タイル/SED/アレイインターフェースを用いたマルチプレックスイオンビームイメージング顕微鏡における組織マイクロアレイおよびタイル状領域イメージングの迅速なセットアップ

Summary

多重化イオンビームイメージング(MIBI)は、組織マイクロアレイやタイル状の連続した組織領域のイメージングによく使用されますが、これらの実験を設定するための現在のソフトウェアは煩雑です。タイル/SED/アレイ・インターフェースは、MIBIランのセットアップを劇的に簡素化し、加速するために開発された、直感的でインタラクティブなグラフィカル・ツールです。

Introduction

マルチプレックスイオンビームイメージング(MIBI)は、最大250 nmの分解能^1,2,3で組織組織切片上の40+タンパク質を同時にイメージングする技術です。同位体純度の元素金属でタグ付けされた抗体を用いて組織組織切片を染色した後、MIBI装置は二次イオン質量分析を行い、組織上の個々のスポットにおけるすべての同位体、したがってすべての40+抗原の発現を同時に定量します。何百万ものスポットのグリッドにわたって実行される、結果として得られるタンパク質発現の40+プレックス画像は、空間的文脈1,2,3,4を維持しながら、細胞境界の描写と特定の細胞タイプの同定を可能にします。この手法は、腫瘍に対する免疫応答、感染性病原体によって引き起こされる組織炎症、認知症の神経病理学、および妊娠中の免疫寛容を調べる一環として、約20の施設で数百人のユーザーによって使用されてきました5,6,7,8,9^、10,11.

MIBI装置の操作における主なボトルネックは、イメージングのために視野(FOV)を設定することです - 200 x 200 μm² から800 x 800 μm² つの領域 - イメージングのために。MIBIは、一度に1つのFOV(最大800 x 800 μm²)を画像化するため、より広い領域をイメージングするには、複数のFOVをつなぎ合わせる必要があります。組織マイクロアレイ( 例えば、図1Aの8つの円形組織)のイメージングには、間隔を空けて複数のFOVを配置する必要があります。FOVを設定するために、メーカーのインターフェースは、1)指定された画像座標にほぼ対応する十字線を持つスライドの光学カメラ画像(図1A)と、2)座標の正確な領域を示す二次電子検出器(SED)画像を提供し、報告されている精度は0.1μm以内です(図1B)。まず、ユーザーは光学画像を使用して 1 つの FOV を大まかに配置します。画像の解像度はピクセルあたり約60μmしかないため、配置が2ピクセル(2ピクセル×60μm/ピクセル)ずれている場合、標準の400μmのFOVは30%ずれます。したがって、ユーザーはSED画像を使用して位置を微調整する必要があります-複数のポップアップウィンドウを含む12のステップの面倒なシーケンス、テキストボックスに座標を入力し、方向制御ボタンでSEDをゆっくりと動かす、さらには紙に座標を書き留めることさえあります(補足図1)。このプロセスは、100+コア組織マイクロアレイ(TMA)の各スポットに対して繰り返す必要があります。いくつかのサードパーティツールは、最初の大まかな位置決め¹²を助けることができる。ただし、それでもある程度のプログラミング知識が必要であり、最終的な位置決めは12ステップのプロセスを通じて行われます。また、隣接するFOVのグリッドを配置するのも非常に面倒で、後でそれらをつなぎ合わせてタイル状のパノラマ画像にします。

そこで、タイル/SED/アレイインターフェース(TSAI)は、直感的でインタラクティブなグラフィカルインターフェースを使用して、ユーザーが多数のFOVを迅速に配置できるようにすることを目的として開発されました。TSAIは、1)TMAポイントと組織タイルを迅速に配置するためのWebベースのグラフィカルユーザーインターフェース(Web UI)と、2)タイルSED画像を生成してFOV位置を調整するためのMIBIユーザー制御インターフェースへの統合の2つの主要なコンポーネントで構成されています。光学画像のみを使用する場合、多くのFOVを大まかに配置し、FOVナビゲーション/調整ツールを使用してすばやく調整できます(図2、TSAI、左ブランチ)。ただし、SEDタイリングを実行すると、SEDモードでさらに調整しなくても、FOVをタイル化されたSED画像に正確に配置できます(図2、TSAI、右の分岐)。現在数百人のMIBIユーザーにとって一般的な関心事であるこれらのツールにより、初心者でもタイリングとTMAのポジショニングが非常に簡単になり、複雑なMIBI実行のセットアップが数時間から数十分に短縮されます。

