ここでは、安定同位体標識により、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションを利用した脂質構造をスクリーニングする方法を紹介します。
この記事について
サマリー
要約
脂質は非常に多様であり、脂質の構造と組成のわずかな変化は、重要な生物学的機能に大きな影響を与える可能性があります。安定同位体標識(SIL)は、脂質の分布、動員、代謝、 およびde novo 脂質合成の研究にいくつかの利点を提供します。SIL技術を成功裏に実装するには、内因性分子からの干渉の除去が必要です。本研究では、生体サンプルからSIL脂質をスクリーニングするためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。蚊の卵巣発育中の脂質 de novo 同定の例を示します。補完的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析、および質量分析を使用すると、1回のスキャン(<1時間)で1つのサンプルから分離および脂質の割り当てが可能になります。ここで説明するアプローチは、データ依存型取得とデータ非依存型取得の最近の開発を利用しており、移動度トラップでの並列蓄積とそれに続く逐次フラグメンテーションと衝突による解離を使用します。脂肪酸鎖レベルでのSILの測定により、蚊の卵巣発育中の脂質動態の変化が明らかになります。脂質 de novo 構造は、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて自信を持って割り当てられます。
概要
脂質データを分析する場合、安定同位体標識(SIL)は、生体内の代謝経路を評価するための効果的な方法です。この方法では、分析種内の原子を 13Cまたは 2Hを含む安定同位体で置換します。これらの同位体はさらに前駆体に組み込まれ、後で脂肪酸に埋め込まれ、それらが存在する領域にラベルが付けられます。これらの同位体を使用すると、脂質の分布と代謝を特定することができます。脂質は、ラベルのない背景1と対照的です。一般的な質量分析プラットフォームでは、内因性分子からのシグナルを区別することができません2。SILを成功させるには、超高分解能分析ツールの使用が必要です。高分解能のトラップイオンモビリティー分光法-並列蓄積シーケンシャルフラグメンテーション飛行時間型タンデム質量分析(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより、標識分子種と非標識分子種の分離が可能になります2。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析の利点は、MS シグナルを保持時間(RT)と移動度でフィルタリングできるため、内因性分子の潜在的な干渉を減らすことができるだけでなく、必要なすべての分子種の定量と分離できることです2。TIMSでは、イオンは最初にガス移動相に対して静止したままになり、その後、その移動度に応じて放出されます。これにより、以前のIMS計装3よりも低い電圧で動作しながら、高解像度のモビログラムが得られます。モビログラムは、電荷する質量とドリフト時間のプロットであり、ドリフト時間とオーバーラップの量に基づいて化合物を区別するために使用できます4。
追加のPASEF技術を使用することで、感度5を犠牲にすることなく、シーケンシング速度が大幅に向上します。PASEF理論では、イオンが蓄積し、その後、移動度の順に順次放出されます。これは、イオンをその移動度に平行に整列させて蓄積することによって行われます。このように蓄積することで、イオンロスを防ぎます。さらに、プリカーサーイオンの選択は、イオンの蓄積と放出と同時に行われます。この方法では、PASEFは、PASEFを使用しないTIMS装置に典型的なスキャンごとの個々の前駆体ではなく、各TIMSスキャン中に複数の前駆体を直列に選択します。フレームあたり約100 msのTIMSスキャンで、プリカーサーイオンが2 msのピークで同時に蓄積および放出されると、シグナルは1桁以上増幅されるため、S/N比が増加します3。TIMSにPASEFを追加すると、MS/MSの効率が向上します。TIMS-PASEFはMS/MSと結合されているため、より効率的なフラグメンテーションが可能です。従来のMS/MS検出とは異なり、TIMS-PASEFからプリカーサーシグナルを圧縮し、プリカーサー3のTIMS溶出時間およびイオン移動度位置にフラグメントイオンを同時に検出します。
