方法論記事

3D脳オルガノイドにおける複数のミトコンドリアパラメータ測定のためのフローサイトメトリー解析の応用

DOI：

10.3791/65621

⸱

2023年8月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ミトコンドリア体積の変化、ミトコンドリア呼吸鎖(MRC)複合サブユニットの量、ミトコンドリアDNA(mtDNA)複製など、複数のミトコンドリア機能パラメータを同時に評価するために、ストリーミングサイトメーターと複数の抗体を使用する独自の方法を報告しています。

要約

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ミトコンドリア機能障害は、多くの種類の神経変性に共通して一次的または二次的に寄与しており、ミトコンドリア質量、ミトコンドリア呼吸鎖(MRC)複合体、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の変化は、これらのプロセスでしばしば特徴づけられます。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するヒト脳オルガノイドは、脳の3次元(3D)細胞構造配列を再現し、複雑なヒトシステムにおける疾患メカニズムの研究や新しい治療法のスクリーニングの可能性を提供します。ここでは、iPS細胞由来皮質オルガノイドの複数のミトコンドリアパラメータを測定するための、フローサイトメトリーに基づく独自のアプローチについて報告します。このレポートでは、iPS細胞から皮質脳オルガノイドを作製するためのプロトコル、生成されたオルガノイドの単一細胞解離、固定、染色、およびその後のフローサイトメトリー解析により、複数のミトコンドリアパラメータを評価するための手順について詳しく説明します。MRC複合体サブユニットNADHに対する抗体であるユビキノン酸化還元酵素サブユニットB10(NDUFB10)またはミトコンドリア転写因子A(TFAM)と電位依存性陰イオン選択的チャネル1(VDAC 1)を併用することで、ミトコンドリアあたりのこれらのタンパク質の量を評価できます。TFAMの量はmtDNAの量に対応するため、ミトコンドリア含有量あたりのmtDNAコピー数を間接的に推定できます。この手順全体は、2〜3時間以内に完了できます。重要なのは、ミトコンドリア質量に対する合計レベルと特定のレベルの両方を含む、複数のミトコンドリアパラメータの同時定量化を可能にすることです。

概要

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ミトコンドリアは必須の細胞小器官であり、アデノシン三リン酸(ATP)産生の主要な部位です。ミトコンドリアは、細胞にエネルギーを供給するだけでなく、細胞情報の伝達、細胞分化、アポトーシスなど、複数の細胞プロセスにも関与し、細胞の成長と細胞周期を調節する能力を持っています。ミトコンドリア機能の変化は、パーキンソン病(PD)1,2、アルツハイマー病(AD)3、筋萎縮性側索硬化症(ALS)4など、さまざまな神経変性疾患で確認されています。ミトコンドリアの機能障害は、老化プロセスに関与し、体細胞mtDNA変異を蓄積し、呼吸鎖機能を低下させます5。

神経変性ではさまざまな種類のミトコンドリア機能障害が発生しますが、このような変化を測定する能力は、疾患のメカニズムを研究し、潜在的な治療法を検討する際に非常に役立ちます。さらに、ヒトの脳細胞における疾患を再現する適切なin vitroモデルシステムを確立することは、疾患のメカニズムをより深く理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。神経変性疾患患者由来のiPS細胞は、ミトコンドリア損傷を発現する....

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プロトコル

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1. iPS細胞の皮質オルガノイドへの分化

  1. マトリックスコーティングプレートの調製
    1. 市販の基底膜マトリックスのバイアルを氷上で一晩解凍します。冷たいAdvanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12(1%最終濃度)で1:100に希釈します。アリコートを作成し、-20°Cで保存します( 材料の表を参照)。
    2. メンブレンマトリックス溶液を4°Cで解凍し(冷たく保ちます)、必要な数のウェルをコーティングします(6ウェルプレートの1ウェルに1mL)。37°Cで1時間インキュベートします。
    3. インキュベーターからプレートを取り出し、室温(RT)に到達させます(1時間放置します)。
      注:プレートは冷蔵庫で最大2週間保存できます(使用前に取り出して、その日に必要なコーティングされたウェルをRTで温めることを忘れないでください)。プレートは3日以内に使用することをお勧めします。長期間保存する場合は、コーティングされたプレートに1 mLのエッセンシャル8メディウム( 材料の表を参照)を加えて、ゲルの乾燥を防ぎます。

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結果

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図1は、分化プロセスとフローサイトメトリー分析に使用される戦略を図示したものです。ヒトiPS細胞を非接着性の96ウェルプレートで培養してEBを形成し、その後、非接着性の6ウェルプレートに移して完全に成長した皮質オルガノイドを得ました。オルガノイドの細胞組成は、ニューロン16 およびグリアマーカー17による免疫染色後に共焦点顕微鏡を用いて検証した。オルガノイドを単一細胞に解離して、個々の細胞の複数のミトコンドリアパラメータのフローサイトメトリーベースの測定を容易にしました。このプロトコルでは、ミトコンドリア質量のパラメータ、MRC複合体IサブユニットとTFAMの量、および相対的なmtDNAコピー数の間接的な測定を取得および分析するために、複数の染色戦略が使用されます。このプロトコルは、オルガノイドを解離し、フローサイトメトリーデータを取得するための手順を提供します。