Protocol

1. TSAIの積載

1. MIBIユーザー制御コンピューターのWebブラウザで https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai を開いてTSAIを実行します。
   1. このTSAIのインスタンスには、すべてのインストゥルメントに適用されるわけではないカスタムプリセットが含まれています。これを使用する場合は、以下のステップ 2.6 で生成されたテンプレート FOV からのみタイルを構築します。TSAI は Web ブラウザー内でローカルに実行され、画像、.json、またはファイル名のデータはサーバーに送信または保存されません。
2. または、任意のWebサイトでTSAIをセットアップし、任意のインストゥルメントのカスタムプリセットを使用します。
   1. https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai に移動し、mibi_tsai_standaloneディレクトリをダウンロードします。または、Supplementary Coding File 1 .zip ファイルをダウンロードし、その内容を mibi_tsai_standalone というタイトルのディレクトリに解凍します。
   2. 任意のテキストエディタでmibi_tsai_standalone/_resources/index.jsを開きます。
   3. 必要に応じて、FOV サイズ、滞留時間/タイミングの選択、ラスター サイズ、FOV JSON、および推奨されるプリセット設定をindex.js器の設定に合わせて編集します。これは主にカスタマイズされた計測器に適用されますが、滞留時間/タイミングの選択ペアは、いずれにしてもチェックする必要があります。index.jsを保存します。
   4. インターネット経由でアクセス可能な任意のWebサーバー(研究室のWebサイトや大学がホストするWebサイトなど)にmibi_tsai_standaloneをアップロードします。
   5. mibi_tsai_standalone/index.html を web MIBIユーザーコントロールコンピュータのブラウザ。

2. MIBIスライドのロードとテンプレートファイルの作成

1. WebブラウザでMIBI実験トラッカー(スキャン関連のメタデータを管理するためのメーカー提供のWebインターフェイス)にログインします。
2. 「 スライド」 タブで、新しいスライドを追加し、新しいセクションを追加します (補足図 2A-B)。 「リソース 」タブで、マーカーパネルを選択または作成します(補足図2C)。
3. 「セクション」タブで、新しいセクションをパネルに追加します(補足図2D)。
4. MIBIのユーザー制御インターフェースにログインします web ブラウザ。 「Exchange Sample 」をクリックし、新しいスライドを選択して、MIBI スライドをロードします (補足図 3A)。
5. テンプレート FOV を作成するには、[Add FOV ] (補足図 3B) をクリックし、フレーム ディメンション、FOV サイズ、滞留時間、イメージング モード、およびセクション ID を設定します。
6. FOV リストを .json ファイルにエクスポート (ダウンロード) します (補足図 3C)。光学イメージを.pngファイル(補足図3D)としてダウンロードします。

3. 光学画像ステージモータの共レジストレーション

1. TSAI Web UIをWebブラウザで開きます。以前に同時登録を実行していない場合は、光的同時登録メニューが自動的に開きます。実行済みで適切な場合は、これらの手順を繰り返さないでください。
2. [光共登録] メニューを開きます。[Copy Automatic Coregistration Code to Clipboard] をクリックします (補足図 4A)。
3. MIBIでMIBIユーザー制御インターフェースを開きます web ブラウザ。 Ctrl+Shift+J を押してブラウザコンソールを開くか、ページを右クリックして [Inspect] をクリックし、[ Console ] タブを開きます (補足図 4B)。
4. コードをコンソールに貼り付けて 、Enter キーを押します。コンソールに生成されたリンクをクリックします (補足図 4C)。これにより、同時登録が TSAI Web UI に読み込まれ、Cookie として保存されるため、同時登録は保持され、機器のハードウェアに変更がない限り繰り返す必要はありません。

