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方法論記事

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

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DOI：

10.3791/65574

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2023年9月1日

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1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により ヒトの糞便から濃縮した細菌の細胞外小胞(BEV)を単離・精製する方法を説明し、形態、粒子径、濃度からBEVの物理的特性を特定し、臨床研究および科学研究におけるDGCアプローチの潜在的な応用について議論します。

要約

細菌細胞外小胞(BEV)は、細菌由来のナノ小胞で、細菌間および細菌と宿主のコミュニケーションにおいて積極的な役割を果たし、親細菌から受け継いだタンパク質、脂質、核酸などの生理活性分子を輸送します。腸内細菌叢に由来するBEVは、消化管内で作用し、遠隔地の臓器に到達する可能性があるため、生理学や病理学に大きな影響を与えます。ヒトの糞便に由来するBEVの種類、量、役割を探る理論的研究は、腸内細菌叢からのBEVの分泌と機能を理解する上で非常に重要です。これらの調査では、BEVの分離と精製に関する現在の戦略の改善も必要になります。

この研究では、トップダウンとボトムアップの2つの密度勾配遠心分離(DGC)モードを確立することにより、BEVの分離および精製プロセスを最適化しました。BEVの濃縮分布は、フラクション6〜8(F6-F8)で決定されました。このアプローチの有効性は、粒子の形態、サイズ、濃度、およびタンパク質含有量に基づいて評価されました。粒子およびタンパク質の回収率を計算し、特定のマーカーの存在を分析して、2 つの DGC モードの回収率と純度を比較しました。その結果、トップダウン遠心分離モードの方が汚染レベルが低く、ボトムアップモードと同等の回収率と純度を達成していることが示されました。7時間の遠心分離時間は、糞便BEV濃度108/mgを達成するのに十分でした。

糞便とは別に、この方法は、成分と粘度の違いに応じて適切に変更することで、他の体液タイプに適用できます。結論として、この詳細で信頼性の高いプロトコルは、BEVの標準化された分離と精製を容易にし、その後のマルチオミクス分析と機能実験の基礎を築きます。

概要

腸は、人体で最も豊富な微生物群集を持つ器官として広く認識されており、細菌の90%以上がコロニー形成と増殖に関与しています1,2。腸内細菌叢は腸内微小環境を調節し、同時に主に腸管関門の障害を介して遠隔臓器の機能障害と相互作用することが広範な証拠によって実証されています3,4。腸内細菌叢の不均衡と炎症性腸疾患(IBD)の進行5,6、および腸脳軸を介した認知障害との相関関係を示す証拠が増えています5,6,7,8。細菌によって産生される細菌の細胞外小胞(BEV)は、これらの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。

BEVは、直径20〜400nmの細菌誘導体をカプセル化するナノスケールの粒子です。それらは、バクテリアとその宿主生物との間の相互作用を促進することが実証されています9,10。これらの粒子は目に見えないにもかかわらず、診断バイオマーカー、治療標的、薬物送達媒体として幅広い用途が期待されているため、研究者からの注目が高まっています11。主に腸内細菌を原料とするヒトの糞便は、BEV研究の生体試料としてよく使用され、水、細菌、脂質、タンパク質、未消化の食物残渣、剥離した上皮細胞などが複雑に混ざり合っています。複雑な糞便組成は、BEVの分離と純度に課題をもたらし、BEVの包括的、客観的、かつ現実的な分析を妨げています。したがって、汚染されたコンポーネントからの干渉を最小限に抑え、BEVの歩留まりを向上させるための効果的な戦略が、早急な対応を必要とする重要な問題として浮上しています。

既存の単離戦略は、超高速遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの技術に大きく依存しています12,13,14,15,16,17。現在、DGCはBEV分離の分野で最も広く適用されている方法の1つであり、サンプルの初期ローディング位置によって決定される「トップダウン」と「ボトムアップ」の2つの沈降フローティングモードを包含しています。これらの方法論は、サイズと密度の格差に基づいて細胞外小胞(EV)を他の成分と区別し、さまざまな純度と回収率を生み出します。これまでの研究では、血液中のリポタンパク質18や尿中のTamm-Horsfallタンパク質19など、体液サンプル中の可溶性タンパク質からEVを適切に分離するには、シングルアプローチ戦略では不十分であることが示されています。さらに、真核生物の細胞外小胞(EEV)のサイズ分布はBEVのサイズ分布と重複することが多いため、BEVの収量を最適化するには、さらなる方法論的強化が必要です。したがって、BEVの研究を進めるには、効果的な分離および精製方法の開発にかかっています。特に、Tulkens et al 15 は、糞便 BEV を EEV から分離するために直交生物物理学的戦略を採用しており、ボトムアップ DGC モードの遠心分離時間は最大18 時間でした。対照的に、この試験では 7 時間に短縮され、グラジエント超遠心分離時間が大幅に短縮され、プロセスが簡素化されました。

