「アバター」は、In vivo株と活性化を用いた実験を改変したex vivoワークループです

Summary

この記事では、実験室のげっ歯類の「アバター」筋肉を使用して、ひずみ過渡現象と筋力応答への活性化の寄与を評価するためのex vivoワークループ実験中にin vivo筋力生成をエミュレートする方法論について詳しく説明します。

Abstract

運動行動は、筋肉の力の生成と仕事の出力から生じる動的システムの創発的な特徴です。神経系と機械システムの相互作用は、ランニング中の脚の筋肉特性のチューニングから、地面と相互作用する手足のダイナミクスまで、生物学的組織のすべてのレベルで同時に発生します。動物が制御階層で神経制御戦略を内因性筋力学(「前屈」)にシフトする条件を理解することで、筋肉モデルはin vivoの筋力を予測し、より正確に機能するようになります。in vivoの筋力学を理解するためには、in vivoの移動運動と同様に、動的に変化するひずみや負荷条件下での筋力と働きをex vivoで調査する必要があります。In vivoのひずみ軌道は、通常、神経活性化、筋骨格運動学、および環境によって加えられる負荷の間の相互作用から生じる急激な変化(すなわち、ひずみおよび速度過渡現象)を示します。私たちの「アバター」技術の主な目標は、筋力の生成に対する固有の機械的特性の寄与が最も高い場合、ひずみ速度と負荷の急激な変化時に筋肉がどのように機能するかを調査することです。「アバター」技術では、従来のワークループアプローチを、動的な動きの中で測定されたin vivoのひずみ軌道と動物からの筋電図(EMG)信号を使用して修正し、複数のストレッチ短縮サイクルを通じてex vivoの筋肉を駆動します。このアプローチはワークループ技術と似ていますが、in vivoのひずみ軌道が適切にスケーリングされ、サーボモーターに取り付けられたex vivoマウスの筋肉に課される点が異なります。この技術により、(1)in vivoのひずみ、活性化、ストライド周波数、およびワークループパターンをエミュレートできます。(2)これらのパターンを変化させて、in vivoの力応答に最も正確に一致させます。(3)制御された組み合わせでひずみおよび/または活性化の特定の特徴を変化させて、メカニズム仮説をテストします。

Introduction

動く動物は、複雑な環境で持久力、スピード、敏捷性という印象的な運動能力を達成します。動物の移動は、人間が操作した機械とは対照的に特に印象的です-現在の脚のロボット、義肢、および外骨格の安定性と敏捷性は、動物と比較して劣ったままです。自然地形での脚付き移動には、予期しない摂動として機能する速度と操縦環境の特徴を変更するための正確な制御と迅速な調整が必要です^1,2,3,4.しかし、非定常移動の理解は、ダイナミクスが物理環境、筋骨格力学、および感覚運動制御^{1,2の間の複雑な相互作用に依存するため、本質的に困難です}。脚移動には、感覚情報の迅速なマルチモーダル処理と手足と関節の協調的な作動により、予期しない摂動に対応する必要があります^1,5。最終的に、動きは、筋骨格系の本質的な機械的特性を介して力を生み出す筋肉と、神経制御によって可能になります^1,5,6,7.神経力学の未解決の問題は、これらの要因がどのように相互作用して、予期しない摂動に応答して協調的な動きを生み出すかです。次の技術は、「アバター」筋肉を使用した制御可能なex vivo実験中に、in vivoひずみ軌道を使用して変形に対する筋肉の固有の機械的応答を利用します。

マッスルワークループ技術は、周期的な動きの間の内因性筋力学を理解するための重要なフレームワークを提供しました^8,9,10.従来のワークループ技術は、in vivo実験中に測定された周波数と活性化パターンを使用して、事前定義された(通常は正弦波)ひずみ軌道を通じて筋肉を駆動します^2,8,9,11。正弦波長の軌道を使用すると、環境や筋骨格運動学との相互作用により動物がひずみ軌道の急激な変化を受けない条件下で、飛行中の仕事と出力を現実的に推定できます^{12および水泳2。しかし、脚の移動中のin vivoでの筋緊張の軌跡は、神経活性化、筋骨格運動学、および環境によって加えられる負荷の間の相互作用から動的に発生します5,7,13,14。荷重、ひずみ軌道、および力の生成をエミュレートするには、in vivoの筋肉-腱ダイナミクスに対応し、摂動に直面して内因性の筋力学と神経制御がどのように相互作用して協調運動を生成するかについての洞察を提供する、より現実的なワークループ技術が必要です。}