4.タイルSEDスキャン

1. 手順2.6の光学イメージ.pngファイルと.jsonファイルをTSAI Web UIにドラッグアンドドロップしてロードします。
2. SEDタイラーメニューを開き、一番上の行のテキストボックスをクリックします(補足図5A)。
3. 光学画像をクリック(±ドラッグ)して、SEDスキャンの左上隅を選択します(補足図5B)。
4. Dキーを押すか、SEDタイラーメニューの2行目にあるテキストボックスをクリックします。
5. 光学画像をクリック(±ドラッグ)して、SEDスキャンの右下隅を選択します。
6. SEDタイラーメニューで、[SEDスキャンとシフト修正コードをクリップボードにコピー]をクリックします(補足図5C)。
7. MIBIでMIBIユーザー制御インターフェースを開きます web ブラウザ。コードをコンソールに貼り付けて 、Enter キーを押します (補足図 5D)。
8. QC-300μm設定でMIBIをSEDモードにし、取得されない領域に移動し、ゲイン、フォーカス、スティグメーションを調整します。
   1. ゲインを変更せずにSED画像の明るさとコントラストを調整します。 B を押して明るさを上げるか、 Shift + B を押して明るさを下げます。コントラストを上げるには C を、コントラストを下げるには Shift+C を押します。 Shift + V を押して、明るさとコントラストの両方をリセットします。
9. Shift+T を押して、タイル化された SED スキャンを開始します。
10. 完了すると、タイル化されたSEDイメージの新しい.pngファイルが自動的に保存されます(図3)。ファイル名の先頭に文字を追加できますが、ファイル名の他の部分は変更されません。
11. 特定のタイルに焦点が合っていない場合や、不適切にスキャンされている場合は、再スキャンします。
    1. Shift+R を押して、再スキャン キューにタイルを追加します。ダイアログ ボックスが開き、タイルの行と列の入力を求められます。数値はゼロインデックスであるため、8,0 は 9 行目 (最初の列) に入力されます。
    2. 関連するすべてのタイルをキューに追加したら、 Shift + T を押して再スキャンします。完了すると、タイル化されたSEDイメージの新しい.pngファイルが自動的に保存されます。
12. 重要なステップ:タイル張りのSEDスキャンに大きなミスアライメントがないか調べます(図3C-D)。存在する場合は、製造元のサポートに連絡してモーターとイメージングビームを調整するか、手順4.12.1から4.12.9(補足図6A)のキーボードコントロールを使用して手動ソフトウェア修正を試みます。
    1. SEDステージのモーターアライメントを確認するには、スライドのティッシュのない領域に移動します。 Shift+5 を押すと、5 つの 400 μm FOV が市松模様に書き込まれます (補足図 6B-C)、 Shift+9 キーを押すと、400 μm 視野の 3 x 3 パターンが書き込まれます (補足図 6D-E)。
    2. FOV 列が離れすぎている場合は、 1 を押して x f(x) 値を負の 10 進数 (通常は -0.0025 から -0.1 の間) に設定します。
    3. 3 行目の FOV が 1 行目の FOV に対して左にシフトしている場合は、 2 を押して x f(y) 値を正の 10 進数 (通常は 0.0025 から 0.1) に設定します。
    4. 3 列目の視野が 1 列目の視野に対して下向きにシフトされている場合は、 3 を押して y f(x) 値を負の 10 進数 (通常は -0.0025 から -0.1) に設定します。
    5. FOV 行の間隔が離れすぎている場合は、 4 を押して y f(y) 値を負の 10 進数 (通常は -0.0025 から -0.1) に設定します。
    6. チェッカーボードと3 x 3のパターンがほぼ直線のグリッドを形成するまで、手順4.12.1から4.12.5を繰り返します(補足図6C、E)。
    7. S キーを押すと、ファイル名に補正値を含むパターンの.png画像が保存されます。
    8. この.pngファイルをTSAI Web UIにドラッグアンドドロップして、値をロードし、ブラウザのCookieに保存します。
    9. タイルSEDスキャンを実行して係数を確認します。ステップ 4.12.2 から 4.12.5 と同じ原則に基づいて、係数をさらに調整して、タイル化された SED 画像のミスアライメントを修正します。
13. タイル SED が適切な場合は、 Esc キーを押します。TSAI Web UI に戻ります。
14. タイル化された SED .png ファイルを TSAI Web UI にドラッグ アンド ドロップします (補足図 5E)。
15. [SED]タブをクリックして、ズームを調整します(補足図5F)。
16. 画像の明るさやコントラストを調整したり、線の太さやカーソルサイズなどの描画オプションを調整するには、SED画像の上にあるスライドオプションメニューを使用します。
17. キーボードショートカットが利用可能で、ほとんどの場合、画像コントロールの横に表示されます:ズームインするには Z を、ズームアウトするには Shift+Z を押します。明るさを上げるには B を、 下げるには Shift+B を押します。 C キーを押してコントラストを上げるか、 Shift+C を押してコントラストを下げます。 Shift + V を押して、明るさとコントラストの両方をリセットします。 L を押して、タイルの上のラベルを切り替えます。 O を押すと、フォーカスサイトの周りに描かれた半径5mmの円が切り替わります。

