間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

サマリー

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

要約

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

概要

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパ^{タイトなどの}鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています^5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO^{)プロセスを通じて}骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります¹¹。

発生中の骨格形成における生来のメカニズムである軟骨内骨化(ECO)プロセスを再現するために適用された戦略は、従来のIMOベースのアプローチに関連する重大な問題を克服することが示されています。ECOでは、軟骨テンプレートの軟骨細胞が血管内皮増殖因子(VEGF)を放出し、血管浸潤と軟骨テンプレートの骨へのリモデリングを促進します¹²。軟骨リモデリングと血管新生による骨形成へのECOを介したアプローチは、骨折修復中にも活性化され、MSCに由来する人工的に作成された軟骨組織をプライミング材料として使用します。軟骨細胞は、骨欠損の低酸素症に耐え、血管新生を誘導し、血管のない軟骨移植片を血管新生組織に変換することができます。MSCベースの軟骨移植片は、そのようなECOプログラムを実施することにより、in vivoで骨を生成することが多くの研究で報告されています¹³、^14、15、16、¹⁷、^18、19、^20、21。

このECOを介したアプローチの臨床応用に不可欠な要件は、臨床現場で必要な量の軟骨移植片を準備する方法です。実際の骨欠損にフィットするサイズの臨床軟骨を作製することは現実的ではありません。したがって、移植軟骨は、複数の断片が移植されるときに骨を一体的に形成する必要があります²²。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップするための魅力的なツールとなる可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、in vitroでのMSC軟骨形成およびin vivoでのECO形成をサポートします23,24,25,26,27,28,29,30,31,32;しかし、臨床応用の要件を満たすための最適な支持材料は未定のままです。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスに存在する生分解性で生体適合性の多糖類である³³。HAはCD44などの表面受容体を介してMSCと相互作用し、軟骨形成分化をサポートします25,26,28,30,31,32,34。さらに、HAスキャフォールドはIMOを介したヒト歯髄幹細胞の骨形成分化を促進し³⁵、コラーゲンと組み合わせたスキャフォールドはECOを介した骨形成を促進する^36,37。

ここでは、骨髄由来の成人ヒトMSCを用いたHAハイドロゲルの調製方法と、in vitroでの肥大型軟骨形成およびその後のin vivo軟骨内骨化への使用について紹介する³⁸。我々は、HAの特性を、MSCを用いた骨組織工学に広く適用され、軟骨内骨化のための人工移植片のスケールアップに有用な材料であるコラーゲンの特性と比較した¹⁷。免疫不全マウスモデルにおいて、ヒトMSCを播種したHAおよびコラーゲンコンストラクトを皮下移植によりin vivo ECOの可能性について評価しました。その結果、HAハイドロゲルは、間葉系幹細胞がECOによる骨形成を可能にする人工軟骨移植片を作るための足場として優れていることが示されました。

プロトコルは2つのステップに分かれています。まず、ヒアルロン酸ハイドロゲル上に播種されたヒト間葉系幹細胞のコンストラクトを調製し、 in vitroで肥厚軟骨に分化させる。次に、分化した構築物をヌードモデルに皮下移植し、 in vivo で軟骨内骨化を誘導します(図1)。

プロトコル

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。

1. 緩衝液および試薬の調製

1. 間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培地)をMSC基礎培地にMSC増殖培地のサプリメントキットを添加し、4°Cで保存します。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、200 μM L-アラニル-L-グルタミン、および1 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子を培地に添加して、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムF12(DMEM/F-12)培地を調製し、4°Cで保存します。
3. 使用直前に、1% ITS-Gサプリメント、0.12%ウシ血清アルブミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.35 mM L-プロリン、100 nMデキサメタゾン、および10 ng/mL TGF-β3をDMEMに添加して、軟骨形成培地を調製します。
4. 使用直前に、10 mM β-グリセロリン酸、0.12% ウシ血清アルブミン、10 nM デキサメタゾン、200 μM アスコルビン酸-2-リン酸、50 nM L-チロキシン、50 μg/mL ゲンタマイシン、50 pg/mL IL-1β を DMEM に添加して、肥大培地を調製します。
5. 60°Cに予熱した200μLの溶融パラフィンを24ウェル培養皿にコーティングします。 パラフィンが固まるまで室温で放置します。