ここでは、時間的に変化するin vivo負荷を表すin vivoひずみ軌道を持つ制御されたex vivo実験中に、実験室のげっ歯類の「アバター」筋肉を使用して、トレッドミル移動中のin vivo筋肉力をエミュレートする新しい方法を紹介します。制御された ex vivo 実験中に、標的の筋肉から測定された in vivo ひずみの軌跡を実験動物の筋肉に使用すると、移動中に経験する負荷がエミュレートされます。ここで説明する実験では、トレッドミルでの歩行、速歩、ギャロッピング中に、ex vivo マウス長指伸筋 (EDL) 筋を in vivo ラット内側腓腹筋 (MG) 筋の「アバター」として使用します¹³。このアプローチはワークループ技術と似ていますが、in vivoのひずみ軌道が適切にスケーリングされ、サーボモーターに取り付けられたex vivoマウスの筋肉に課される点が異なります。マウスのEDL筋は、ラットMGと比較してサイズ、繊維の種類、構造が異なりますが、これらの違いを制御することは可能です。「アバター」技術により、(1)in vivoのひずみ、活性化、ストライド周波数、およびワークループパターンをエミュレートできます。(2)これらのパターンを変化させて、in vivoの力応答に最も正確に一致させます。(3)制御された組み合わせでひずみおよび/または活性化の特定の特徴を変化させて、メカニズム仮説をテストします。

Protocol

すべての動物実験は、北アリゾナ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、60-280日齢の雄および雌の野生型マウス(B6C3Fe a/a-Ttn^mdm/J株)の長指伸筋(EDL)を使用しました。動物は商業的な供給源(資料表を参照)から入手し、北アリゾナ大学のコロニーに設立されました。

1. in vivo ひずみ軌道の選択とex vivoワークループ実験での使用準備

注:このプロトコルでは、著者(Nicolai Konow、UMass Lowell、私信)に直接提供されたin vivo動的移動からの事前測定が、ex vivo実験で使用されました。元のデータは、Wakeling et al.^{15 で収集されました}。プロトコルを複製するには、時間、長さまたはひずみ、EMG/活性化、および力のデータが必要です。