質量分析計からデータを取得する場合、必要なスキャンモードのオプションがあります。データ依存性取得(DDA)は、MS1スキャンから存在量に基づいてプリカーサーイオンを選択し、その後、プリカーサーイオンを断片化してMS2スキャンを実行します。このスキャンモードは、できるだけ多くの前駆体をフラグメント化します。DDAアプローチはターゲットを絞っており、結果はイオン選択によって異なります3。しかし、DDA-PASEFは、反復間の再現性に問題が生じることがよくあります。DDAは焦点を絞った分析に最適なツールですが、複雑な混合物はデータ取得がより困難になります6。これは、同時に監視できるイオンが少量しかないためです3。データ独立集録(DIA)は、事前に選択されたm/zのウィンドウを強度とは無関係に断片化し、すべてを範囲7内でスキャンする方法です。このスキャンモードでは、イオン雲全体がIMSから質量分析計3に送信されます。プロテオミクス研究では、DDAと比較して、より短い時間でより多くのタンパク質を定量することができます。さらに、DIAはDDAと比較してm/z値の欠落が少なくなっています。したがって、この代替案は、DDAよりもS/N比のデータの再現性が大幅に向上し、定量化が優れていることを示しています。この本研究では、Tose et al.2によって報告された方法にDIAを実装することを目標としています。シグナルの再現性と強度を向上させ、DDAおよびDIA取得を活用して、生体サンプル中のSIL脂質の動員、分布、代謝に関する決定的な情報をますます得ることができました。
プロトコル
1. サンプル調製
- 昆虫の解剖
- Aedes aegypti蚊の卵巣を生後7日で、マイクロニードルを使用してリン酸緩衝生理食塩水で解剖します。
- リン酸緩衝生理食塩水からマイクロニードルを使用して8つの卵巣を採取し、-80°Cで1.5 mLの微量遠心チューブに保存します。
- 生物学的複製物で卵巣を採取します。
- 脂質抽出
- 10 μL の内部標準物質 (ISTD) を 1 ppm の濃度で採取した 8 つの卵巣に加えます。ISTDは、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン-D7(15:)の7つの重水素を含む標識脂質混合物です。 0-18:1(D7)PC)、リゾホスファチジルコリン-D7(18:1(D7)Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(15:0-18:1(D7)PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(18:1(D7)Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール-D7(15:0-18:1(D7)PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン-D7(15:0-18:1 (D7) PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール-D7 (18:1 MAG (D7))、オレイン酸コレステリル-D7 (18:1 (D7) チョルエステル)。
- 室温で乾くまで待ちます。100 μLのブタノール/メタノールと3 μLのブチル化ヒドロキシトルエンを加えます。1.5 mLのポリプロピレン製乳棒で10秒間、手作業で均質化します。
- 乳棒を200μLのブタノール/メタノールですすぎ、均質化した溶液と混ぜ合わせます。
- マイクロ遠心チューブを室温および中出力で30分間超音波処理します。
- チューブを1600 x g で20°Cで10分間遠心分離します。 上清を300 μLのシラン化ガラスインサートでオートサンプラーバイアルに移します。
2. 機器のセットアップ
- 移動相の準備
- アセトニトリル、水、イソプロパノールをそれぞれの割合として使用して、30:40:30(移動相 A)と 10:5:85(移動相 B)の組成で移動相を調製します。両方の移動相で、10 mmol/L ギ酸アンモニウムを水と 0.1% ギ酸に添加して緩衝条件を作成します。
- 3.15 gのギ酸アンモニウムを10 mLの水で秤量します。この溶液500μLを12.5mLの水に加えます。順番に、250mLメスフラスコに入れ、フラスコの約2/3までイソプロパノールを充填します。渦を巻いて混ぜます。
- 250 μL のギ酸 (85%) を加え、250 mL の充填ラインに 25 mL のアセトニトリルとイソプロパノールを充填し、混合します。
- MSシステムでは、画面の左側にあるMS設定で、最小スキャン設定として50を選択し、最大スキャン設定として1850を選択して、質量範囲を決定します。
- ポジティブイオンモードとして 極性 を選択します。スキャンモードを DIA-PASEFとして選択します。これを行うには、[ Tune and open analysis method from a previous DDA method with the following LC parameters]を選択します。
- グラジエント分離の場合:
サンプル注入:0% B、保持時間1分
55%Bに増やし、6.4分まで保持します。
Bを65%に増やし、24分間保持します。