2. ヒト間葉系幹細胞の拡大

注:実験を開始する前に、^MSC軟骨形成の可能性が高いMSCをマイクロマス培養で選択する必要があります。

1. 製造業者の指示に従い、初代ヒト骨髄由来MSC(継代2)を、5%CO2および95%加湿空気インキュベーター中で、5×10³細胞/^cm2の密度で10cmのディッシュにMSC増殖培地で培養する。
2. 培地は2〜3日ごとに交換してください。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、真空ポンプを使用して細胞培養皿から培地を吸引し、5 mLのPBSで洗浄した後、真空ポンプで溶液を吸引します。
3. 1 mLの0.05%トリプシン/0.02%EDTA溶液を皿に加えます。ディッシュを37°Cで5〜10分間インキュベートします。
4. MSC増殖培地1 mLを添加して、酵素反応を停止します。細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。
5. 他のディッシュからの細胞懸濁液を50 mLチューブに入れ、氷上に保管します。
6. セルカウンターを使用して、10 μLの細胞懸濁液と10 μLの0.4%トリパンブルー染色剤を混合して細胞をカウントします。
7. 残りの細胞懸濁液を220 x g で室温で3分間遠心分離します。上清を除去し、1.0 x 10⁶ 細胞/mLの濃度で凍結保存液を添加する。
8. 細胞懸濁液1 mLを各クライオチューブに分注し、-80°Cで12時間保存してから液体窒素に移します。得られた凍結ストック(継代3)は、このプロトコルに使用されます。
9. 実験では、ストックしたMSCを10cmの皿に5 x 10³ 細胞/cm²の密度で播種します。DMEM/F-12培地中で80%〜90%のコンフルエント(継代4)まで細胞を培養します。

3. MSC内包ハイドロゲルの調製

1. 細胞をトリプシン化し、ステップ2.3〜2.6の説明に従って細胞懸濁液を調製します。
2. 10個のコンストラクト(コンストラクトあたり2.5 x 10 5細胞)を作製するには、2.5 x 10⁶個の細胞を含む細胞懸濁液を^1.5 mLのマイクロチューブに分注します。
3. 懸濁液を220 x g で3分間遠心分離し、真空ポンプで上清を除去し、氷上に保持します。
4. チオール変性ヒアルロン酸(HA)、チオール反応性架橋剤、ポリエチレングリコールジアクリレート、脱気したウォーターボトルを室温に戻します。
5. 無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、1.0 mLの脱気水をHA含有ボトル(製造元の指示を参照)に加えます。
6. 溶液が透明になるまで時々37°Cに温め、氷の上に置きます。固形物が完全に溶解するのに30分もかかりません。
7. 無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、0.5 mLの脱気水を架橋剤ボトルに加えます。数回ひっくり返して溶かし、氷の上に置きます。
8. 溶解したHA溶液120 μLを分注した細胞ペレット(2.5 x 10⁶ 細胞)に加えます。細胞ペレットをピペッティングで前後に再懸濁します。
9. 溶解した架橋剤溶液30 μLをHAと細胞の入ったチューブに加え(ステップ3.8)、チューブを軽くたたいて混ぜ合わせ、短時間スピンダウンします。HA溶液と架橋剤溶液を4:1の比率で組み合わせます。
10. MSCを含む混合溶液15 μL(2.5 x 10⁵ 細胞)をパラフィンコーティングした24ウェルプレートに滴下し、37°Cで30分間固化させます(図2)。粘度が高いため、細胞/ハイドロゲル混合物を必要量より少なくとも10%多く調製してください。
    注:ヒドロゲルの特性は、以前に説明した³⁹。

4. in vitro での分化条件

1. 0.5 mLの軟骨形成分化培地をMSC播種HAハイドロゲルのコンストラクトに添加します。培地は2〜3日ごとに交換してください。
2. 3週間後、肥大分化培地(ウェルあたり0.5 mL)に切り替え、コンストラクトをさらに2週間培養します。

5. 間葉系幹細胞の 生体内 移植

1. 合計5週間のin vitro培養の後、前述のように、構築物をヌードマウスの背中に皮下移植します^38,40。
2. マウスの体重を量り、0.75 mg / kg体重(b.w)のメデトミジン、4.0 mg / kgのb.w.ミダゾラム、および5.0 mg / kgのb.w.ブトルファノールで調製した併用麻酔薬を腹腔内注射で投与します³⁸。
3. 手術刺激に対して動かないことで適切な麻酔を確認し、ゆっくりとした規則的な胸の動きによる呼吸の深さを監視し、手術中に定期的にピンクの粘膜の色による適切な酸素供給を監視します。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医用軟膏を使用してください。
4. マウスを滅菌手術用ドレープの上に腹臥位で置き、切開部位を50ppmの次亜塩素酸水(pH 5.0;HAW)、穴あき外科用ドレープをマウスの上に置きます。
   注意: すべての手術材料をオートクレーブ、エチレンオキシドガス、またはHAWで滅菌します。外科医は指を洗い、手術用ガウンと手袋を着用する必要があります。
5. 背骨の中心線に沿って、肩と腰の部分に長さ5mmの皮膚切開を2cm間隔で2つ、ハサミで行います。
6. 切開部から皮下にヘラを挿入し、皮下ポケットを作ります。
7. 2〜3つのコンストラクト(各~15 μL、ステップ5.1)を鉗子で各ポケットに挿入します。同じポケットに埋め込まれたHAコンストラクトは、非常に頻繁に癒合する傾向があります。癒着を防ぐため、各ポケットに HA コンストラクトを 1 つずつ挿入します。
8. 4-0の編組シルク縫合糸で切開部を閉じます。³⁸に記載されているように、0.75 mg / kg b.w.アチパメゾールで調製した麻酔薬にアンタゴニストをマウスに注射します。.
9. マウスが麻酔から回復するまでの間、マウスを餌や水のボトルを使わずに滅菌床寝具を含む滅菌回復ケージに入れ、体温、脈拍、呼吸を継続的に監視します。
10. マウスが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復したら、他の動物と一緒に飼育室に戻します。
11. 治癒期間中、数日ごとに動物を監視して、合併症の可能性がないか確認してください。二酸化炭素を吸入してマウスを安楽死させるが、着床後4週間および8週間でほとんど苦痛を伴わない。
12. 移植された部位の皮膚を切開し、鉗子で移植された構造物を取り除きます。コンストラクトを4%パラホルムアルデヒドで16時間固定し、分析します。