Park, I. H. et

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ディスカッション

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ヒトiPS細胞から皮質脳オルガノイドを作製し、これらのオルガノイドから単離された単一細胞のミトコンドリアパラメータのフローサイトメトリー解析を実施するためのプロトコールが提示されます。オルガノイドの細胞組成は、神経細胞およびグリア細胞マーカーの免疫組織化学的染色を伴う共焦点顕微鏡法によって検証されました。抗NDUFB10、VDAC 1、およびTFAMとの共染色を行うフローサイトメトリーベースの戦略により、細胞内のミトコンドリア数に対する特定のレベルの複雑なIおよびmtDNAを測定できることが示されています。このプロトコルは、あらゆる種類の脳様細胞のミトコンドリアの測定に適しており、ミトコンドリア機能障害の疾患の研究に使用できます。

このプロトコルは、デュアルSMAD阻害とWnt阻害の組み合わせを使用して脳オルガノイドの生成を可能にします。このトリプル阻害は、デュアルSMAD阻害21と比較して、より均一な皮質NSCプロファイルを生成する。一部の細胞株では、NIMで10%.......

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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ノルウェーのオスロ大学基礎医学研究所のGareth John Sullivan氏に、AG05836(RRID:CVCL_2B58)細胞株を寛大に提供していただいたことに心から感謝します。ノルウェーのベルゲン大学のMolecular Imaging Centre, Flow Cytometry Core Facilityの皆様に心より感謝申し上げます。この研究は、以下の資金提供によって支援されました:K.Lは、ベルゲン大学Meltzers Høyskolefonds(プロジェクト番号:103517133)とGerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat(プロジェクト番号:103816102)によって部分的に支援されました。L.A.Bは、ノルウェー研究評議会(プロジェクト番号:229652)、Rakel og Otto Kr.Bruuns legatおよびGerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legatの支援を受けました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フローサイトメトリー
抗DUFB10、Alexa、Fluor、405NOVUS、生物学的製剤、NBP2-72915、AF405
抗VDAC1、Alexa Fluor 647Santa cruzテクノロジー、sc-390996
抗TFAM、Alexa Fluor、488Abcamab198308
L / D固定可能な近赤外死細胞染色キットLifeテクノロジーL10119
免疫蛍光
抗Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
anti-Alexa Flour 488Thermo Fisher ScientificA28175
anti-Alexa Flour 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)、基礎医学研究所のGareth John Sullivanによって提供されました。オスロ大学、ノルウェー
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium サーモフィッシャーサイエンティフィA1516901
エッセンシャル 8 サプリメント (50x) 2% (v/v)サーモフィッシャーサイエンティフィA1517101
4 °C;CとRTまで温めてから使用してください。
Instruments
Heracell 150i CO2インキュベーターフィッシャーサイエンティフィック、米国
オービタルシェーカー - SSM1、SSL1スチュアート機器、英国
CCD 顕微鏡カメラ ライカDFC3000 Gライカマイクロシステムズ、ドイツ
ウォーターバス JBアカデミー ベーシック Jba5 JBA5 助成金Instruments Grant Instruments, USA
流体吸引システム BVC controlVacuubrand, ドイツ
Leica TCS SP8 STED 共焦点顕微鏡Leica Microsystems, ドイツ
50 mL ファルコンチューブSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, USA
Flowjo Sampler AnalysisFlowJo LLC, USA
10 mLピペットSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL ピペットSigma-Aldrich
40 µm Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
超低アタッチメント 96ウェルプレートS-BIOMS-9096UZ
Countess II 全自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィ
ック<ストロング>神経分化培地 (NDM+)
DMEM/F12ライフテクノロジー11330032
ニューロベース中ライフテクノロジー2110349
グルタマックスサプリメント 1% (v/v)ライフテクノロジー35050
N2 サプリメント 0.5% (v/v)ライフサイエンス17502-048
B27 サプリメント 1% (v/v)ライフ技術17504-044
β-メルカプトエタノール50µMSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mLPeprotech450-02
アスコルビン酸 200 & マイクロ;Mシグマ-アルドリッチ A92902
4°で保管。C 2週間
神経分化培地マイナスビアトミンA(NDM-)
DMEM/F12ライフテクノロジー11330032
ニューロベース中ライフテクノロジー2110349
グルタマックスサプリメント 1% (v/v)ライフテクノロジー35050
N2 サプリメント 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
B27サプリメントW / O vit.A 1% (v/v)Life technologies12587010
&β;-メルカプトエタノール 50 µMSigma-aldrichM3148
4°Cの店舗。C 最大 8 日間
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12Life technologies11330032
ノックアウト血清補充 15% (v/v)Life technologies10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
β-メルカプトエタノール100 & マイクロ;MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMステムジェント/リプロセル04-0074
SB431542 10 µMトクリス1614
XAV939 2 & マイクロ;MSigma-AldrichX3004
4°Cで保管。C 最大 10 日間
<強力>中和媒体
IMDMライフテクノロジー21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)サーモフィッシャーサイエンティフィック14190250
ウシ血清アルブミンヨーロッパバイオプロダクEQBAH62-1000
アキュターゼ生命技術A11105-01
ゲルトレックス生命技術A1413302
EDTA生命技術15575038
先進DMEM/F12生命技術12634010
神経組織解離キットMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632二塩酸塩岩石阻害剤Biotechne Tocris1254
Fluoromount-G™埋込み媒体SouthernBiotech0100-20
PFAサーモフィッシャーサイエンティフィック28908
で使用する抗体、、、、、、、、染色用抗体 はック ック までツ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....

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