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方法論記事

慢性非特異的腰痛ラットモデルに対する手動療法

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DOI：

10.3791/65583

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2023年8月11日

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1The Third School of Clinical Medicine, School of Rehabilitation Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, 2Research Institute of Tuina (Spinal disease), Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、慢性腰痛モデルラットに対する手技療法の標準化された手順を提案しており、これは将来の手技療法に関する実験的研究の参考値となるでしょう。

要約

慢性腰痛(CLBP)は、世界中で非常に蔓延している状態であり、障害の主な原因となっています。CLBP患者の大多数は、未知の病理学的原因により慢性の非特異的腰痛(CNLBP)と診断されています。手技療法(MT)は伝統的な中国医学の不可欠な側面であり、中国ではTuinaとして認識されています。これには、骨のセッティングや筋の弛緩マニピュレーションなどの技術が含まれます。CNLBPの治療における臨床効果があるにもかかわらず、MTの根底にあるメカニズムは不明のままです。これらのメカニズムを調べることを目的とした動物実験では、CNLBPモデルラットで規範的なMTを達成することが大きな課題の1つです。指の強度の安定性を向上させることは、MTの重要な課題です。この技術的な制限に対処するために、この研究では、CNLBP モデルラットでの MT の標準化された手順が提示されます。この手順により、手による MT の安定性が大幅に向上し、MT 中のラットの固定に関連する一般的な問題が軽減されます。この研究の結果は、将来のMTの実験的研究の参考価値があります。

概要

慢性腰痛 (CLBP) は、下肢の痛みの有無にかかわらず、通常は胸郭と横方向の股関節ラインの間で 3 か月以上続く持続的な腰痛を特徴としています 1,2。これは非常に有病率の高い病気であり、世界の年間有病率は38%、生涯有病率は39%と推定されており、一般的な公衆衛生問題となっています3,4。CLBP 患者の大多数 (90 から 95%) は、確定的な病理学的および解剖学的診断 (腫瘍、骨折、感染症など) を受けることができず、慢性非特異的腰痛 (CNLBP) 5,6 の分類につながります。病理学的メカニズムの非特異的な性質のために、オピオイド鎮痛薬と非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)は西洋医学の主要な治療選択肢ですが、安全性の懸念に関連しています7,8。そのため、安全で効果的な補完代替医療の需要が高まっています。

中国では一般にトゥイナと呼ばれる手動療法(MT)は、伝統的な中国医学(TCM)の重要な側面であり、骨の設定や筋弛緩操作などの技術を網羅しています。中国での広範な使用は、その臨床的有効性、高い安全性プロファイル、および非侵襲性に起因しています9。CNLBP の治療において、MT は効果的な補完代替医療であることがわかっています。以前の研究で有効性が証明されています 10,11,12。TCMは、気の停滞とうっ血が慢性的な痛みの主な原因であると考えており、Tui Naは血液循環を促進し、筋肉や軟組織に気を促進することで痛みを和らげます。しかし、その有効性にもかかわらず、その治療効果の根底にある正確なメカニズムは依然としてとらえどころのないままです。

MTに関する実験的研究の領域では、動物モデルへの介入の実施に矛盾が存在します。現在、大多数の研究者は機械ベースのMTを選択していますが、人間の手を使用してMTを実行している研究者は少数派です13,14,15,16。マシンベースのMTはより標準化されていますが、MTは臨床的に関連性が高く、より代表的なデータを生成します。しかし、実験動物でのMTは、指の力が不安定なため、動物実験では重大な課題となり、実験結果の比較可能性が妨げられています。この技術的課題を克服するために、本研究では、CNLBPモデルラットのMT中の指の強度の安定性を高める適切な解決策を提案します。このソリューションの実現可能性は検証されており、MTの将来の実験的研究に貴重なガイダンスを提供します。

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プロトコル

この実験プロトコルは、浙江伝統中国医学大学の動物管理および使用委員会によって承認され、すべての手順は、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠しています。この研究では、体重が330 gから350 gの範囲の成体雄SDラット( 資料表を参照)を使用しました。すべてのラットは、明暗サイクルが12時間、温度が24±2°C、湿度が50〜5%の標準的な動物施設に収容±。ラットには十分な餌と水が供給されました。次のプロトコルは、CNLBP モデルの確立と手動療法手順の詳細な説明を提供します。

