間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Summary

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

Introduction

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパ^{タイトなどの}鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています^5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO^{)プロセスを通じて}骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります

Protocol

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。

1. 緩衝液および試薬の調製

1. 間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培地)をMSC基礎培地にMSC増殖培地のサプリメントキットを添加し、4°Cで保存します。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、200 μM L-アラニル-L-グルタミン、および1 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子を培地に添加して、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムF12(DMEM/F-12)培地を調製し、4°Cで保存します。
3. 使用直前に、1% ITS-Gサプリメント、0.12%ウシ血清アルブミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.35 mM L-プロリン、100 nMデキサメタゾン、および10 ng/mL TGF-β3をDMEMに添加して、軟骨形成培地を調製します。
4. 使用直前に、10 mM β-グリセロリン酸、0.12% ウシ血清アルブミン、10 nM デキサメタゾン、200 μM アスコルビン酸-2-リン酸、50 nM L-チロキシン、50 μg/....

Results

MSCを内包したHAハイドロゲルを、軟骨形成の誘導因子であるTGFβ3を添加した軟骨形成培地で培養した⁴¹ (ステップ4.1)。我々は、HAの特性を、前述のように、軟骨内骨化のためのMSCベースの人工軟骨移植片の作成に有効であることが示されているコラーゲンの特性と比較した³⁸。未分化MSCは、骨形成分化(すなわち、膜内骨^{化)によって}骨を生成するためのプライミング基質として石灰化表面を必要とすることが実証されているため、この研究では未分化MSCをネガティブコントロールとして含めませんでした7。

ヒアルロン酸ハイドロゲルのサイズは、倒立顕微鏡で測定した直径から判断すると、 in vitro 培養期間を通して変化しなかったが、比較に用いたコラーゲンハイドロゲルは培養開始後すぐに収縮し始めた。 in vitro 培養後のHAコンストラクトとコラーゲンコンストラクトのサイズ差を小さくするために、HAハイドロゲルの作.......

Discussion

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています³⁸。さらに、in vivoでは、HAコンストラクトは、同じポケットに移植された複数のコンストラクトの融合を促進し、単一の統合された骨を形成することが示されました。MSCと足場材料との相互作用は軟骨および肥大型軟骨形成に大きく影響するため、ECOに適した足場材料を選択することは、臨床的に効果的な組織改変軟骨移植片を生成するために重要です。HAハイドロゲルに埋め込まれた細胞は、中心から末梢にかけて軟骨細胞に特徴的な丸みを帯びた形態を均一に示し、ヒアルロン酸がハイドロゲル全体に均一な軟骨形成を助長する環境を提供していることを示している^21,30

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% トリプシン-1mmol/L EDTA.4Na溶液	富士フイルム和光ピュアケミカル	209-16941
アンチセダン	日本全薬工業
アスコルビン酸-2-リン酸	ナカライ テスク	13571-14
バンバンカー	GC リンフォテック	CS-02-001
塩基性線維芽細胞増殖因子	リプロセル	RCHEOT002
ウシ血清アルブミン	富士フイルム和光ピュアケミカル	012-23881	7.5 w/v%
Countess 自動セルカウンター セルカウンティングチャンバースライドとトリパンブルーステイン 0.4%	Invitrogen	C10283
デキサメタゾン	メルク	D8893
ドミトール	日本全薬工業
ドーミカム	アステラス製薬
ダルベッコ モディファイドイーグル ミディアム	メルク	D6429	高グルコース
ダルベッコ改変イーグル中/栄養混合物 F-12 ハム	メルク	D6421
ウシ胎児血清	ハイクロン	SH30396.03
硫酸ゲンタマイシン	富士フイルム和光ピュアケミカル	1676045	10 mg/mL
ハセッパー ジェネレーター	テクノマックス	CH-400-5QB	50 ppm 次亜塩素酸水
ヒト間葉系幹細胞	ロンザ	PT-2501
HyStem 細胞培養足場キット	メルク	HYS020
IL-1ß	ペプロテック	AF-200-01B
ITS-Gサプリメント	富士フイルム和光ピュアケミカル	090-06741	×100
L-アラニル-L-グルタミン	富士フイルム和光ピュアケミカル	016-21841	200mmol/L (×100)
L-プロリン	ナカライ テスク	29001-42
L-チロキシン	メルク	T1775
MSCGM 間葉系幹細胞増殖培地 BulletKit	ロンザ	PT-3001
パラフィン	富士フイルム和光ピュアケミカル	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	メディカゴ	09-2051-100
TGF-&β;3	プロテインテック	HZ-1090
ベルトールファレ	明治製菓株式会社
Visiocare 軟膏	サバベット/サヴァヘルスケア
&β;-グリセロリン酸	富士フイルム和光ピュアケミカル	048-34332