88%Bに増やし、40.8分まで保持します。
95%Bに増やし、48.1分まで保持します。
Bを35%に減らし、56分まで保持します。
0%Bに減らし、60分まで保持します。 - HPLC条件の場合:
注入量:5 μL
溶媒速度:0.25 mL/min
合計実行時間: 60 分で、そのうち 5 分はカラムの前処理を行います。 - 液体クロマトグラフにカラムを挿入して、液体クロマトグラフを調製します。ダミーを使用してカラムをクリーニングし、漏れがないかテストします。これは、機器が圧力や流れを保持していないことに見られます。
- グラジエント分離の場合:
- ポジティブイオンモードとして 極性 を選択します。スキャンモードを DIA-PASEFとして選択します。これを行うには、[ Tune and open analysis method from a previous DDA method with the following LC parameters]を選択します。
- 新しいメソッドを作成するには、以下で説明する手順を実行します (図 1 そして 図 2).
- ソフトウェアを開き、[ すべての機器を接続]をクリックします。接続が成功すると、LCシステムはビープ音を1回鳴らし、制御画面のStatusボックスにHyStarが表示され、エラーメッセージは表示されません。
- 「Acquisition」タブをクリックします。サンプルテーブルナビゲータで、タグドロップダウンメニューを見つけ、前の方法を選択します。
- 最新のサンプルテーブルを2倍にします。 「Save As... 」をクリックし、新しいサンプルリストを次の形式で保存します。YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) は分析の短い記述子です。
- 分離方法を右クリックし、[ Edit Method]をクリックします。 「Edit Module Method」をクリックします。
- 「ダウンロード」をクリックします。成功すると、[ダウンロードに成功しました]がポップアップ表示されます。保存せずに画面を閉じます。
- [MS 設定] で [TIMS 設定] に移動し、0.70 の 1/k0 開始と 1.85 の 1/k0 終了を選択します。ランプ時間を 150 ミリ秒に設定します。これにより、デューティサイクルとランプレートが自動的に調整されます。
- 下部のウィンドウで、[ ソース ]タブを選択します。ソースタイプを ESI として選択し、エンドプレートオフセットを800Vに、キャピラリーを4500Vに設定します。乾燥ガスを4.0 L / minに、乾燥温度を250°Cに設定します。
- ソースタブの右側にある「Tune」タブを選択します。 「一般 サブ」タブをクリックし、転送見出しの下で次のパラメータを確認します。
たわみ1デルタ:70 V
ファネル1 RF:250 vpp
isCIDエネルギー:0 eV
ファネル2 RF:250 vpp
多極RF:500 vpp。- 衝突セルの見出しの下で、次のパラメータを確認します。
衝突エネルギー:6.0 eV
衝突RF:1200 vpp。 - 四重極の見出しの下で、次のパラメータを確認してください。
イオンエネルギー:6 eV
低質量:250 m/z。 - フォーカスが合っているPre-TOFタブで、次のパラメータを確認します。
転送時間:45μs
プレパルス保存:5.0μs。
- 衝突セルの見出しの下で、次のパラメータを確認します。
- 「Processing Sub」タブをクリックします。質量スペクトルピーク検出では、以下のパラメータを確認してください。
絶対しきい値: 667
絶対しきい値 (100 ミリ秒 AccuTime あたり): 445。- 移動度ピーク検出では、次のパラメータを確認してください。
絶対しきい値: 30.00。
- 移動度ピーク検出では、次のパラメータを確認してください。
- 「TIMS」サブタブをクリックします。「offsets」タブで、次のパラメータを確認します。
Δt1:-20V
Δt2:-150V
Δt3:70V
Δt4:150V
Δt5:0V
Δt6:150V
コリジョンセル:300 V。 - 「tune」タブの右側にある「 MS/MS 」タブをクリックします。[プリカーサーイオン]タブで、次のパラメーターを確認します。
PASEFランプの数:8
最小充電:1
最大充電:1。- 「スケジューリング」タブで、「 詳細 」をクリックし、次のパラメータを確認します。
強度:0,1500、5000、10000
繰り返し:1、10、5、1
強度しきい値: 1500。 - 「アクティブな除外」タブで、次のパラメータを確認します。
アクティブな除外チェック マーク
リリース時間後:0.4分 - 衝突エネルギー設定では、次のパラメータを確認してください。
K0(V-s / cm3):0.70、1.60