本研究では、低速から超高速まで、さまざまな異なる遠心分離速度でBEVを濃縮した後、最適化された緩衝条件下で、2つのDGCモードを用いて糞便BEVを分離および精製しました。形態、粒子径、および濃度に基づく評価は、この強化された分析法による称賛に値する性能を示しました。この研究は、将来の研究の基盤となり、その応用範囲をより広い領域に拡大し、人体におけるBEVの不均一性に関する洞察を提供する可能性があります。また、BEVの分離・分析技術の標準化にも貢献します。

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プロトコル

南方医科大学南方病院の倫理委員会は、参加者のインフォームドコンセントに基づいて実施されたこの研究を承認しました。ここで採用されているすべての方法は、ヒトマイクロバイオーム国際基準(IHMS:http://www.microbiome-standards.org/)によって提供される標準的な運用ガイドラインに準拠しています。その後のすべてのリキッドハンドリング手順は、バイオセーフティキャビネットまたは超クリーンベンチ内で実施することが義務付けられました。

1. 糞便検体の採取と分注

  1. 便サンプラー、密封された袋、アイスボックスを配布し、サンプルの調達方法と保存方法について参加者に包括的な指示を提供します。
  2. 各参加者に、提供されたサンプラーを使用して糞便サンプルを収集し、24 時間以内に 4 °C の温度でラボに輸送するように指示します。
  3. ラボで受け取ったら、滅菌スプーンを使用して、事前に計量した50 mL遠心チューブに3.5 g未満の糞便を分注します。その後の前処理手順のために、チューブに糞便サンプルの重量を記録します。
    一時停止ポイント:サンプルの即時処理が不可能な場合は、適切な表記の後、サンプルを-80°Cで長期保存するために割り当てます。

2. 糞便サンプル調製

  1. 500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を4°Cで冷却します。 50 mLシリンジを使用して、0.22 μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターで事前に冷却したPBSを10本の50 mL遠心分離チューブにろ過します。
  2. それぞれ3.5gの糞便サンプルを入れた2本の50 mLチューブを氷上に配置します。各チューブに35 mLのPBSを加えます。
    注:糞便の溶解に必要なPBSの量を計算し、最大サンプル濃度が10%(w / v)になるようにします。追加のサンプルを処理する場合は、必要に応じてより多くのチューブを使用します。
  3. サンプルを300rpmで4°Cで2時間振とうするか、糞便が完全に目に見える形で浮遊するまで少なくとも4°Cで8時間置きます。

3. 差動速度遠心分離

  1. 高速冷蔵遠心分離機を4°Cに冷却します。
  2. ステップ2.3で調製したサンプルを含む2本のチューブの重量をPBSで調整し、合計重量が0.1gになるようにします。
  3. サンプルを3, 000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
  4. 上清を2本の清潔な50 mL遠心チューブに慎重にピペットで移し、ペレットの上に約1 mLを残します。このプロセスには、使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを使用してください。
  5. PBSで2本のチューブの重量を調整し、合計重量が0.1g±以内になるようにします。
  6. 移した上清を12, 000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
  7. 20 mLのシリンジを使用して上清を吸引し、シリンジニードルを取り外し、0.22 μmのフィルターで50 mLのチューブにろ過します。この時点で、上清の量は約30mLである必要があります。
    注:12,000 × g の遠心分離後もかなりの量の不純物が見られる場合は、12,000 × g で4°Cで30分間遠心分離ステップを繰り返す必要があります。 これを怠ると、ろ過中の細孔の詰まりにより、BEVが大幅に失われる可能性があります。