1. 任意のプログラミングプラットフォームを使用して、in vivo 試験全体を個々のストライドに分割します (MATLab コードは Suplementary Coding File 1 で提供されます)。
   1. in vivo 試験全体の長さの変化と時間をプロットします。これは、個々のストライド (スタンスからスタンス) を視覚化し、ストライド間の変動性を評価するために使用されます (図 1)。
   2. 試行全体のひずみを計算します(長さ(L)/最適長さL₀での最大等尺性力
   )。
   3. 試行全体から、すべてのストライドを表し、同じ長さで開始および終了するストライドを選択します。これは、各ストライドを比較するために、互いに重なり合った長さをグラフ化することで視覚的に行うことができます。
   4. 代表的なストライドを選択した後、任意のプログラミング プラットフォームを使用して、試験全体からひずみ、EMG/活性化、およびフォースのデータをセグメント化します (MATLab^{16 で使用されるコードについては、Supplementary Coding File 1 を参照してください})。
   5. サンプリング周波数がひずみ、EMG/活性化、または力で異なる場合は、データポイントを補間して、すべてが同じ周波数でサンプリングされるようにします。
      注:研究者は、試験全体でサンプリングされた各ポイント間の時間間隔に基づいて、キャプチャの頻度を決定できます。変数が同じ周波数でキャプチャされた場合、サンプリング時間は同じになります。
2. セグメント化されたストライドの頻度を計算します。
   1. セグメント化されたストライドの持続時間を秒単位で決定し、1 (秒) を持続時間 (1/持続時間 = # ストライド/秒) で割ることにより、度数を計算します。
   2. 周波数を一致させるためにex vivo実験で取得する必要があるデータポイントの数を手動で決定します。
   3. 2 ストライドに必要な時間を計算します。ストライドを少なくとも1回は繰り返して、筋肉の測定誤差を推定します。これは、その後の統計分析に必要になります。
3. 測定されたEMG活動を使用して、ひずみ入力に対する刺激の位相を決定し、ex vivoワークループの刺激の開始と持続時間を決定します。任意のプログラミングプラットフォームを使用できます(この研究で使用したコードについては、Supplementary Coding File 1を参照してください)。
   1. ひずみ変化と同じx軸範囲(時間)でEMG信号を表示します(図1)。EMG信号を拡大して見えるようにします。これは、EMG信号に任意の数を掛けたり、ひずみとEMGを同じスケールに再スケーリングしたり、EMG信号をひずみに追加したりすることで実行できます
      注:著者は、MATLabの「rescale」機能を使用して、ひずみとEMGを同じスケールに再スケーリングしました(補足図1を参照)。
   2. 2つの標準偏差の強度の変化で示されるように、EMG活動の開始と停止の場所を見つけます^17,18.
      注:動物や筋肉によっては、筋電図の発症が足の接触と一致する場合と対応しない場合があります(Monica Daley、UCアーバイン、パーソナルコミュニケーション)(ディスカッションのセクションを参照)。
   3. ひずみサイクルのパーセンテージを計算します(例:40%)EMG活性化の開始と刺激が発生する時間(例:222ミリ秒)
      注:研究者は、in vivo 移動ループと ex vivo ワークループで異なり、動物や筋肉ごとに異なる可能性のある興奮収縮結合 (ECC) 遅延を考慮する必要があります (たとえば、ラット MG の in vivo ECC は 24.5 ミリ秒、マウス EDL の ex vivo ECC は ~5 ミリ秒です)。
4. ワークループコントローラプログラムの代表的なひずみ入力を準備します。ひずみと刺激の入力で力の出力をキャプチャできる任意のプログラムは、ワークループコントローラープログラムに使用できます(ディスカッションセクションを参照)。
   1. 選択したストライドを取り、ステップをin vivo周波数で2サイクルキャプチャするために必要な適切なポイント数まで補間します(ステップ1.2を参照)。
   2. ストライドを再スケーリングして、「ゼロひずみ」(例:L₀または95% L₀)で開始および停止します。これは、事前に決められた長さのエクスカーションによるストレッチの後です（ステップ3.3を参照)。
   3. 「Scale」は、必要に応じて、マウスEDLのひずみ変化の入力として使用するストライドを選択しました(「ディスカッション」セクションを参照)。スケールするには、マウスEDLを損傷なく伸ばすことができる長さのエクスカーションを選択します(たとえば、in vivo種に関係なく、通常、マウスEDLを10% L₀伸ばします)。これは、予備的な結果に基づいて変更する必要がある場合があります(ステップ3.3を参照)。

図1:in vivo全試験の経時的な長さ。 ラットMGの時間に対してプロットされた長さ(mm)ストライドは、最短の長さから最短の長さまで、シングルストライドと見なされる円で区切られます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. ex vivoでのマウス筋の最大等尺性力の評価