衝突エネルギー(eV):20.00、35.00。 - [独立性の幅] 設定で、次のパラメーターを確認します。
質量(m / z):622、1222
幅(m / z):1.00 2.50。
- 「スケジューリング」タブで、「 詳細 」をクリックし、次のパラメータを確認します。
- DIA -PASEFのセットアップ:左側のMS設定スキャンモードから DIA-PASEF を選択します。[MS/MS] タブで、[ ウィンドウ エディタ] を選択します。ここでは、次のパラメータを確認します(図3)。
ウィンドウ設定:質量幅:50 Da;質量オーバーラップ:0.0 Da;ポリゴンから計算します:マスステップ。移動ウィンドウの数:1。
3. キャリブレーション
- 機器のキャリブレーション(図4)
- [Calibration]サブタブで[m / z]をクリックし、ドロップボックスから[Tuning Mix]を選択して、右下隅にある[Calibrate]をクリックします。
- スコアが 100% に達するまで [調整] をクリックし続けます。
- 次に、[ モビリティ ]タブを選択し、100%のキャリブレーションスコアに達するまで上記と同じ手順に従います。
- 検量線
- 10 μL の重水素化内部標準混合物を含む脂質内部標準混合物をスパイクします。
0.1〜500 ng/mLの標準混合物と10 μLの重水素化内部標準混合物から7つのキャリブレーションポイントを使用します。 - 2で既に説明したPASEF MS/MSパターンに基づいて脂肪酸鎖に手動でアノテーションします。
- 10 μL の重水素化内部標準混合物を含む脂質内部標準混合物をスパイクします。
- SILラベリング効率
- 同位体を含むSILの面積と同位体を含まないSILの面積の比を計算します。
- 任意のサイトで標識された原子を見つける確率を決定することにより、理論的なパターンを計算します。
- 実験用同位体プロファイルをデータ解析ソフトウェアでシミュレーションされた理論パターンに適合させることにより、SIL濃縮を計算します。
- 実行の開始
- カラムオーブンをアクティブにするには、[ 温度計 ]ボタンをクリックします。 [バルブ ]ボタンをクリックしてポンプをアクティブにします。
- MS メソッドを、以前に保存したメソッドに設定します。注入量が 5 μL で、ライン 1 がバイアル 20:1 をターゲットとしていることを確認します。
- バイアル20:1に50%のIPA / ACNがあることを確認してください。サンプルリストを保存します。
- シーケンスを開始し、挿入が成功したことを確認します (挿入されたことを示すメッセージがシステムに表示されることで確認されます)。
- 行 1 をコピーし、下に貼り付けて新しい行を生成します。2行目に、現在の実験に応じたサンプルを入力します。オートサンプラーの正しい位置が使用されていることを確認してください。
- 移動相が新鮮な場合は、まずメーカーから提供された脂質混合物のスタンダードを注入してピーク形状試験を実施します。以前の結果と比較します。2 標準試料は、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0-18:1 PC)、リゾホスファチジルコリン(18:1 Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(15:0-18:1 PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1 Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール(15:0-18:1 PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(15:0-18:1 PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール(15:0-18:1-15:0 TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール(15:0-18:1 DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール(18:1 MAG)、オレイン酸コレステリル(18:1 Chol Ester)。
- 新しいラインの分離方法が正しいこと、およびライン 1 で使用した前処理方法ではないことを確認します。MSメソッドが正しいことを確認します(当日のメソッド)。
- 正しい処理方法がロードされていること、および 「自動化プロセスの実行 」が有効になっていることを確認します。
- サンプルリストを保存して、現在の実行の終了後にサンプルが分析されるようにします。
4. データ分析
- Open Data Analysis ソフトウェア(図5)。左上隅にある [ファイル ]ボタンをクリックし、[ 開く]を選択します...