4. 超高速遠心分離

  1. ローターとバケットを75%(v / v)アルコールで拭いて清掃し、残留汚染を取り除きます。
  2. 38.5 mLの超遠心チューブをチューブホルダーに入れます。
    注:サンプル量に基づいて適切な超遠心チューブを選択してください。製品マニュアルに示されているように、遠心チューブの滅菌に紫外線や不適切な化学試薬は避けてください。
  3. ステップ3.7でろ過した糞便上清約30 mLを超遠心チューブに移します。
  4. 超遠心チューブに約8 mLのPBSを充填し、チューブの開口部から3 mmの隙間を残します。
  5. サンプルの入った2本の超遠心チューブを対向する超遠心分離バケットに入れます(例えば、バケット1は4(1-4)、2-5、3-6に対応します。
  6. PBSで2つのバケットの重量を調整し、合計重量が±0.005g以内になるようにします。
  7. チューブがロードされているかどうかに関係なく、すべてのバケットをローターに取り付けます。
  8. 真空を開始し、サンプルを160,000 × g で4°Cで70分間遠心分離します。
  9. チャンバーの掃除機を解除し、機器のホームページに「準備完了」と表示されたらドアを開けます。
  10. ローターを超遠心分離機から取り外します。
  11. バケットをローターからラックに移動し、ニッパーを使用してチューブを回収します。
  12. 底に目に見える茶色のペレットを含む上澄みを捨てます。
  13. 1,000 μLのピペットと1 mLのプレチル(4°C)PBSを使用して、完全に懸濁するまで繰り返しピペッティングして、ペレットを再懸濁します。チューブに約37 mLのPBSを充填し、開口部から3 mmの隙間を残します。
  14. ステップ4.5-4.11に従って、160,000 × g 、4°Cで70分間、別の超遠心分離を行い、部分的に付着した汚染成分をチューブ壁から除去します。
  15. 上清を廃棄し、2本の超遠心チューブを5分間反転させ、内壁に残っている溶液をワイパーで取り除きます。
    注意: 内壁を清掃すると、超遠心チューブの壁に付着した残留汚染による干渉が最小限に抑えられます。特に粒子径に関して、BEV分析に影響を与えないワイパーを選択してください。
  16. 1,000 μLのピペットを使用して、1.2 mLの冷やした(4°C)PBSでピペッティングして、各チューブ内のペレットを再懸濁します。
  17. 1.2 mL の PBS/BEV 溶液を 1 本の超遠心チューブから清潔な 1.5 mL マイクロチューブに移します。
    一時停止ポイント:1本の超遠心チューブから回収したPBS/BEV溶液は、ステップ6に進むことができます。他のチューブからの溶液を-80°Cで保存します。

5. 密度勾配遠心分離のための溶液調製

  1. 0.02 M HEPES緩衝液の調製
    1. 0.477 gのHEPES粉末と0.8 gのNaClを90 mLのオートクレーブ滅菌水と組み合わせます。
    2. 1 M 水酸化ナトリウム(NaOH)を添加して pH を 7.2 に調整します。脱イオン水で容量を100 mLにし、0.22 μmのPESメンブレンで溶液をろ過します。
      注意: 水酸化ナトリウムは強苛性アルカリです。オペレーターは、ヒュームキャビネットで慎重に取り扱い、準備する必要があります。
  2. 密度勾配緩衝液の調製
    1. 密度勾配遠心分離用の超遠心チューブの数に基づいて、各密度勾配バッファーの必要容量を計算します(このプロトコルでは、60%、50%、40%、20%、および10%グラジエント溶液の容量は、それぞれ2.5 mL、3 mL、6 mL、6 mL、および6 mLでした)。
    2. 50%(w/v)のイオジキサノールワーキング溶液を調製するには、0.02 M HEPESバッファーと60%(w/v)のヨジキサノールストック溶液を1:5(0.5 mL:2.5 mL)の体積比で混合します。
      注:使い捨ての20 mLシリンジを使用して、イオジキサノールストック溶液を回収し、空気が入らないようにします。
    3. 異なる濃度のヨウジキサノール緩衝液を調製するには、ステップ5.2.2の50%イオジキサノールワーキング溶液とステップ5.1で得られたHEPES緩衝液を、 表1に示す割合に従って1,000 μLのピペットで混合します。
      注意: 手順5は、ライトを消した超クリーンベンチで実行してください。開封したヨウジキサノール原液は、細菌の繁殖を防ぐため、4°Cの冷蔵庫で保存してください。ヨウジキサノール溶液とHEPES緩衝液を光から保護してください。

