密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

Summary

本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により ヒトの糞便から濃縮した細菌の細胞外小胞(BEV)を単離・精製する方法を説明し、形態、粒子径、濃度からBEVの物理的特性を特定し、臨床研究および科学研究におけるDGCアプローチの潜在的な応用について議論します。

Abstract

細菌細胞外小胞(BEV)は、細菌由来のナノ小胞で、細菌間および細菌と宿主のコミュニケーションにおいて積極的な役割を果たし、親細菌から受け継いだタンパク質、脂質、核酸などの生理活性分子を輸送します。腸内細菌叢に由来するBEVは、消化管内で作用し、遠隔地の臓器に到達する可能性があるため、生理学や病理学に大きな影響を与えます。ヒトの糞便に由来するBEVの種類、量、役割を探る理論的研究は、腸内細菌叢からのBEVの分泌と機能を理解する上で非常に重要です。これらの調査では、BEVの分離と精製に関する現在の戦略の改善も必要になります。

この研究では、トップダウンとボトムアップの2つの密度勾配遠心分離(DGC)モードを確立することにより、BEVの分離および精製プロセスを最適化しました。BEVの濃縮分布は、フラクション6〜8(F6-F8)で決定されました。このアプローチの有効性は、粒子の形態、サイズ、濃度、およびタンパク質含有量に基づいて評価されました。粒子およびタンパク質の回収率を計算し、特定のマーカーの存在を分析して、2 つの DGC モードの回収率と純度を比較しました。その結果、トップダウン遠心分離モードの方が汚染レベルが低く、ボトムアップモードと同等の回収率と純度を達成していることが示されました。7時間の遠心分離時間は、糞便BEV濃度10⁸/mgを達成するのに十分でした。

糞便とは別に、この方法は、成分と粘度の違いに応じて適切に変更することで、他の体液タイプに適用できます。結論として、この詳細で信頼性の高いプロトコルは、BEVの標準化された分離と精製を容易にし、その後のマルチオミクス分析と機能実験の基礎を築きます。

Introduction

腸は、人体で最も豊富な微生物群集を持つ器官として広く認識されており、細菌の90%以上がコロニー形成と増殖に関与しています^1,2。腸内細菌叢は腸内微小環境を調節し、同時に主に腸管関門の障害を介して遠隔臓器の機能障害と相互作用することが広範な証拠によって実証されています^3,4。腸内細菌叢の不均衡と炎症性腸疾患(IBD)^の進行5,6、および腸^{脳軸を介した}認知障害との相関関係を示す証拠が増えています^5,6,7,8。細菌によって産生される細菌の細胞外小胞(BEV)は、これらの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。

BEVは、直径20〜400nmの細菌誘導体をカプセル化するナノスケールの粒子です。それらは、バクテリアとその宿主生物との間の相互作用を促進することが実証されています....

Protocol

南方医科大学南方病院の倫理委員会は、参加者のインフォームドコンセントに基づいて実施されたこの研究を承認しました。ここで採用されているすべての方法は、ヒトマイクロバイオーム国際基準(IHMS:http://www.microbiome-standards.org/)によって提供される標準的な運用ガイドラインに準拠しています。その後のすべてのリキッドハンドリング手順は、バイオセーフティキャビネットまたは超クリーンベンチ内で実施することが義務付けられました。

1. 糞便検体の採取と分注

1. 便サンプラー、密封された袋、アイスボックスを配布し、サンプルの調達方法と保存方法について参加者に包括的な指示を提供します。
2. 各参加者に、提供されたサンプラーを使用して糞便サンプルを収集し、24 時間以内に 4 °C の温度でラボに輸送するように指示します。
3. ラボで受け取ったら、滅菌スプーンを使用して、事前に計量した50 mL遠心チューブに3.5 g未満の糞便を分注します。その後の前処理手順のために、チューブに糞便サンプルの重量を記録します。
   一時停止ポイント:サンプルの即時処理が不可能な場合は、適切な表記の後、サンプルを-80°Cで長期保存するために割り当てます。

2. 糞便サンプル調製

....