- 選択したファイルを選択します。ファイル名を右クリックして、[ プロパティ]を選択します。
- [Calibration Status]を選択します(図6)。ドロップダウンボックスで、質量分析計の[Initial Calibration]を選択します。すべてのエラーが 1 ppm 未満であることを確認してください。
- 次に、[ Initial Mobility Calibration ]を選択し、エラーが1 ppm未満であることを確認します。
- [クロマトグラム]を右クリックし、[クロマトグラムの編集]を選択します(図 6C)。[Type]でドロップダウンボックスをクリックし、[Extracted Ion Chromatogram]を選択します(図 6D)。フィルターで「すべてのMS」を選択し、スキャンモードで「すべて」を選択します。これは、目的の分子のフラグメントだけでなく、そのピークを表示するためです。
- この下に、分子選択のための2つのフィルターオプションがあります:質量またはフォーミュラ。 「質量 」を選択すると、対象の分子の理論上のm/zを選択できます。この場合は、829.7985 m/z を選択します。 Formula を選択すると、分子のフォーミュラとクロマトグラムの対象となるイオン形態を選択できます。この場合、アンモニウム[M+NH4]を選択します。これは、移動相のアンモニウムバッファーがこのイオン形態でのイオン化を促進するためです(図7)。
- 幅には ±1 を選択します。極性については、ポジティブモードを維持していることを確認してください。 [モビリティ ] で [1.455-1.465 ] を選択します。これは、これらの値に該当しない分子を除外し、目的の分子を分離するために行われます。
- パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。
- 対象のピークの始点の基線で右クリックし、ピークの終点まで押したままドラッグします。この手動統合により、その保持時間内にフラグメントのライブ質量スペクトルが得られます。
- モビログラム
- Mobilogramの画面左側を右クリックし、[Edit Mobilogram]を選択します(図8)。Edit Mobilogram Traces という名前のウィンドウが表示されます。C.e.i.1からC.e.i.5まで、同じ手順に従います(図9)。
- At Retention Timeに、対象ピークの保持時間を入力します。この場合、37.45-37.55分。
- パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。
- 抽出されたイオンについては、イオンのリストが形成されるまで手順4.2.3.1〜4.3.2.2を繰り返します。
- MS ウィンドウの下部で、[ Profile MS ] と [Fragment MS] を選択します。これにより、フルスキャンとPASEFからのイオンのスペクトル表示が可能になります。
- スペクトル表示で、右クリックして「 Copy Compound Spectra」を選択します。右側に表示されるスペクトルデータを使用すると、分解能分解能、強度、信号対雑音比(S/N; 図 10)。
- 加工
- データを処理するには、クロマトグラムと移動度ピークを手動で波形解析して、目的の分子に関する貴重な情報を得ることができます(図 10)。
- [Find]を右クリックし、[Integrate Only chromatogram]または[Mobilogram]を選択します(図 11)。左クリックして、目的のピークをハイライトします。この情報には、保持時間、面積、S/N、移動性が含まれます。
結果
安定同位体標識は、雌の蚊の卵巣の脂質動態研究におけるトリグリセリドの可視化を容易にします。2D移動度ドメインでは、トリグリセリド48:1は、移動度1 / K0に対して特定の保持時間を持つ領域に表示されます。トリグリセリドの強度は、濃い青色の線で視覚化できます。他の斑点は、卵巣内に見られる追加のトリグリセリドを表しています。保持時間と移動性は、質量と構造の違いによって異なるため、グラフの異なる領域に表示されます。これらの違いは、サンプル中のトリグリセリドを区別する際に重要です(図12A、B)。この領域の増幅された質量スペクトル投影では、822 m/z で 48:1 のトリグリセリドイオンとアンモニウムイオンが結合していることが示されています。50:2 や 52:3 などの他のトリグリセリドも視覚化されますが、構造、サイズ、およびフラグメンテーションの違いにより、m/z 領域が高くなります (図 12C、D)。この例では、重水素標識同位体の分析に興味を持っていました。TG 48:1の領域をさらに増幅して、同位体標識イオンを可視化しました。イオン上の重水素の量が増加すると、ピークの強度は減少します。これは、高重水素標識イオンの発生が少ないために発生します。m/z比は、質量の増加により重水素が添加されるたびにわずかに増加します。これらの強度は、サンプル内に存在する各同位体の量をさらに決定します。