1. 以下の手順で腰痛モデルを確立します(図1)

  1. ラットの体重が330〜350 gになるまでラットに餌を与え、体重を量った後、3%ペントバルビタールナトリウム(1 mL / kg)を腹腔内に注射して麻酔をかけます( 材料の表を参照)。2分間待ってから、後肢の4本のつま先を鉗子で優しくつまみ、鉗子でラットの角膜に触れて、後退やまばたきの反応がないことを確認し、麻酔が成功したことを示します。
    注:ラットモデリングで使用されるすべての手術器具を事前にオートクレーブし、シェーバー、ELFSデバイス、サーモスタットテーブルなどの他のオートクレーブ不可能な器具をアルコールで滅菌します。オペレーターは、清潔な白衣、使い捨て滅菌手袋、マスク、サージカルキャップ、フェイスマスクを着用する必要があります。
  2. 麻酔後に目を閉じることができない状態が長引くことによる乾燥を防ぐために、ラットの目に適切な量の動物用軟膏を塗布してください。.
  3. ラットを恒温テーブル上の胸骨横臥位に置き、そのL4-6セグメントの位置を特定し、セグメントの毛を剃り、Iodophor 3xで消毒してから、使い捨ての手術用空洞ドレープを広げます。
  4. L4-6セグメントの皮膚と筋膜を手術用ハサミで切断し、次にこのセグメントの腰椎の棘突起の両側の筋肉をメスで分離します。
    注意: 筋肉が棘突起から完全に分離されていること、および棘突起に筋繊維が付着していないことを確認してください。さらに、分離の深さは、腰椎の横突起まで拡張する必要があります。
  5. L4-6の棘突起の途中に5mLのシリンジ針で穴を開け、L4-6の棘突起に外部リンク固定システム(ELFS)( 材料表を参照)をロードします。
  6. ヨードフォアで消毒し、創傷の両側に100,000ユニットのペニシリン( 材料の表を参照)を筋肉内注射した後に縫合します。.
    注意: ELFSデバイスを前方に押してELFSデバイスの高さを下げてから、感染を防ぐために皮膚の下に縫合します。
  7. ラットが起きる前にX線を撮影して、ELFSデバイスがL4-6棘突起に正常に取り付けられているかどうかを確認します(図2)。
    注:X線写真を撮った後、ラットを恒温テーブル( 材料の表を参照)の胸骨横臥位に置き、目が覚めるまで待ってからケージに戻し、目が覚めるまで放置しないでください。
  8. 以前に報告された17と同様に、各モデルラットを1つのケージに2週間給餌し、ELFSデバイスが2週間の終わりに脱落しない場合、CNLBPモデリングは成功したと見なされます。
    注:術後の回復期間中に、数匹のラットが感染により腰部に膿瘍を発症します。この場合、2.5mLの注射器を使用して膿を吸引し、次に傷口を生理食塩水で洗い流し、最後に綿球で傷口を数秒間押します。
  9. ラットが互いのELFSデバイスを傷つけないように、2週間の回復期間後も各モデルラットを1つのケージに保持し続けます。
    注:シングルケージの給餌によって引き起こされるラットの心理的なうつ病を防ぐために、プラスチック製のボールのおもちゃ( 材料の表を参照)をケージに入れます。