6. 密度勾配遠心分離システムの確立

  1. トップダウンDGCモード
    1. ステップ 4 で単離した 500 μL の PBS/BEV 溶液を 3 mL の PBS と混ぜ合わせます。1,000 μL のピペットを使用して溶液を穏やかに混合し、3.5 mL の PBS/BEV 溶液を得ます。
    2. 穴の開いた発泡スチロールプレートに31mLの超遠心チューブを置き、「↓」とラベルを付けます。
    3. 1,000 μLのピペットを使用して、50%イオジキサノール溶液3 mLをチューブの底部に垂直に加えます。
    4. チューブを70°の角度に傾け、チューブホルダーまたはその他のサポートをフォームプレートのレベルより少し上、チューブの開口部の下に配置します。
    5. 1,000 μLのピペットを使用して、50%イオジキサノール溶液の上に3 mLの40%イオジキサノール溶液を加えます。
    6. 1,000 μLのピペットを使用して、40%ヨジキサノール溶液の上に3 mLの20%ヨジキサノール溶液を加えます。
    7. 1,000 μL のピペットを使用して、20% イオジキサノール溶液の上に 3 mL の 10% イオジキサノール溶液を加えます。
    8. 1,000 μLのピペットを使用して、10%ヨジキサノール溶液の上にステップ6.1.1のPBS/BEV溶液3.5 mLを加えます。
    9. チューブをそっと直立位置に戻します。
      注:ピペッティング後、成層化が見えるはずです。
  2. ボトムアップDGCモード
    1. 穴の開いた発泡スチロールプレートに31 mLの超遠心チューブを置き、「↑」とラベルを付けます。
    2. 2.5 mL の 60% イオジキサノール原液をチューブの底に垂直に加えます。1,000 μLのピペットを使用して、ステップ4で単離した500 μLのPBS/BEV溶液と穏やかに混合し、3 mLの50%ヨジキサノール/BEV溶液を得ます。
    3. チューブを70°の角度に傾け、チューブホルダーまたはその他のサポートをフォームプレートのレベルより少し上、チューブの開口部の下に配置します。
    4. 1,000 μL のピペットを使用して、50% iodixanol/BEV 溶液の上に 40% iodixanol 溶液 3 mL を加えます。
    5. 1000 μLのピペットを使用して、40%イオジキサノール溶液の上に20%イオジキサノール溶液3 mLを加えます。
    6. 1000 μLのピペットを使用して、20%イオジキサノール溶液の上に10%イオジキサノール溶液3 mLを加えます。
    7. 1,000 μLのピペットを使用して、10%イオジキサノール溶液の上に3.5 mLのPBSを加えます。
    8. チューブをそっと直立位置に戻します。
    9. この時点で、ステップ4.17で得られた懸濁液の200μLが残存しており、これは、後に「UC」と名付けられた基として分析することができる。
      注:ステップ6で溶液を移すときは、必ずピペットチップを超遠心チューブの壁に当ててチューブの軸に垂直にしてください。

7. 密度勾配遠心分離とフラクション回収

  1. PBSで2本のチューブの重量を調整し、総重量が0.005g以内±ようにします。
  2. ステップ4.5に従ってチューブをバケットに入れ、160,000 × g で4°Cで7時間遠心分離します。
  3. ピペッター(1000 μL)を使用して、側壁に上から下へ、3 mL、2 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1.5 mL、3 mLの順にフラクションを38.5 mLの超遠心チューブに回収します。
    注意: 視線を液面と同じ高さに維持してください。
  4. ステップ7.3で得られた各画分について、ステップ4に従って、160,000 × g で4°Cで70分間超遠心分離を行います。
  5. 上澄み液を取り除き、超遠心チューブを5分間反転させます。
  6. 200 μLのピペットを使用して、200 μLのプレチル(4°C)PBSにペレットを再懸濁します。
  7. PBS/BEV溶液を清潔な1.5 mLマイクロチューブに移します。
  8. F1からF10までの分数にラベルを付け、ステップ8に基づいて分析します。
    一時停止ポイント:ステップ7.8で得られたサンプルをすぐに処理できない場合は、-80°Cで保存してください。