5. 組織マイクロアレイ(TMA)

1. TMA スポットのグリッドに FOV を設定する場合は、最初にレプリケートする FOV のパターンを設定します。[タイル]列の関連タイルで、列と行を調整し(図4A)、マップのチェックボックスをオン/オフにします(図4B)ほか、必要に応じて他のFOV設定を調整します。
2. 関連するタイルで、[ TMA ] をクリックして [TMA] オプション メニューを開きます (図 4C)。TMA スポットの行数と列数を設定します (図 4D)。必要に応じて、命名接頭辞を追加し (図 4E)、開始行と列の番号付けを編集します (図 4F)。
3. スライド画像で、TMAの四隅をクリックします(図4G-J)。丸で囲まれた角をクリックしてドラッグし、TMAスポットに最も一致するように十字線の位置を調整します。
4. TMA オプションメニューから [TMA のビルド ] をクリックします (図 4K)。
5. タイル列の各タイルにカーソルを合わせると、その位置を確認できます。調整するには、[ 移動 ]をクリックします(図4L)。次に、スライド画像をクリックしてドラッグするか、キーボードの矢印キーを押します。
   1. Shift キーを押しながら矢印キーを押すと、より遠くまで移動できます。Altキー(Windows)またはOptキー(Mac)を押しながら矢印キーを押すと、移動距離が短くなります。
   2. [移動] を選択した場合は、 T キーを押してタイル名の横にあるチェックボックスをオフにし、タイルをビューから削除し、その後生成される .json ファイルから除外します。または、マウスで直接チェックボックスをオフにするか(図4M)、 Deleteをクリックして完全に削除します。
   3. [移動] を選択したら、2、4、または 8 を押して FOV サイズをそれぞれ 200 μm、400 μm、または 800 μm に設定すると、ラスタの寸法は、イメージング解像度が変わらないように比例してスケーリングされます。
   4. 移動が選択されている場合、 A を押して前のタイルに移動するか、 D を押して次のタイルに移動します。
   5. 他のタイル設定を調整するには、[≡] ボタンをクリックして設定メニューを展開します (表示されていない場合)。