2. CNLBPモデルラットの手技療法の手順(図3)

  1. MTの前に、計量台( 材料の表を参照)で2週間、指の筋力安定性運動を行います。運動中は、指の揉み合わせ力を約600gに抑え、1秒間に2回の頻度で行います。1日1回、毎回10分間の運動を行います。
  2. MTの前に、モデルラットをラットポーチに1週間順応させます。ラットの上半身をポーチに入れ、腰部と下肢を露出させます。同時に、ラットの腰部をそっと撫でて、指と腰部との接触を受け入れるように促します。
    注意: 布の形を、上面の角度が90°、半径が12cmの扇形にカットします。次に、スカラップ生地の両面を縫い合わせてラットポーチを作ります( 補足図S1を参照)。
  3. ラットをラットポーチに入れます。このとき、ラットの体の上半分はラットポーチで覆われ、腰と下肢だけが露出します。利き手ではない手でラットの上半身を「C」字型に保持し、利き手でラットの腰部にMTを行います。
    注意: 利き手ではない手でネズミの胴体を保持するときは、ネズミの胴体をしっかりと持ちすぎないでください。ラットを強く保持しすぎると、ラットの胸部が圧迫され、呼吸が妨げられます。また、ラットが非常に抵抗力を持つようになります。
  4. Jiaji(EX-B2)ツボの正確な位置を見つけます。まず、ラットのL4-6棘突起の位置を特定します。Jiajiのツボは、椎骨の棘突起から0.5cmのL4-6の両側にあります。全部で6つのJiajiツボがあります。
    注:ラットでは、L6の棘は2つの前上腸骨棘の線上にあり、L4とL5の位置はL6の棘に沿って数えることによって見つけることができます。
  5. ラットのL4-6セグメントのJiajiツボに親指を置き、揉みの強度を徐々に増やします。モデルラットが手足を悶える、大きな叫び声をあげる、静かな状態で強くもがくなどの抵抗行動を示す場合、そのときの揉み合わせ力が最大圧力値となります。最も適切な圧力が、ラットが抵抗行動を示さずに耐えられる最大圧力値である最大圧力値よりもわずかに小さいことを確認してください。
  6. L6の左側にあるJiajiツボから始めます。ラットのジアジツボに最適な圧力レベルを見つけたら、その圧力レベルで親指をできるだけ長く保持しながら、1秒間に2回の頻度で1分間揉み合わせます。残りの5つのJiajiのツボについても繰り返します。
  7. 混練手順中にラットに抵抗行動が観察された場合は、ラットが落ち着くまで親指の圧力を止めてから、手順を再開します。ニーディングプロセスが各ツボごとに1分間続くことを確認してください、プロセス中に中断がある場合でも。

3. 足出金閾値(PWT)

  1. 公式テストの前に、ネズミを金網の透明なプレキシガラスの箱に30分間入れて、環境に順応させます。
  2. ラットが探索とグルーミングを停止した後、異なるサイズのフォンフレイフィラメント(0.6、1、2、4、6、8、15、26 g)( 材料の表を参照)を使用し、左後肢の中央を垂直に刺激し、フィラメントがわずかに曲がるまでゆっくりと圧力を上げ、次に圧力を停止して圧力値を5秒間維持します。
    注:フィラメントで後足を刺激するときは、後足の中央にある皮膚の厚い部分を避けてください。
  3. ラットが脚の収縮または足を舐める反応を示し、刺激フィラメントのレベルが低い場合は、ポジティブな行動を X として記録します。ポジティブな行動の欠如を O として記録し、より高いレベルの刺激フィラメントを与えます。
    注:隣接する2つの刺激の間隔は30秒より大きくする必要があります。
  4. X の後に連続した X O のシーケンスが取得されたときに 4x を連続して検出し、Chaplan18 の方法に従ってシーケンスを対応する PWT 値に変換します。

4. Paw Withdrawal Latency (PWL) (ポー・引き出し遅延 (PWL))

  1. ラットを正式なテストの前に30分間ハーグリーブス装置( 材料の表を参照)に入れて、環境に順応できるようにします。
  2. 機器のパラメータを次のように設定します: 最大光露光時間20秒; 露光強度50% ( 補足図S2を参照)。
    注:ラットの足を火傷しないように、最大光照射時間は20秒を超えてはなりません。
  3. ラットが探索とグルーミングを停止した後、熱刺激装置の + をラットの左後足の中心に合わせます。 [スタート]をクリックし、ラットが足を持ち上げる行動を示し、装置が自動的にタイミングを停止したら、結果の時間値を記録します。ラットごとに合計5つのテストを実行します。
    注:同じラットの各テストの間隔は、ラットの後足の皮膚を火傷しないように、少なくとも5分です。
  4. 各ラットについて測定された 5 つの値から最大値と最小値を削除し、残りの 3 つの値の平均をラットの PWL 値として取ります。

5. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

  1. MT の 2 週間の終わりにペントバルビタールナトリウムでラットに麻酔をかけ、完全に麻酔をかけた後、すべてのラットを心臓灌流で安楽死させます。
  2. ラットL5から左腰筋を取り出し、4%パラホルムアルデヒド( 材料の表を参照)に浸して48時間固定します。.
  3. ティッシュを適切なサイズにトリミングして埋め込みボックス( 材料の表を参照)に入れ、自動脱水機( 材料の表を参照)を使用して脱水します。
  4. パラフィンワックスを使用して組織を埋め込み、組織を5μmの厚さに切断します。
  5. セクションをスライドに取り付け、4時間焼きます。
  6. 組織を自動ステイナー( 材料の表を参照)に置き、その後の脱ロウ、ヘマトキシリン染色、分化、ブルーイング、エオシン染色、脱水、および透明性19のために。
  7. 切片を中性樹脂で密封し( 材料表を参照)、換気の良い場所に24時間放置します。
  8. デジタルスライドスキャナーを使用してスライドをスキャンします( 資料の表を参照)。