8. 回収した画分の特性評価と定量分析

  1. ブランクコントロールを備えたマイクロプレート検出器を使用して、各フラクションの吸光度値(OD 340 nm)を決定し、対応する密度を計算します。
    注意: PBS / BEV溶液(ステップ6.1.1およびステップ6.2.2)をPBSに置き換えて、ブランクコントロールを確立します。
    1. 0%、5%、10%、12.5%、および20%のヨジキサノール溶液を、それぞれ1.0058 g/mL、1.0318 g/mL、1.058 g/mL、1.0708 g/mL、および1.111 g/mLの密度に対応する0.02 M HEPESで希釈した各100 μLを調製します(ステップ5.2.2)。
    2. ブランクコントロール(ステップ 7.3 で調製)から得られた各フラクション 50 μL と、各標準溶液(ステップ 8.1.1 で調製)から 50 μL を 96 ウェルプレートの複製ウェルに加えます。
    3. 波長を 340 nm に設定し、端点の光学濃度を測定し、各フラクションの密度を計算します。
    4. F4-F9 を、その密度に基づく BEV フラクションの範囲として特定します。
  2. ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を用いてBEV画分のタンパク質濃度を測定します。
    1. メーカー提供のPBSで10倍に希釈し、0.5 μg/μLの標準タンパク質溶液を調製する。
    2. 試薬の指示に従って、標準タンパク質溶液(ステップ8.2.1で調製)をさまざまな容量で添加し、96ウェルプレートの各ウェルにPBSを添加して合計容量20 μLにします。
    3. ステップ7.8で調製したサンプル20 μLと、ステップ6.2.9で定義したUC後に残ったサンプルを各ウェルに加えます。
    4. 試薬AとBを50:1の比率で混合し、各ウェルに200μLを移します。
    5. プレートを37°Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。
    6. マイクロプレートリーダーを用いて吸光度値を測定し、タンパク質濃度(μg/μL)を算出し、ステップ8.2.2で希釈した標準液の値から得られた検量線(x:光学濃度、y:タンパク質濃度)からサンプルのタンパク質含量(μg)を求めます。
  3. 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてステップ8.1.4で定義したBEVフラクションを特性評価し、BEVの存在を確認します。以下のすべての手順は氷上で実行する必要があります。
    1. ステップ 7.8 で単離した各 F4-F9 フラクション 10 μL と、ステップ 6.2.9 で定義した UC の後に残したサンプルを Formvar/Carbon 担持銅グリッドに 20 分間塗布し、ろ紙でブロットします。
    2. サンプルを100μLのPBSで1分間ずつ3回洗浄し、ろ紙でブロットします。
    3. サンプルを1%(w/v)グルタルアルデヒド100 μLで5分間固定し、ろ紙でブロットします。
    4. 100 μL の PBS でグリッドを 2 分間ずつ 10 回洗浄し、ろ紙でブロットします。
    5. グリッドを 50 μL の 1.5% (w/v) 酢酸ウラニルで 10 分間染色し、ろ紙でブロットします。
      注意: 酢酸ウラニルは放射性であり、皮膚に接触したり吸入したりすると非常に有毒です。酢酸ウラニルを含む溶液をヒュームキャビネットで取り扱い、適切な安全対策に従ってください。
    6. グリッドを1%(w/v)メチルセルロース滴に5分間移し、ろ紙でブロットします。
    7. 風乾したグリッドは、観察するまで暗くほこりのない環境で保管してください。
    8. TEMを使用して画像を取得し、分析します。
  4. ステップ8.1.4で定義したBEV画分をナノ粒子トラッキング分析(NTA)を用いて特性評価し、粒子数をカウントします。
    1. 110 nm のポリスチレン粒子を使用してシステムをキャリブレーションします。
    2. PBSを使用してサンプルプールを洗浄します。
    3. ステップ7.8で取得したさまざまなフラクションのサンプルと、ステップ6.2.9で定義したUCの後に残ったサンプルを、105-10 9 粒子/mLの範囲の濃度に希釈し、最適化濃度は107 粒子/mLにします。
    4. 温度を23〜30°C前後に維持しながら、3回の複製で11か所で記録および分析します。
  5. サンプルのタンパク質含有量をクマシーブリリアントブルー染色(CBBS)およびウェスタンブロッティング(WB)で分析します。
    1. 定量が必要な場合は、ステップ 7.8 で得られたさまざまなフラクションの BEV サンプルと、ステップ 6.2.9 で定義した UC の後に残ったサンプルを、PBS と 5 ×ローディングバッファーを使用して最終濃度 0.5 または 1 μg/μL に希釈し、ステップ 8.5.2 で各ウェルに 20 μL(10 μg または 20 μg)の十分なサンプルローディングを確保します。サンプルを95°Cで10分間煮沸します。
    2. プレハブのポリアクリルアミドゲルを電気泳動タンクに組み立て、サンプルをウェルに移します。
    3. 以下のパラメータで垂直電気泳動を実施します:160 V で 50 分間。
    4. ゲルをクマシーブリリアントブルー溶液で1時間染色し、青色の背景が明るくなるまで脱イオン水ですすぎ、カメラで画像を撮影します。
    5. 以下のパラメーターで他のゲルのタンパク質ブロッティング手順を実行します:400 mA で 20 分間。
    6. ブロッティングメンブレンを5%(w/v)BSA溶液で室温で1時間ブロッキングします。
    7. メンブレンをTBSTバッファーで3回、それぞれ5分間洗浄します。
    8. メンブレンを一次抗体(BEVマーカー:LPS、OmpA、LTA;EEVマーカー:CD63、CD9、TSG-101、シンテニン、インテグリンβ1;その他の汚染マーカー:フラジェリン、カルネキシン)を4°Cで8〜12時間。
    9. メンブレンをTBSTバッファーで3回、それぞれ10分間洗浄します。
    10. メンブレンを二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。
    11. 手順8.5.9を実行します。
    12. 化学発光装置を用いてブロッティングを現像する。
    13. PBS/BEV溶液(ステップ6.1.1およびステップ6.2.2)を大腸菌由来のBEVに置き換えてポジティブコントロールを確立し(粗大腸菌BEVの単離手順については資料表を参照)、BEVの特性評価のために上記のすべての実験を実施します。
      一時停止ポイント:糞便BEVの上記の特性評価の結果に基づいて、F6-F8をBEVに富む画分の分布として決定し、この狭くなった範囲をその後の分析に利用します。
  6. 粒子とタンパク質の回収率を計算して、2 つの DGC モードの効率を評価します。以下の結果はパーセンテージで表示されます。
    1. トップダウンモードでの粒子の回収率を計算します:F6-F8の総粒子数/ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子。
    2. ボトムアップモードでの粒子の回収率を計算します:F6-F8の総粒子数/ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子。
    3. トップダウンモードでのタンパク質の回収率を計算します:F6-F8の総タンパク質含有量(μg)/ステップ6.2.9で定義されたUC後のタンパク質含有量(μg)。
    4. ボトムアップモードでのタンパク質の回収率を計算します:F6-F8の総タンパク質含有量(μg)/ステップ6.2.9で定義されたUC後のタンパク質含有量(μg)。
  7. 粒子/タンパク質比を計算して、UC と 2 つの DGC モードで従来定義されていた純度を評価し、以下の結果はすべてパーセンテージで表示しました。
    1. ステップ6.2.9で定義したUC後の粒子/タンパク質比:UC後の粒子/UC後のタンパク質含有量(μg)。
    2. トップダウンモードでの粒子/タンパク質比:F6-F8の総粒子数/F6-F8のタンパク質含有量(μg)。
    3. ボトムアップモードでの粒子/タンパク質比:F6-F8の総粒子数/F6-F8のタンパク質含有量(μg)。
  8. 糞便BEVの精製と将来の分析に最も適した遠心分離モード(プロトコルではトップダウンモードを選択)を選択します。