1. 機器と手術のセットアップ.
   注:ex vivoワークループに必要な機器の説明については、ディスカッションのセクションを参照してください。
   1. 酸素チューブニードルバルブをウォータージャケットティッシュバスに挿入して、ティッシュオルガンバスを準備します(材料の表を参照)。酸素管を95%0_2-5%CO₂のガスボンベに接続します。20psiでウォータージャケットティッシュバスを満たします。
   2. 手術エリアの準備には、ガスラインから手術エリアの近くにあるクレブス・ヘンセライト溶液で満たされた結晶化皿(ステップ2.1.3)に追加の酸素チューブを流します。これは、手術中および手術後に筋肉を通気し、水分補給するために使用されます.
      注:一度に複数の筋肉をマウスから取り出す場合、筋肉はこの曝気溶液に最大4時間保存することもできます。
   1
   3. LのKrebs-Henseleit溶液を調製します(mmol ^l-1):NaCl(118)。KCl(4.75);MgSO₄(1.18);KH₂PO₄ (1.18);CaCl₂ (2.54);グルコース(10.0)を室温でpH7.4にHClとNaOHを使用して(材料の表を参照)。HClおよびNaOHを取り扱うときは、ゴーグルと手袋の適切なPPEを着用してください。
   4. 室温、pH 7.4のクレブス・ヘンセライト溶液を浴槽に充填します。筋肉とフックを溶液に完全に浸します。
   5. デュアルモードマッスルレバーシステム、スティミュレータ、信号インターフェース(DAQボード)など、すべての機器の電源を入れます(資料の表を参照)。
2. EDL筋解剖。
   1. マウスに深く麻酔をかけた後、頸部脱臼による安楽死を行います。マウスを右または左の横臥位に置き、上肢の後肢を伸ばし、つま先を解剖ボードに触れます。足首から膝関節の上まで毛皮を取り除きます。
   2. 鉗子で皮膚をテント張り、足首の関節から股関節部分まで切ります。筋肉が露出したら、ズボンの「裾」のように足首の周りを切ります。皮膚を引き上げると、脚の筋肉がよりはっきりと露出します。
   3. 前脛骨筋(TA)と腓腹筋を分離する筋膜線を見つけ、解剖ハサミを使用して分離して膝腱を露出させます。露出した2つの膝腱の間に解剖ハサミを置きます。はさみは露出した膝の腱のすぐ下のポケットに「引っ掛かり」ます。ブラントは、「ポケット」を解剖し、ハサミを脚から引き離し、ハサミが足首に到達してEDLを露出させます。
   4. サイズ4-0のシルク外科用縫合糸(材料の表を参照)の事前に結ばれたループノットを使用して、縫合糸の一方の端を膝に最も近い腱の下にひもで締めます。近位筋と腱の接合部の上に二重の四角い結び目を結び、筋肉に置かず、腱を含めないようにします。結び目の上に切ります。腱に結ばれたループをそっと引っ張ると、「ポケット」からEDLが出ます。
   5. ループを解剖領域にテープで固定し、EDLに張力を発生させます。遠位筋腱接合部で別の事前に結ばれたループノットを使用して、二重四角結びを筋肉に置かず、腱を含めずに結びます。脚に近い側の結び目を切って、マウスからEDL全体を取り外します。筋肉の近位側と遠位側の二重四角結び目から余分な縫合糸を切り取り、手術部位のそばの通気槽に筋肉を置きます
      注:筋肉を通気浴に入れる場合は、どちら側が近位および/または遠位にあるかに注意してください。
   6. サーボモーターレバーリグに配置するには、吊り下げられた白金電極の間にEDLを垂直に取り付けます。遠位ループノットを固定フックに取り付け、近位ループノットをサーボモーターアームに取り付けられたフックに取り付けます。ティッシュバスを上げて、通気されたクレブス・ヘンセライト溶液に筋肉を沈めます.
      注:曝気は、筋肉が水没したときに筋肉を乱してはなりません。その場合は、ガスの圧力を下げてください。刺激を開始する前に、筋肉を10分間平衡させます。
3. EDL筋の最大等尺性力を測定します.
   注:Twitchと破傷風を使用して最大等尺性力を測定する方法のプロトコルについては、表1を参照してください。著者が使用したプログラムの図については、補足図1を参照してください。
   1. 手術中に筋肉が損傷を受けないように、最大限に筋肉を刺激する(80 V、1 pps、1ms;テーブル 1;補足図2を参照)。損傷が発生していない場合は、マッスルレバーシステムの長さノブを使用して、アクティブテンションが~1V / 0.1271Nで、パッシブテンションが~0.1V / 0.01271N未満のトゥイッチ刺激を使用して筋肉の長さを見つけます。
   2. 縫合糸の結び目から縫合糸の結び目までの筋肉の開始長さをボルトとミリメートルで記録します。開始長さのプログラムのキャリブレーション部分に測定値を入力します(補足図1を参照)。
   3. EDLの最適な長さ(L₀)における超最大twitchの最大等尺性力を求めます(表1)。技術的には休息時間は必要ありませんが、刺激の間に1分待つことで受動的な緊張が安定します。最大超けいれんが最大になる長さ(ボルト単位)を記録します。これは、けいれんに最適な筋肉の長さ(L₀)です。
   4. この長さでキャリパーで筋肉を測定します。縫合糸の結び目から縫合糸の結び目までの筋肉を測定します。L₀が見つかったら、筋肉を開始の長さ(アクティブテンション~1V / 0.1271 N)に短縮します。
   5. EDLの超最大破傷風最大等尺性力を求めます(80 V、180 pps、500 ms;表 1)。L₀ での超最大破傷風力の長さ (ボルトとミリメートル) を記録し、縫合結び目から縫合結び目までの繊維を再びキャリパーで測定します。
      注:筋肉の長さを0.5 V / 0.65 mm刻みで増やすと、けいれんと破傷風の両方でより正確なL₀が得られます。
   6. EDLの最大以下の等尺性力を求めます(45 V、110 pps、500ms;表1)実験の前後のL₀で、刺激プロトコルから疲労が発生しなかったことを確認します。力が10%減少すると、「疲労した」筋肉と見なされます。