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結果

この研究では、CNLBPモデルラットに対するMTの鎮痛効果を調査することを目的としていました。この目的のために、24匹のラットを4つのグループ、すなわちブランクグループ、偽操作グループ、モデルグループ、およびMTグループにランダムに割り当て、それぞれに6匹のラットが含まれていました。ブランクグループは介入を受けませんでしたが、偽手術グループは、L4-6棘突起の両側の腰部筋を分離して縫合する外科的処置のみを受けました。CNLBPモデルラットは、記載された方法に従ってモデル群に樹立され、それ以上の介入はありませんでした。MT群では、CNLBPモデルラットをモデリング成功後2週間MTで治療しました。すべてのラットは、プラスチック製のボールのおもちゃを備えたケージで個別に給餌されました。ラットは、モデリング後15、17、21、24、および28日目に、足の離脱閾値(PWT)と足の離脱潜時(PWL)について評価されました(図4)。データの統計分析は、すべてのデータを平均±標準偏差として表すために行われました。一元配置分散分析は複数のグループの比較に使用され、LSD検定は分散が等しい場合に2...

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ディスカッション

現在、慢性の非特異的腰痛 (CNLBP) を正確に再現する動物モデルに関するコンセンサスが不足しています。CNLBPには、椎間板由来モデル、神経原性モデル、骨関節由来モデル、筋肉由来モデルなど、複数の動物モデルが存在する23。ただし、これらのモデルには、臨床診療における CNLBP の不均一な性質により制限があります。この研究で使用したCNLBPモデルは、骨関節由来のCNLBPモデルであるヘンダーソンの「外部リンク」モデル24から変更されました。以前の研究では、X線は、腰椎の長期固定が固定セグメントの椎骨関節に骨棘、すなわち椎骨と関節のわずかなずれをもたらすことを示しました25。TCM理論によれば、腰の軟部組織構造(Jin)と骨構造(Gu)の間の生体力学的バランスを維持することは、腰の健康にとって非常に重要です。椎骨と関節のわずかなずれは、腰の Gu 生体力学の不均衡につながる可能性があり、治療せずに放置すると、最終的には Ji...

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開示事項

著者は、競合する利益または利益相反を構成する可能性のある関係を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会の一般プログラム(81774442年、82274672年)、浙江省自然科学基金プロジェクト(Q23H270025)、浙江省Lv麗江有名な旧漢医学専門家継承スタジオ建設プロジェクト基金(GZS2021026)、および浙江中医薬大学の学校レベルの科学研究プロジェクト(2021RCZXZK03、2022FSYYZQ13、2022GJYY045)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
自動脱水機サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社エクセルシオールAS
自動ステイナーサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社ジェミニAS
定温テーブルハーバードバイオサイエンス(上海)株式会社50-1247加熱された小動物手術台は通常37°Cで作動します。C–38度;C
デジタルスライドスキャナー浜松 (株C13210-01
外部リンク固定システムShanghai Naturethink life science &Technology CO., Ltdカスタムメイド
埋め込みボックスCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd31050102W
Hargreaves ApparatusUGO BASILE Co.,Ltd37370
中性樹脂ZSGB-BIO Co.,LtdZLI-9555
パラホルムアルデヒドMacklin Co.,LtdP804536
Penicillin杭州 Zhengboバイオテクノロジー株式会社ZSQ-100-160A
プラスチックボール玩具上海華家工業株式会社HK11029-35503
SDラットShanghai SLAC Laboratory Animal Co.,LtdSCXK (HU) 2022-0004オス, 330-350 g
ペントバルビタールナトリウム杭州大成バイオテクノロジー株式会社P3761
フォン・フレイ・フィラメントStoeltingco Co., Ltd.
計量テーブル上海苔蔽Bangxi計器技術有限公司
) NC12775YP20002B

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