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結果

BEV富化画分の分布の決定
細菌の細胞外小胞(BEV)濃縮画分の分布を決定するために、外径 340 nm での吸光度値を測定するためのブランクコントロールを確立し、測定値とヨウジキサノールガイドラインに基づいて各画分の密度を計算しました(ステップ 8.1)。 表2 は密度の結果を示しており、フラクションF4〜F9が細胞外小胞に典型的に関連する範囲内の密度を示したことを示している。この発見は、BEVの大部分がこれらのフラクションで分離されていることを示唆しており、F4-F9をBEVの大まかな範囲として定義することにつながりました。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、 図1 に示すようにフラクションF4-F9で単離された糞便BEVの形態学的特徴を特徴付けました。TEM画像(図2)からは、BEVの特徴である古典的なカップ状の構造が見られました。ナノ粒子追跡分析(NTA)とビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実施して、それぞれ粒子数とタンパク質濃度を決定し...

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ディスカッション

細菌の細胞外小胞(BEV)は、細菌から分泌される脂質二重層ナノ粒子であり、タンパク質、脂質、核酸、その他の生理活性分子を豊富に含み、細菌の機能的効果の媒介に寄与する20。腸に由来するBEVは、炎症性腸疾患、クローン病、大腸がんなどの疾患の発症に関与し、一般的な代謝に影響を与え、認知機能障害を媒介することが確認されています4,16,17,20,21,22,23,24,25,26