Results

BEV富化画分の分布の決定
細菌の細胞外小胞(BEV)濃縮画分の分布を決定するために、外径 340 nm での吸光度値を測定するためのブランクコントロールを確立し、測定値とヨウジキサノールガイドラインに基づいて各画分の密度を計算しました(ステップ 8.1)。 表2 は密度の結果を示しており、フラクションF4〜F9が細胞外小胞に典型的に関連する範囲内の密度を示したことを示している。この発見は、BEVの大部分がこれらのフラクションで分離されていることを示唆しており、F4-F9をBEVの大まかな範囲として定義することにつながりました。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、 図1 に示すようにフラクションF4-F9で単離された糞便BEVの形態学的特徴を特徴付けました。TEM画像(図2)からは、BEVの特徴である古典的なカップ状の構造が見られました。ナノ粒子追跡分析(NTA)とビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実施して、それぞれ粒子数とタンパク質濃度を決定し.......

Discussion

細菌の細胞外小胞(BEV)は、細菌から分泌される脂質二重層ナノ粒子であり、タンパク質、脂質、核酸、その他の生理活性分子を豊富に含み、細菌の機能的効果の媒介に寄与する²⁰。腸に由来するBEVは、炎症性腸疾患、クローン病、大腸がんなどの疾患の発症に関与し、一般的な代謝に影響を与え、認知機能障害を媒介することが確認されています4,16,17,20,21,22,23,24,25,26

