、表現型特徴抽出は、それらの領域から関連情報を分析および抽出するために使用されます。CellProfiler 10、ImageJ/FIJI 11、Napari¹²、Knime Analytics Platform¹³ など、マルチチャンネル蛍光画像から定量的な情報を抽出するための代替ソフトウェアソリューションがいくつか用意されています。
2. 照明補正されたRAW画像に対して画像セグメンテーションを実行します。バックグラウンドシグナルが最小になり、所望のセグメント化されたシグナルが生画像のシグナルに対応するように、プレートごとにそれぞれの蛍光チャネル強度閾値を経験的に決定します。同じ日に処理および染色されたプレートは、通常、セグメンテーションに同等のチャネル強度閾値を必要とします。
3. 核のサイズと強度を定義して、生きている細胞と死んだ細胞を分離します。40倍の画像を使用する場合は、他のすべてのデフォルトパラメータを保持し、ソフトウェアを実行します。1ウェルあたり126の定量的画像特徴量が計算されます(付表1)。
4. 得られた表形式の定量データを使用して、表現型プロファイルを構築し、異なる細胞株または処理条件からの表現型プロファイルを比較します。各行は生物学的条件(ウェル)に対応し、各列は決定された表現型の特徴に対応します。
   注: 使用方法を説明するために、データ分析パイプラインとともに出力ファイルの例を提供します ( 材料表を参照)。さらに、 図3 は表現型プロファイルの構成を示しています。

8.表現型プロファイルの生成と視覚化(8日目)

1. コンピューターに Python と Jupyter がインストールされていない場合は、Anaconda ディストリビューションをインストールし、Jupyter ソフトウェアを開きます。提供されている Jupyter Notebook とその他すべての提供されているファイルをダウンロードし、同じディレクトリに保存します ( 「材料表」を参照)。Jupyter ソフトウェアを使用して Jupyter Notebook ファイルを開きます。
   注:Anacondaは、Pythonなどのプログラミング言語用の無料のオープンソースプラットフォームです。このプラットフォームには、提供された Jupyter Notebook を実行して表現型プロファイル (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) を作成および分析できる Python インタープリター Jupyter が付属しています。
2. Jupyter ソフトウェアを使用して、Jupyter Notebook をセルごとに実行します。提供されているサンプル データ .fth ファイルと要件 ..txt ファイルは、Jupyter ノートブックと同じディレクトリに配置する必要があります。Jupyter Notebook の各セルには、その機能を説明する注釈が付けられています。
   注: Jupyter Notebook は、データの読み込みとスケーリングから正しい順序で使用し、セルごとに最後まで進めることが重要です。すべてのデータとグラフィックスの出力は、Jupyter Notebook ソース ディレクトリに新しく作成されたフォルダーに格納されます。 図 4 は、ワークフローとワークフロー出力を示しています。

結果

mDAニューロンの表現型プロファイリングは、細胞生物学の複数の側面と実験変調中のそれらの変化を定量化するための効率的な方法です。この方法論を実証するために、この研究では、凍結保存されたLRRK2 G2019Sと健康なドナーmDAニューロンを利用しました。これらのニューロンは約37日間分化しており、有糸分裂後および発現ニューロンマーカー(TUBB3およびMAP2)およびFOXA2と組み合わせたチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を含むドーパミン作動性ニューロンマーカーであるが、グリアマーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)は存在しない¹⁴。記載されたプロトコルに従って、両方の細胞株を6日間培養し、LRRK2キナーゼ阻害剤である0.1μMのPFE-360で処理しました。ニューロンは、核染色剤Hoechstと、α-シヌクレイン、TH、およびMAP2に対する抗体を使用して染色しました(図2)。

次に、画像をセグメント化し、表現型の特徴を抽出しました。126の定量的特徴を決定し、適...

ディスカッション

表現型プロファイリングは、蛍光染色、顕微鏡、画像解析を適用することにより、細胞内の多数の表現型を測定する技術です³。表現型プロファイルを取得し、細胞株やその他の実験条件で比較することで、単一の読み出しでは見過ごされがちな細胞生物学の複雑な変化を理解することができます。ここでは、PD細胞生物学のモデル化によく使用される細胞型であるヒトiPS細胞由来mDAニューロンへの表現型プロファイリングの応用について説明します17,18,19。mDAニューロンの表現型プロファイリングは、一般的な蛍光染色4、非ニューロン細胞タイプ^5,6、またはスケーラブルではない^7,8

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンチチキン–Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	免疫蛍光
抗チロシンヒドロキシラーゼ	メルク	T2928	免疫蛍光
抗アルファ;-シヌクレイン	アブカム	138501	免疫蛍光
ブラボー 384STヘッド付き自動リキッドハンドリングプラットフォーム	アジレント		リキッドハンドラーが利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
共焦点顕微鏡	横河	CV7000	画質の一貫性を確保するために、自動共焦点蛍光顕微鏡の使用をお勧めします。
Countess 自動セルカウンター	Invitrogen		播種前の細胞カウント。手動計数チャンバーを使用して行うこともできます。
DPBS +/+	Gibco	14040-133
EL406 ウォッシャーディスペンサー洗浄用バッファー	BioTek(アジレント)		リキッドハンドラーが利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
ホルムアルデヒド溶液 (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	染色前の固定
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	核染色
iCell ベース培地 1	富士フイルム	M1010	ニューロン用ベース培地
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	富士フイルム	C1087	明らかに健康なドナー
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	富士フイルム	M1031	塩基培地用サプリメント
iCell Neural Supplement B	富士フイルム	M1029	塩基用培地
用サプリメント Jupyter Python Notebook	自社開発	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	生データから表現型プロファイルの可視化と分類を行うためのノートブックです。
Laminin	Biolamina	LN521	プレートコーティング
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 キナーゼ阻害剤
PhenoLink	画像解析用社内	開発	https://github.com/Ksilink/PhenoLink
PhenoPlate 384w, PDL コーティング	Perkin Elmer	6057500	細胞培養およびイメージング用のプレコートプレート。このプレートは、横河電機CV7000顕微鏡のすべての対物レンズを使用して、すべてのウェルのイメージングを可能にします。
保存プレートAbgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Vprepピペッティングシステムを使用した化合物分注に必要です。利用できない場合は、電動マルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。
Triton	Sigma	T9284	溶解前の透過処理
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	生細胞の測定
Vprep ピペッティングシステム	アジレント		培地の変更とコンパウンドディスペンス。また、電動マルチチャンネルピペットを使用することもできます。