質量スペクトル中のフラグメントの強度を評価する際には、非標識同位体と 2Hで標識された同位体を比較する必要があります(図12E)。青色はラベル付けされていない強度で、黒い破線は理論的な強度です。赤色では、同位体標識の結果が観察されます。それらは、ラベルなしの強度と理論的な強度の両方よりも高い強度を示します。同位体標識による種の濃縮は、標識されていない理論上の種よりも高い強度をもたらします。強度が高いほど、地区の不一致によるトリグリセリドを視覚化できます。また、PASEFはフルスキャンMS/MSと比較してフラグメンテーションが増加するため、フラグメンテーションは脂質の同定にも重要な役割を果たします。これは、脂質鎖の脂肪酸が異なるパターンで断片化する可能性があるため、スペクトル内の線はトリグリセリドの断片化プロセスに基づく断片の強度を示しています(図12F)。これにより、脂肪酸の構造情報が得られ、種のどの異性体が存在するかを立証するのに役立ちます。DIA分析法のデータを分析すると、フラグメントの数が増えるため、一般的なDDA分析法よりも優れたMS/MSスキャンと優れた同定が得られます。
図1:ソフトウェアの一般的なホーム画面。 ホーム画面では、メソッドの作成と装置の起動が可能です。(A)TIMSおよびMS/MS制御設定を含むソフトウェア画面。画面の下部には、インストゥルメントのこれらのコントロールを編集するためのソースタブがあります。(B)曲のタブを開いた状態のソフトウェア画面。(C)ここでは、楽器を一般的な調子で準備することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:[tune]タブを開いた状態のソフトウェア画面。ここでは、処理チューンパラメータを編集できます。 (A)曲のタブを開いた状態のソフトウェア画面。ここでは、インストゥルメントのTIMS部分のチューンパラメータを編集できます。(B)画面下部でMS/MSタブを選択した状態でのソフトウェア画面。(C)ここでは、タンデム質量分析計のパラメータを編集することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DIA-PASEFのウィンドウ幅を選択するための画面。 ここでは、豊富な色を編集したり、データ取得用のウィンドウのサイズを編集したりできます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:質量電荷比(m/z)による質量分析計のキャリブレーション。リファレンスリストがキャリブレーション用に選択されます。 (A)右下の[ キャリブレーション ]ボタンは、許容可能な値が表示されるまでクリックされます。移動度によるイオン移動度分光器の校正。リファレンスリストがキャリブレーション用に選択されます。(B)右下の[ キャリブレーション ]ボタンは、許容可能な値が表示されるまでクリックされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ分析ソフトウェアの一般的なホーム画面。 ファイルを開くには、左上の [ファイル ]ボタンをクリックして、オプションが表示されるドロップボックスに移動します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:データ分析ソフトウェア。 (A)キャリブレーション結果の選択方法と(B)キャリブレーションカテゴリの選択でキャリブレーションが成功したことを確認するソフトウェア画面。(C)分析するクロマトグラムの選択、および(D)抽出イオンクロマトグラムの選択。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: ポップアップ画面。 イオンクロマトグラムを(A)質量フィルターと(B)フォーミュラフィルターで選択・抽出するためのポップアップです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:データ分析ソフトウェア。 