6.エリア/ポリゴンタイル

1. 組織の連続した領域をカバーするようにFOVを設定する場合は、まず、タイル列の関連するタイルで必要に応じてFOV設定を調整します。
2. 該当するタイルで、[ポリゴン] をクリックします (図 5A)。スライド画像をクリックして、タイル化する領域の頂点/角を設定します(図5B-C)。ダブルクリックしてポリゴンを閉じ、エリアを FOV で覆います (図 5D)。
3. [タイル] 列の一番下までスクロールし、新しい多角形タイルの [≡] ボタン (展開すると ^ 、 図 5E) をクリックして、タイル マップを表示します。
4. タイルマップをクリックするか(図5F)、クリッカーをクリックしてスライド画像内のタイル化されたFOVをクリックして、個々のタイルのオンとオフを切り替えます。
5. 複数のFOVをオフにするには、[ Eraser ]をクリックし、スライド画像内のタイル化されたFOVをクリックしてドラッグします(図5H)。
6. 複数のFOVを切り替えるには、 Clicker (図5G)をクリックし、タイルマップで覆われたスライド画像の空の領域をクリックしてドラッグします。
7. 上記の行を挿入するには、▲ボタンをクリックします(図5I)。左側に列を挿入するには、◄ ボタンをクリックします (図 5J)。
8. タイルの位置を調整するには、[ 移動 ] をクリックします (図 5K)。次に、スライド画像をクリックしてドラッグするか、キーボードの 矢印キーを押すか、手順 5.5.1 から 5.5.5 で説明されている他のコントロールを使用します。

7.FOVナビゲーションと調整

1. SEDタイリングの位置がずれている場合、または光学画像の十字線が実際のステージモーター位置を反映していない場合は、以下のキーボードコントロールを使用して、MIBIユーザーコントロールインターフェイスのSEDモードでFOV位置を調整します。
2. スライド(光学式またはSED)画像の下にあるFOVナビゲーション/調整メニューを開きます。[ FOV ナビゲーション コードをクリップボードにコピー] をクリックします。
3. MIBIでMIBIユーザー制御インターフェースを開きます web ブラウザ。MIBIをSEDモードにし、ゲイン、フォーカス、スティグメーションを調整します。
4. Ctrl+Shift+J を押してブラウザー コンソールを開くか、ページを右クリックして [検査] をクリックし、[コンソール] タブを開きます。
5. コードをコンソールに貼り付けて 、Enter キーを押します。コードは、MIBIユーザー制御インターフェイスのSEDイメージに表示される最初のFOVと正確なFOV位置に自動的に移動します。
6. ゲインを変更せずにSED画像の明るさとコントラストを調整します。 B を押して明るさを上げるか、 Shift + B を押して明るさを下げます。コントラストを上げるには C を、コントラストを下げるには Shift+C を押します。 Shift + V を押して、明るさとコントラストの両方をリセットします。
7. SED倍率を調整するには、 M (200μm)、 ( 400μm)、 . (800μm)、 または/ (最大)キーを押します。
8. FOVを移動するには、キーボードの 矢印 キーを押します。 W を押して位置を保存します。 Shift キーを押しながら矢印キーを押すと、より遠くまで移動できます。 Alt キー(Windows)または Opt キー(Mac)を押しながら矢印キーを押すと、移動距離が短くなります。移動できるのは、任意のタイルの R1C1 のみであることに注意してください。
9. FOVのオンとオフを切り替えるには、 Tを押します。FOVサイズを変更するには、 2 (200μm)、 4 (400μm)、または 8 (800μm)を押します。ラスターのディメンションは、イメージング解像度が同じままになるように比例してスケーリングされます。
10. SED画像とオーバーレイされた十字線の画像ファイルを保存するには、Sキーを押します。調整の下書きを.txtファイルに保存するには、 X キーを押します。
11. 問題がなければ、 D を押して次のFOVに移動するか、 A を押して前のFOVに戻ります。すべてのFOVについて、手順7.6から7.11を繰り返します。
12. すべてのFOVが終了したら、 X または Escapeキーを押します。調整は.txtファイルに保存され、クリップボードにコピーされます。
13. TSAI Web UI に戻ります。.txtファイルをTSAI Web UIにドラッグアンドドロップするか、FOVナビゲーション/調整メニューのテキストボックスに調整を貼り付けます。
14. [調整] をクリックして、[タイル] 列のタイルに調整を適用します。