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開示事項

著者は、相反する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

この研究は 、中国国家自然科学基金(82230080)の主要プロジェクトであるNational Science Fund for Distinguished Young Scholars(82025024)の支援を受けました。中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFA1300604);中国国家自然科学基金会(81871735、82272438、82002245)広東省著名な若手学者のための広東省自然科学基金(2023B1515020058); 広東省自然科学財団(2021A1515011639); 中国山東省自然科学基金会の主要国家基礎研究開発プログラム(ZR2020ZD11) ポスドク科学財団(2022M720059);南方医科大学南方病院の優れた青少年育成スキーム(2022J001)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 % (w/v) グルタルアルデヒド (脱イオン水中の 2.5 % ストック溶液から調製)ACMECAP1126ステップ 8.3.3 で TEM を使用した BEV の形態学的観察
1 % (w/v) メチルセルロース (脱イオン水中の元の粉末から調製)Sigma-AldrichM7027ステップ 8.3.6 で TEM を使用した BEV の形態学的観察
1.5 % (w/v) 酢酸ウラニル (脱イオン水中の元の粉末から調製)Polysciences21447-25TEMを用いたBEVの形態学的観察 at Step 8.3.5
1000 μL、200 μL、10 μL ピペットKIRGENKG1313、KG1212、KG1011溶液
5% (w/v) ウシ血清アルブミン溶液 (TBST バッファーの元の粉末から調製)Fdbio 科学FD0030ステップ8.5.6
5 × ローディングバッファーFdbio 科学FD006でウェスタンブロッティングと Coomassie ブリリアントブルーステインで使用
LIRCONLIRCON-500 mL表面消毒
96ウェルプレートRarA8096吸光度値の測定 
抗カルネキシン抗体Abcamab92573ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗CD63抗体アブカムab134045ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗CD9抗体アブカムab236630ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗フラジェリン抗体Sino Biological40067-MM06ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗インテグリンβ 1抗体アブカムab30394ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗LPS抗体サーモフィッシャーMA1-83152ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗LTA抗体サーモフィッシャー MA1-7402ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗オンパ抗体CUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ウエスタンブロッティング (一次抗体)
抗シンテニン抗体アブカム ab133267ウェスタンブロッティング (一次抗体)
抗TSG101抗体アブカムab125011ウェスタンブロッティング (一次抗体)
オートクレーブZEALWAYGR110DP実験で使用した消耗品および培地の滅菌
バランスメトラー・トレドAL104を充填したチューブサンプルのバランス&
nbsp;FdbioFD2001ステップ8.2でBEVのタンパク質含有量を測定する
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.com図1に示されているBEVの分離と精製の概略的なワークフローを作成します
バイオセーフティキャビネットハイアールHR1200-II B2糞便サンプルの取り扱いに関する手順を実行します
遠心分離機5810 R;ローター F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, アダプター: 5804774000BEVの前処理 (ステップ 3)
化学発光装置BIO-OIOI600SE-MFステップ8.5.12でのシグナル検出にウェスタンブロッティングに使用
Cytation 5BioTekF01吸光度(ステップ8.1)と蛍光(図6)の値を測定するためのマイクロプレート検出器 
Dil-labeled Low density lipoproteinACMECAC12038干渉成分の分布の定義 
電気泳動装置バイオ・ラッド1658033ステップ8.5.2、8.5.3、8.5.5でタンパク質の分離と転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます
化学発光キットHRP Fdbio scienceFD8020ステップ8.5.12