します

実験			シミュレーション強度(V)		パルス周波数(pps / Hz)		刺激時間(ミリ秒)		コメント
1. "ウォームアップ"			80		1		1		長さを0.50 V増減して、1 Vのパッシブテンションを見つけます
2. 最適な筋長のけいれん (L0)			80		1		1		長さを0.50 V増減して、~1 Vのパッシブテンションを見つけます
3. 最適な筋肉長破傷風 (L0)			80		180		500		0.50 Vずつ長さを変更する間に3分間休憩
4. 実験前のサブマキシマルL0			45		110		500		L0の長さで
6. アバター実験			45		110				マウスEDLの代表的な長さの変更を周期的に使用します
7. 実験後のサブマックスL0			45		110		500		実験後にL0に戻り、L0を測定します

表1:刺激プロトコル。 最大上および最大下単収縮および破傷風の最適な長さを見つけるための刺激プロトコル。プロトコルは、刺激強度、タイミング、およびパルス/秒によって異なります。

3. 選択したin vivoひずみ軌道を用いた「アバター」ワークループ技術の完成

1. 「アバター」のワークループ技術を完成させるために必要なソフトウェアをセットアップします(資料の表を参照)
   注:各時間ステップで筋肉の長さを指定する入力ファイル(.csvまたは同様のファイル)が必要です(ステップ1.4を参照)。刺激が開始されるサイクルの割合と刺激の持続時間に対する入力が必要です(たとえば、補足図3を参照)。
2. 「アバター」ワークループテクニックを完成させる.
   注:カスタムLabViewプログラムを使用していますが、研究者は、サーボモーターレバー上のマウスEDLの長さ変化の制御、指定された時間での刺激の開始(%サイクル)と持続時間(ms)の制御、および筋力の測定を可能にする任意のプログラムを使用できます。作成者が使用するプログラムの図については、補足図 3 を参照してください。
   1. スケーリングされたひずみの変化とスケーリングされた長さのエクスカーションを、ステップ1.4からプログラムにアップロードします。「スケーリングされたひずみの変化」の詳細については、手順1.4、3.3、およびディスカッションのセクションを参照してください。
   2. 必要に応じて、マッスルの開始長さを調整します(セクション3.3を参照)。開始長さをVとmmで入力して、結果を校正します(補足図3を参照)。
   3. ステップ1.3で計算された刺激の開始と持続時間を使用します。
   4. スケーリングされた長さの変化に筋肉を通し、決定された長さのエクスカーションを2サイクル実行します。
   5. データを保存します。同じ筋肉に複数の刺激プロトコルが集まっている場合は、各刺激の間に3分待ちます。
   6. 最大以下の活性化を使用して最適な長さ(L₀)で刺激し、疲労が発生したかどうかを判断します。.力が10%以上減少すると、筋肉は疲労していると見なされます。刺激プロトコルについては、表1を参照してください。
   7. お風呂から筋肉を取り除きます。筋肉から結び目をカットループし、余分な溶液を筋肉から軽くたたきます。筋肉の重さを量ります。標準式を使用して生理学的断面積を決定します:筋肉量/(L₀*1.06)¹⁹。
3. 「アバター」作業ループ手法のパラメーターを調整します (ディスカッションのセクションを参照)。
   1. ex vivo の受動的な張力上昇を in vivo で観察された受動的な張力上昇に一致させることにより、開始長さと長さのエクスカーションを決定します (図 2).
      注:この研究では、開始長さ(mm)とエクスカーション(%L₀;ステップ1.4およびディスカッションセクションを参照)をスケーリングするためにパーセントL₀を使用しました。ex vivoマウスEDLのテンション上昇をin vivoラットMGのテンション上昇と一致させるため、著者らは、L₀の開始長さが最適な適合をもたらすことを発見しました（図2)。
   2. 開始長さを 3 つ選択します (例: -5% L₀、L₀、+5% L₀)。これらの開始長さのそれぞれで、指定された長さのエクスカーション(例:10%L₀)で「アバター」ワークループを実行します。
      注:マウスEDLを使用した現在の「アバター」実験では、10%L₀の長さのエクスカーションが使用されました。
   3. ex vivo の受動的な張力上昇の速度が in vivo の受動的な張力の上昇速度と同程度になるまで、新しい開始長さおよび/またはエクスカーションで繰り返します (図 2B 図 2B を参照)。
   4. 繊維の種類と使用する筋肉の活性化ダイナミクスに応じて、刺激の持続時間を増減して、ex vivo と in vivo の力の一致を最適化します。したがって、「アバター」実験中に、刺激の開始および/または持続時間をin vivoの力産生に最も適合するように変更する必要があるかもしれない。
   5. これが必要かどうかを判断するには (ディスカッションのセクションを参照)、"アバター" と in vivo の筋肉の経時的な力 (図 3) をプロットし、目標と "アバター" の筋力の間のスケーリングされた相関関係を 2 乗して決定 R² の係数を計算します (代表的な結果を参照)。