8. JSONファイルの生成とインポート

1. [タイル] 列の下の [出力] で、タイルのリストと推定実行時間を確認します (補足図 7A)。
2. 「グループ」で、FOV グループ化のオプションを選択します (補足図 7B)。グループ化は、順番に並べられた .json ファイルには影響しません。
   1. ランダム化された .json ファイルの場合、FOV をタイルごとにグループ化すると、タイルがランダムな順序であっても、特定のタイル内のすべての FOV が一緒に留まるように FOV が順序付けられます。
   2. ランダム化された.jsonファイルの場合、 グループ化しない FOV は、異なるタイルの FOV が混在するように FOV をランダムに順序付けします。
   3. 実行中のオートフォーカスが指定されている場合、FOV は最も近いオートフォーカス サイトによって自動的にグループ化されます。
3. [分割] で、複数の .json ファイルに分割するオプションを選択します (補足図 7C)。
   1. 分割しない は、すべてのFOVを1つの.jsonファイルのみに保持します。
   2. Split by every # FOVsは、FOVを複数の.jsonファイルに分割し、各ファイルには指定された数のFOVが含まれています。
   3. Split by every # hours # minutes は、FOV を複数の .json ファイルに分割し、各ファイルの推定実行時間はおおよそ指定された時間です。
4. .jsonファイル内のFOVの順序を表示および並べ替えるには、[並べ替え]メニューを開きます(補足図7D)。FOVを移動するには、FOVをクリックして目的の位置にドラッグします。他の FOV は、ドラッグされた FOV の周りをインタラクティブに再配置されます。
5. .jsonファイルを保存するには、再配置メニューの下にある FOV ボタンをクリックします。シーケンシャル.jsonでは、FOV がタイル、行、列の順に並べられます (補足図 7E)。ランダム.jsonは、ステップ8.2(補足図7F)で選択したグループ内のFOVをランダム化します。
6. FOVと適用された表示オプション(タイルラベル、明るさ、コントラストなど)を含む組織の画像を保存するには、[ タイル画像の保存 ](補足図7G)をクリックします。これは、多くの場合、記録を保持したり、共同作業者と共有したりするのに役立ちます。
7. MIBI ユーザー制御インターフェイスに戻ります。[ FOV のインポート ] をクリックし、生成された .json ファイルを選択します。必要に応じてフォーカス、スティグメーション、電流を調整し、[ 実行の開始]をクリックします。

Results

TSAI には、FOV を設定するための 2 つの方法が用意されています (図 2)。1つは光学画像(図2、TSAI、左枝)のみを使用し、他の既存の方法と同様に使用します。2 つ目の方法であるタイル化された SED イメージの生成は、TSAI に固有のものです (図 2、TSAI、右の分岐)。TSAIはこの画像にFOVを正確に描画するため、メーカーのインターフェースSEDモードでFOVを所定の位置に押し込むのに何時間も費やす必要がなくなります。ただし、SEDタイリングの補正係数を適切に設定しないと、結果のFOV位置が正確でなくなる可能性があります。

SEDタイリング係数は、サイズが1.5 cm以上の大きな組織切片のタイルSEDスキャンを検査することで評価できます(ステップ4.1から4.11)。適切なセットアップの期待される結果は、隣接するタイル間の組織内のミスアライメントが最小限に抑えられた画像です(図<...

Discussion

マルチプレックスイオンビームイメージング(MIBI)は、詳細な細胞表現型と組織組織構造を解剖するための強力な技術です5,6,7,8,9,10,11。MIBIに関する計算作業は、主にイメージング後のデータの処理に重点が置かれていますが、大規模なTMAやタイル状の組織領域などの一般的なアプリケーションに対する装置ソフトウェアの使いやすさを向上させるための取り組みはほとんど行われていません。MIBI実験の規模と複雑さが増すにつれて、メーカーが提供する機器インターフェースとサードパーティツールは、これらのタスクに対して...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBIコンピュータ	Ionpath
MIBIcontrol(ソフトウェア)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Multiplexed Ion Beam Imaging(MIBI)顕微鏡
MIBIslide	Ionpath	Ionpath 567001	MIBI
Tile/SED/Array Interface(TSAI)用導電性スライド(ソフトウェア)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/