Escherichia coli American Type Culture CollectionATCC8739ポジティブコントロールとしてBEVを分離します。プロトコル:LB粉末25gを1Lの脱イオン水とオートクレーブに溶解します。800 μ を転送します。培地に保存された大腸菌のL。37°Cで耕作します。インキュベーターシェーカーのC。次に、3, 000 ×で遠心分離します。g 4 ° で 20 分間。C、12、000 ×g 4 °C で 30 分間。C、上清を0.22&muでフィルタリングします。mの膜、および160、000 ×で超高速遠心分離を行います。大腸菌由来の粗BEVと定義されるペレットを1.2mLのPBSに懸濁した(ステップ3、4)。   
FALCON tubes 50 mLKIRGENKG2811Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
paperBiosharpBS-TFP-070BMorphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Step 8.3 HEPES
powderMeilunbioMB6078密度勾配遠心分離のための異なる濃度のヨジオキサノール緩衝液の調製
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)FdbioscienceFDR007ウェスタンブロッティング(二次抗体)
インキュベータQiangwenDHZ-LCultivate Escherichia coli 
キムワイプ&トレード;デリケートなタスクワイプKimtech Science34155ステップ4.15で超遠心チューブの内壁を拭
LBブロスHopebioHB0128腸菌を栽培する 
低温冷凍庫(-80°C;C)ハイアールDW-86L338Jを保管
メタノールアラルディンM116118ステップ8.5.5でPVDF膜を活性化するためのウェスタンブロッティングで使用されます
マイクロチューブ 1.5 mLKIRGENKG2211密度勾配遠心分離後に画分を回復
マイクロチューブ 2 mLKIRGENKG2911密度勾配遠心分離後に画分を回復
チューブ 5 mLBBIF610888-0001密度勾配遠心分離後のフラクション回収
マイクロプレートリーダー サーモフィッシャー Multiskan MK3ステップ8.2
Milliporeフィルター0.22 μmメルクミリポアSLGP033RBろ過滅菌;材料:ポリエーテルスルホン、PES
NaClGHTECH1.01307.040勾配遠心分離液
NaOHGHTECH1.01394.068密度勾配遠心分離液(pH調整)
Optima™XPN-100ベックマン・コールターA94469でのBEV分離用超遠心分離
;Serumwerk Bernburg AG1893密度勾配遠心分離原液
オービタルシェーカーYouningCS-100ステップ2で糞便を溶解
リン酸緩衝生理食塩水プロセルPB180327ステップ2で糞便を溶解
ピペッターッペンドルフ3120000267、3120000259溶液を移送
プラスチックパスツールピペットABCbioABC217003-43.4で前処理で上清を除去し
ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜ミリポアISEQ00010、IPVH00010ステップ8.5.5でタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます
プレハブポリアクリルアミドゲル、4–20% 15ウェルACEF15420ゲルステップ8.5.2、8.5.3でのタンパク質分離のためのウェスタンブロッティングに使用
一次抗体希釈液Fdbio scienceFD0040ステップ8.5.8でウェスタンブロッティングに使用
タンパク質ラダーFdbio scienceFD0672ステップ8.5でウェスタンブロッティングとクーマシーブリリアントブルー染色に使用
ラピッドプロテインブロッティング溶液UBIOUW0500ステップ8.5.5でのタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650ステップ4でのBEV単離のための超遠心分離、7
シリンジ 20 mL、50 mL JetwayZSQ-20ML、YCXWJZSQ-50 mLTBS粉末の前処理で上清を除去する転写バッファー
Fdbio scienceFD1021ステップ8.5でウェスタンブロッティングに使用
透過型電子顕微鏡(TEM)日立製作所 H-7650ステップ8.3でのBEVの形態学的観察
Tween-20Fdbio scienceFD0020ステップ8.5でのウェスタンブロッティングに使用
超遠心チューブベックマン326823、ステップ4、7でのBEVの分離のための355642超遠心分離
ウルトラクリーンベンチエアテックSW-CJ-2FD液体の取り扱いに関する手順を実行する
ウォーターバスブルーパードCU600ステップ 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734、ソフトウェア ZetaView (バージョン 8.05.14 SP7)で BEV の粒子サイズと濃度を測定するための BEV のタンパク質
ステップ8.5.1 75 % (v/v) アルコール PBSビシンコニン酸アッセイ科学 強化 Filter ーシェーカー く 大サンプルします マイクロ密度 ステップ4、7 OptiPrep&trade エステップます 含有量の測定に使用 ステップ 8.4

参考文献

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