図2:一致するパッシブテンションの上昇。 受動的張力のin vivoおよびex vivoの上昇を示すワークループ(矢印)。ラットMG(黒)が2.9Hzで歩行する様子のin vivoスケールワークループ(Wakeling et al.^{15のデータ})。2.9 HzでのマウスEDL(緑)からのex vivoスケールワークループ(A)マウスEDL筋の開始長さは+5%L₀です。(B)マウスEDL筋の開始長さは_L0です。ex vivo 受動的張力上昇は、A の in vivo 張力上昇と一致しますが、B では一致しないことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ラットMGのin vivo力に一致するようにマウスEDLの刺激時間を最適化します(黒線)。 EMGベースの刺激(緑の破線)を使用してマウスEDLによって生成される力は、in vivoの力よりも早く減少しますが、これはラットMGと比較してマウスEDLの早期不活性化によるものと考えられます。in vivo と ex vivo の力の適合を最適化するために、マウスの EDL をより長い時間刺激しました (緑色の実線)。EMGベースの刺激R² = 0.55、最適化された刺激R² = 0.91。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Results

「アバター」実験の目標は、ex vivoワークループ実験中に、in vivoの力の生成と仕事の出力をできるだけ忠実に再現することです。この研究では、マウスEDLとラットMGの両方が主に速筋で構成されているため、マウスEDLをラットMGの「アバター」として使用することを選択しました^20,21。両筋肉は足首関節の主要な可動器(EDL足首背屈筋、MG足首足底屈筋)で、ペネーション角度はほぼ同じです(マウスEDL 12.4 + 2.12°²²、ラットMG 20°、この研究で使用した¹⁵)。ラットMG^{15のスケール化された代表的な作業ループ}を、2つの異なる刺激プロトコル(1つは測定されたEMG活性から、もう1つはステップ3.3のように最適化)を使用して、ex vivoの「アバター」実験（図4)と...

Discussion

生物は風景をシームレスに移動しますが、筋肉が経験する根底にある負荷と緊張は劇的に異なります^1,6,23。生体内移動^1,24と「アバター」実験の両方で、筋肉は周期的で非定常な条件下で最大以下で刺激されます。等尺性力と長さの関係と等張力と速度の関係は、これらの条件下での筋力の予測にはあまり適していません²。非定常ひずみ(つまり、過渡現象)と荷重の影響を理解することは、in vivo移動中の力の生成を予測するために不可欠であり、したがって、これらの「アバター」実験を開発する主な理論的根拠^です2。「アバター」実験では、力出力を測定しながら、筋肉の負荷とひずみの軌跡を制御できます。「アバター」技術は、神経制御と腱コン...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
編組非吸収性シルク縫合糸4-0	マーシルク	734H
塩化カルシウム二水和物 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	1086436	Krebs-Henseleit 溶液
デキストロース	シグマ・アルドリッチ	D9434	クレブス・ヘンセライト ソリューション
HEPES	Sigma-Aldrich	PHR1428	Krebs-Henseleit 溶液
水糖酸(HCl)	シグマ・アルドリッチ	1.37055	クレブス・ヘンセライト ソリューション
LabViewデータ収集	Lab-View
硫酸マグネシウム (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Krebs-Henseleit 溶液
塩化カリウム(KCl)	シグマ・アルドリッチ	P3911	クレブス・ヘンセライト 溶液
リン酸カリウム 一塩基性 (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	5.43841	Krebs-Henseleit ソリューション
S88刺激装置	グラス	M643H05	Ebay
シリーズ300Bレバーシステムで	オーロラ	1200A	は、ウォータージャケットティッシュバス
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Krebs-Henseleit 溶液
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・アルドリッチ	S9888	クレブス・ヘンセライト 溶液
水酸化ナトリウム(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Krebs-Henseleit 溶液
野生型マウス	ジャクソン研究所	B6C3Fe a/a Ttn mdm/J