ソフトウェア画面では、左側にモビログラムが解析用に選択されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:モビログラムのポップアップ画面。 (A)質量フィルターと(B)フォーミュラフィルターで抽出したイオンモビログラムを選択するポップアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:データ分析画面 (A)ソフトウェア画面。左側で強調表示されているものは、抽出されたイオンリストを形成することができます。(B)抽出したイオンの化合物スペクトルを底部に調製したデータ解析画面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:データ分析画面。 化合物スペクトルの手動統合の結果を示すソフトウェア画面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:LC-TIMS MSの結果 (A) 2つのH標識ショ糖食と昆虫の卵巣を給餌してから4日後のLC-TIMS MSは、2D移動度領域で見ることができます。(B)標識サンプルからのTG 48:1、TG 50:2、TG 52:3に対応する信号の一般的なMS予測。(C)標識されたTGプロファイルを示す増幅されたMS領域822〜827 m/z 。(D)赤色のMSピークは同位体プロファイルで増幅されていることに注意してください。(E-F) 2H標識された同位体プロファイルは赤で強調表示されています。以下の非標識同位体プロファイルは青色で強調表示されています。理論上の同位体プロファイルは破線で示されています(黒で13°C; 2Hは緑)。トリグリセリド48:3の潜在的な構造も右上に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
このプロトコルの使用を評価する際には、DIA-PASEFおよびMS/MSパラメータが問題のトリグリセリドに適用可能であることを確認することが不可欠です。具体的には、モビリティウィンドウとウィンドウ幅はトリグリセリドのパターンに従う必要があります。これは、DDA メソッドを使用して前回の実行で決定できます。内部標準でトリグリセリドを追跡する場合、DIAセットアップのウィンドウは、事前に同定されたすべての目的の分子をカバーする必要があります。ウィンドウはすべて同じサイズで、範囲は目的の化合物の m/z および 1/k0 内に収まる必要があります(図 7)。ウィンドウのサイズを間違えると、フラグメンテーションされるイオンがスキップされ、収量スペクトルの再現性が低下します。基本的に、リピドミクスのウィンドウ範囲を適切に最適化しなければ、DIAの結果はDDAデータを強化しません。ウィンドウは、データ取得プロセスの段階的な形状を表す必要があります。そうでない場合は、セットアップされたDIA-PASEFウィンドウ内のパラメーターを、完全な脂質プロファイルを表すように変更する必要があります。このステップを行わないと、重要な脂肪酸は取得したデータから省略されます。
装置の制限には、主に LC-MS メソッドに付属する制限が含まれます。これには、ピーク幅のマルチプレックス化の制限が含まれます。したがって、適切な定量のためには、ピーク溶出を最適化し、データ取得中の選択性を促進する必要があります。通常、これはDDAなどの選択された前駆体で行われます。しかし、DIAでは前駆体が選択されないため、機器選択性8が制限されるリスクがあります。DIA法ではフラグメンテーションが増加しますが、まだ制限があります。最も顕著な制限は、前駆体の選択性の低下です。DIA法のウィンドウは、一般的なDDA法の5倍から10倍の幅があります。その結果、フラグメンテーションが大きくなる一方で、デューティサイクルとシリアル集録が減少する可能性があります。これは、ステップ四重極を使用する質量分析計で観察できます。プリカーサーやどのイオンを断片化するかを選択する必要がないため、静的な分離ウィンドウは、m/zウィンドウをカバーするために順次循環します。ウィンドウは一般的なDDA法よりもはるかに大きいため、感度9を得るためにはより広い範囲を使用する必要があります。したがって、シリアル集録の問題により感度が低下します。2 つ目の制限は、ライブラリの生成に関するものです。これには時間がかかり、調合には大量のサンプルが必要です。外部ライブラリを使用することもできるが、フラグメンテーションパターンは実験条件と装置10とで異なる場合がある。