6. 統計解析

1. 定量的データを平均±標準偏差 (SD) としてレポートします。市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
2. スチューデントの t検定または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、グループ間の有意差を判断します。p<0.05 と p<0.01 は、2 つのグループ間の有意差を示しています。

結果

MSCを内包したHAハイドロゲルを、軟骨形成の誘導因子であるTGFβ3を添加した軟骨形成培地で培養した⁴¹ (ステップ4.1)。我々は、HAの特性を、前述のように、軟骨内骨化のためのMSCベースの人工軟骨移植片の作成に有効であることが示されているコラーゲンの特性と比較した³⁸。未分化MSCは、骨形成分化(すなわち、膜内骨^{化)によって}骨を生成するためのプライミング基質として石灰化表面を必要とすることが実証されているため、この研究では未分化MSCをネガティブコントロールとして含めませんでした7。

ヒアルロン酸ハイドロゲルのサイズは、倒立顕微鏡で測定した直径から判断すると、 in vitro 培養期間を通して変化しなかったが、比較に用いたコラーゲンハイドロゲルは培養開始後すぐに収縮し始めた。 in vitro 培養後のHAコンストラクトとコラーゲンコンストラクトのサイズ差を小さくするために、HAハイドロゲルの作...

ディスカッション

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています³⁸。さらに、in vivoでは、HAコンストラクトは、同じポケットに移植された複数のコンストラクトの融合を促進し、単一の統合された骨を形成することが示されました。MSCと足場材料との相互作用は軟骨および肥大型軟骨形成に大きく影響するため、ECOに適した足場材料を選択することは、臨床的に効果的な組織改変軟骨移植片を生成するために重要です。HAハイドロゲルに埋め込まれた細胞は、中心から末梢にかけて軟骨細胞に特徴的な丸みを帯びた形態を均一に示し、ヒアルロン酸がハイドロゲル全体に均一な軟骨形成を助長する環境を提供していることを示している^21,30

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25w/v% トリプシン-1mmol/L EDTA.4Na溶液	富士フイルム和光ピュアケミカル	209-16941
アンチセダン	日本全薬工業
アスコルビン酸-2-リン酸	ナカライ テスク	13571-14
バンバンカー	GC リンフォテック	CS-02-001
塩基性線維芽細胞増殖因子	リプロセル	RCHEOT002
ウシ血清アルブミン	富士フイルム和光ピュアケミカル	012-23881	7.5 w/v%
Countess 自動セルカウンター セルカウンティングチャンバースライドとトリパンブルーステイン 0.4%	Invitrogen	C10283
デキサメタゾン	メルク	D8893
ドミトール	日本全薬工業
ドーミカム	アステラス製薬
ダルベッコ モディファイドイーグル ミディアム	メルク	D6429	高グルコース
ダルベッコ改変イーグル中/栄養混合物 F-12 ハム	メルク	D6421
ウシ胎児血清	ハイクロン	SH30396.03
硫酸ゲンタマイシン	富士フイルム和光ピュアケミカル	1676045	10 mg/mL
ハセッパー ジェネレーター	テクノマックス	CH-400-5QB	50 ppm 次亜塩素酸水
ヒト間葉系幹細胞	ロンザ	PT-2501
HyStem 細胞培養足場キット	メルク	HYS020
IL-1ß	ペプロテック	AF-200-01B
ITS-Gサプリメント	富士フイルム和光ピュアケミカル	090-06741	×100
L-アラニル-L-グルタミン	富士フイルム和光ピュアケミカル	016-21841	200mmol/L (×100)
L-プロリン	ナカライ テスク	29001-42
L-チロキシン	メルク	T1775
MSCGM 間葉系幹細胞増殖培地 BulletKit	ロンザ	PT-3001
パラフィン	富士フイルム和光ピュアケミカル	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	メディカゴ	09-2051-100
TGF-&β;3	プロテインテック	HZ-1090
ベルトールファレ	明治製菓株式会社
Visiocare 軟膏	サバベット/サヴァヘルスケア
&β;-グリセロリン酸	富士フイルム和光ピュアケミカル	048-34332