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (w/v) グルタルアルデヒド (脱イオン水中の 2.5 % ストック溶液から調製)	ACMEC	AP1126	ステップ 8.3.3 で TEM を使用した BEV の形態学的観察
1 % (w/v) メチルセルロース (脱イオン水中の元の粉末から調製)	Sigma-Aldrich	M7027	ステップ 8.3.6 で TEM を使用した BEV の形態学的観察
1.5 % (w/v) 酢酸ウラニル (脱イオン水中の元の粉末から調製)	Polysciences	21447-25	TEMを用いたBEVの形態学的観察 at Step 8.3.5
1000 μL、200 μL、10 μL ピペット	KIRGEN	KG1313、KG1212、KG1011	溶液
5% (w/v) ウシ血清アルブミン溶液 (TBST バッファーの元の粉末から調製)	Fdbio 科学	FD0030	ステップ8.5.6
5 × ローディングバッファー	Fdbio 科学	FD006	でウェスタンブロッティングと Coomassie ブリリアントブルーステインで使用
	LIRCON	LIRCON-500 mL	表面消毒
96ウェルプレート	Rar	A8096	吸光度値の測定
抗カルネキシン抗体	Abcam	ab92573	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗CD63抗体	アブカム	ab134045	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗CD9抗体	アブカム	ab236630	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗フラジェリン抗体	Sino Biological	40067-MM06	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗インテグリンβ 1抗体	アブカム	ab30394	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗LPS抗体	サーモフィッシャー	MA1-83152	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗LTA抗体	サーモフィッシャー	MA1-7402	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗オンパ抗体	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	ウエスタンブロッティング (一次抗体)
抗シンテニン抗体		アブカム ab133267	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗TSG101抗体	アブカム	ab125011	ウェスタンブロッティング (一次抗体)
オートクレーブ	ZEALWAY	GR110DP	実験で使用した消耗品および培地の滅菌
バランス	メトラー・トレド	AL104	を充填したチューブサンプルのバランス&
nbsp;	Fdbio	FD2001	ステップ8.2でBEVのタンパク質含有量を測定する
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	図1に示されているBEVの分離と精製の概略的なワークフローを作成します
バイオセーフティキャビネット	ハイアール	HR1200-II B2	糞便サンプルの取り扱いに関する手順を実行します
遠心分離機5810 R;ローター F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, アダプター: 5804774000	BEVの前処理 (ステップ 3)
化学発光装置	BIO-OI	OI600SE-MF	ステップ8.5.12でのシグナル検出にウェスタンブロッティングに使用
Cytation 5	BioTek	F01	吸光度(ステップ8.1)と蛍光(図6)の値を測定するためのマイクロプレート検出器
Dil-labeled Low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	干渉成分の分布の定義
電気泳動装置	バイオ・ラッド	1658033	ステップ8.5.2、8.5.3、8.5.5でタンパク質の分離と転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます
化学発光キットHRP	Fdbio science	FD8020	ステップ8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	ポジティブコントロールとしてBEVを分離します。プロトコル:LB粉末25gを1Lの脱イオン水とオートクレーブに溶解します。800 μ を転送します。培地に保存された大腸菌のL。37°Cで耕作します。インキュベーターシェーカーのC。次に、3, 000 ×で遠心分離します。g 4 ° で 20 分間。C、12、000 ×g 4 °C で 30 分間。C、上清を0.22&muでフィルタリングします。mの膜、および160、000 ×で超高速遠心分離を行います。大腸菌由来の粗BEVと定義されるペレットを1.2mLのPBSに懸濁した(ステップ3、4)。
FALCON tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Step 8.3 HEPES
powder	Meilunbio	MB6078	密度勾配遠心分離のための異なる濃度のヨジオキサノール緩衝液の調製
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbioscience	FDR007	ウェスタンブロッティング(二次抗体)
インキュベータ	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
キムワイプ&トレード;デリケートなタスクワイプ	Kimtech Science	34155	ステップ4.15で超遠心チューブの内壁を拭
LBブロス	Hopebio	HB0128	腸菌を栽培する
低温冷凍庫(-80°C;C)	ハイアール	DW-86L338J	を保管
メタノール	アラルディン	M116118	ステップ8.5.5でPVDF膜を活性化するためのウェスタンブロッティングで使用されます
マイクロチューブ 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	密度勾配遠心分離後に画分を回復
マイクロチューブ 2 mL	KIRGEN	KG2911	密度勾配遠心分離後に画分を回復
チューブ 5 mL	BBI	F610888-0001	密度勾配遠心分離後のフラクション回収
マイクロプレートリーダー	サーモフィッシャー	Multiskan MK3	ステップ8.2
Milliporeフィルター0.22 μm	メルクミリポア	SLGP033RB	ろ過滅菌;材料:ポリエーテルスルホン、PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	勾配遠心分離液
NaOH	GHTECH	1.01394.068	密度勾配遠心分離液(pH調整)
Optima™XPN-100	ベックマン・コールター	A94469	でのBEV分離用超遠心分離
;	Serumwerk Bernburg AG	1893	密度勾配遠心分離原液
オービタルシェーカー	Youning	CS-100	ステップ2で糞便を溶解
リン酸緩衝生理食塩水	プロセル	PB180327	ステップ2で糞便を溶解
ピペッター	ッペンドルフ	3120000267、3120000259	溶液を移送
プラスチックパスツールピペット	ABCbio	ABC217003-4	3.4で前処理で上清を除去し
ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜	ミリポア	ISEQ00010、IPVH00010	ステップ8.5.5でタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます
プレハブポリアクリルアミドゲル、4–20% 15ウェル	ACE	F15420ゲル	ステップ8.5.2、8.5.3でのタンパク質分離のためのウェスタンブロッティングに使用
一次抗体希釈液	Fdbio science	FD0040	ステップ8.5.8でウェスタンブロッティングに使用
タンパク質ラダー	Fdbio science	FD0672	ステップ8.5でウェスタンブロッティングとクーマシーブリリアントブルー染色に使用
ラピッドプロテインブロッティング溶液	UBIO	UW0500	ステップ8.5.5でのタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	ステップ4でのBEV単離のための超遠心分離、7
シリンジ 20 mL、50 mL	Jetway	ZSQ-20ML、YCXWJZSQ-50 mL	TBS粉末の前処理で上清を除去する転写バッファー
	Fdbio science	FD1021	ステップ8.5でウェスタンブロッティングに使用
透過型電子顕微鏡(TEM)	日立製作所	H-7650	ステップ8.3でのBEVの形態学的観察
Tween-20	Fdbio science	FD0020	ステップ8.5でのウェスタンブロッティングに使用
超遠心チューブ	ベックマン	326823、ステップ	4、7でのBEVの分離のための355642超遠心分離
ウルトラクリーンベンチ	エアテック	SW-CJ-2FD	液体の取り扱いに関する手順を実行する
ウォーターバス	ブルーパード	CU600	ステップ 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734、ソフトウェア ZetaView (バージョン 8.05.14 SP7)	で BEV の粒子サイズと濃度を測定するための BEV のタンパク質