安定同位体標識法を用いて脂質データを解析する場合、生物内に見られる他の分子からの干渉を最小限に抑える必要があります。これは、LC-TIMS-TOF-MS/MS2などの高分解能分析ツールを使用して行われます。現在、これらの高解像度ツールを使用して標識された同位体をバックグラウンドノイズから分離する方法は、従来の方法と比較してまだ非常に斬新です。従来の機器に関する考慮事項では、ガスクロマトグラフィーによる分離と、それに続く化学的または電子イオン化が実施されていました。これにより、臭化ペンタフルオロベンジルによる化学誘導、または電子イオン化によるフラグメンテーションが可能になります。LC-MSが同位体研究に採用されるのは、ごく最近のことです。高分解能質量分析計を使用することで、高い質量精度を実現し、単一の同位体ではなく複数の同位体標識を使用してマルチトレーサー研究を行うことができます。装置の高分解能がなければ、 13C、2 、 13Cなどの異なるラベリング度を区別することはできません。これにより、分解能が低い従来の装置と比較して、10回の実行からより多くの情報を得ることができます。
DIAはDDAよりも再現性が優れていますが、他の新しいデータ取得方法を比較することができます。p-SMARTのようなハイブリッドDIA-DDAストラテジーは、各分析法の長所を組み合わせて、高いレベルのターゲット定性分析を維持しながら、優れた検出と定量を維持することができます。この方法では、1つのマッチドプロダクトイオンを使用すると、広範なノンターゲットアプローチ8と比較してDIAウィンドウが狭くなるため、DIAの感度と選択性を向上させることができます。リピドミクスでは、トリグリセリドの構造は異性体構造によって異なることがあります。PASEFは、さまざまなフラグメンテーションパターンの可視化を可能にし、種の同定を改善します2。DIA-PASEFを使用すると、フラグメンテーションの増加により、DDA法の限界により通常は分解できない他のフラグメントと同様に、多くの異性体に関する情報が得られます。この情報は、蚊の卵巣にどのような脂肪酸が存在するかについての証拠を提供します。この方法は、多様な生物を対象とした他の de novo 脂質研究にも適用できます。
開示事項
Matthew WillettsとMelvin A. Parkは、timsTOF商用楽器のメーカーであるBruker Daltonics Inc.の従業員です。著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
著者らは、初期のメソッド開発における Cesar Ramirez 博士の貢献に感謝したいと思います。この研究は、NIAIDの助成金R21AI167849 FGNのプロジェクト22-21244S、チェコ科学財団、チェコ共和国からミネソタ州に資金提供されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| D-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | ||
| エッペンドルフチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| ガラスバイアル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11-417-236 | |
| 重水 (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| ポリプロピレン乳棒 | フィッシャーサイエンティフィ | BAF199230001 | |
| プロミネンス LC-20 CE 超高速液体クロマトグラフ | 島津 | L20234651907 | |
| シラン化ガラスインサート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 03-251-826 | |
| ショ糖-13C12 | シグマ-アルドリッチ | ||
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| チューニングミックス キャリブレーション標準 | Agilent Technologies | 36 |
参考文献
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).
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