方法論記事

改善されたサンプリング技術と組織学的特性評価による前立腺腫瘍バイオバンキングの信頼性の向上

DOI：

10.3791/65635

⸱

2023年11月17日

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、根治的前立腺全摘除術標本からのサンプルの収集を容易にする方法を説明しています。目標は、バイオバンクに保存する前に、解剖病理学的基準に基づいて標本から組織サンプルをマッピング、特性評価、およびミクロマクロで解剖することです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新鮮で十分に特徴付けられた腫瘍組織サンプルを取得することは、高品質の「オミクス」研究を実施するために重要です。ただし、前立腺がん(PC)のコンテキストでは、この臓器のユニークな性質とこの腫瘍に関連する高い不均一性のために、特に困難になる可能性があります。一方、組織に大きな変化を起こさずに、保存前にサンプルを組織病理学的に特徴づけることも興味深い課題です。これに関連して、解剖病理学的基準に基づいて切除された前立腺組織を取得、マッピング、特性評価、およびマイクロ解剖するための新しい方法を提示します。

以前に発表されたプロトコルとは異なり、この方法は、外科的マージンの評価に重要な前立腺標本の構造を損なうことなく、前立腺標本の組織病理学的分析に必要な時間を短縮します。さらに、グリーソンスコア、前駆病変(高悪性度前立腺上皮内腫瘍-PIN)、炎症性病変(前立腺炎)などの病理学的基準によって定義される組織学的腫瘍領域に焦点を当てて、新鮮な前立腺組織サンプルの描写とミクロマクロ解剖を可能にします。これらのサンプルは、その後の研究分析のためにバイオバンクに保管されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

前立腺がん(PC)は、男性で2番目に 頻度の高いがんであり、世界で5番目に 多い死因です1。患者の治療と予後は、腫瘍の病期分類と悪性度(グリーソンスコア)に左右されます。これは、限局性腫瘍および低悪性度腫瘍(グリソン悪性度6)(99%)の5年生存率が高い(99%)ことからも明らかです。これは、グリソン悪性度の高い腫瘍および転移性腫瘍(31%)と比較して2です。

PC局所再発および治療の失敗は、この腫瘍3型の特徴的な高い遺伝的腫瘍内不均一性に関連している。さらに、PCは、異なる形態学的、組織学的、および分子的特徴を示すいくつかの腫瘍病巣4を持つ多病巣であると考えられており、これらは独立して発生するか、または共通の腫瘍細胞の祖先5に由来する可能性がある。これまでの研究では、腫瘍の進化は、転移を促進したり、細胞系譜を前立腺に閉じ込めたりする特定の遺伝的ドライバーに基づいて、患者間で異なることが示されています5。したがって、さまざまな腫瘍病巣の分子特性評価は、より正確な診断と予後を提供するだけでなく、患者に効果的で個別化された治療を調整するためにも重要です。

このような状況において、生物医学研究と統合的なマルチオミクスアプローチは、がんをさまざまなサブタイプに分類し、診断および予後バイオマーカーを特定し、治療反応に関連するマーカーを発見する前例のない機会を提供しています。さらに、これらのアプローチは、この疾患の生物学の理解を深めることに貢献します6,7。組織であれ生体液であれ、生体試料は、さまざまなマルチオミクスプラットフォーム(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなど)を用いて分析し、がんの病態生理学の根底にある生物学的特徴を明らかにすることができ、それによって遺伝的および表現型の不均一性に関連する現在の限界に対処することができます6。ただし、オミクス研究から得られるデータの品質は、腫瘍から収集されたサンプルの品質、その正確な特性評価、およびその後の処理と保存8に依存することを考慮することが重要です。

この文脈では、研究のために新鮮なPC組織を得ることは、腫瘍サンプリングの成功の難しさのために方法論的な課題を提示する9。以前の方法では、根治的前立腺全摘除術後の無作為抽出が含まれていましたが、結果は不十分でした10。しかし、より最近のアプローチでは、磁気共鳴画像法(MRI)と生検データの両方に基づく標的プロトコルが組み込まれており、その結果、腫瘍サンプル収集の有効性が向上しています11。

一方、組織に大きな変化を伴わずにサンプルを保存する前の組織病理学的特性評価も興味深い課題を提起しています。したがって、多くの場合、サンプルの病理組織学的決定は、サンプルの分析後に行われます(例:HR 1H NMRメタボローム分析)12。この慣行は、不必要な費用、時間の消費、および最終的に分析から除外されるかなりの数のサンプルの損失を伴います(たとえば、病理組織学的分析の結果、腫瘍サンプルではないことが判明したサンプル)。他の場合では、サンプルの組織病理学的特性評価は、分析の前に行われます。実際、いくつかの先行研究では、根治的前立腺全摘除術標本から代表的な高品質の研究サンプルをゲノミクスおよびメタボロミクスに提供する方法を標準化しようと試みてきた13,14。それにもかかわらず、組織を破壊する組織学的に確認済みの切片(88%)から実施した場合、未確認の切片(45%)から実施した場合と比較して、サンプリング効率は大幅に高くなります1。

ここでは、これらの制限を克服するための新しい方法論が提示され、バイオバンクに保存する前に新鮮で十分に特性評価されたPCサンプルを取得することを目的としています。この方法は、さまざまな臨床サービス(泌尿器科、病理学、およびLa Fe病院バイオバンク)間の共同作業を通じて開発されました。バイオバンクは、生物学的サンプルの収集、処理、保存、保管において重要な役割を果たしながら、サンプルとデータの高品質を確保し、倫理的および法的要件8,15,16への準拠を確保していることを強調することが重要です。

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プロトコル

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この方法は、さまざまな臨床サービス(泌尿器科、病理学、およびLa Fe病院バイオバンク)が関与する共同作業を通じて開発されました。この研究は、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、スペイン、バレンシアのInstituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Feの生物医学研究倫理委員会から承認を受けました。すべてのサンプルは、La Fe Hospital Biobank(PT13/0010/0026)に保管されました。全体的な手順を 図 1 に示します。

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図1:全体的な手順スキーム。 プロトコルの項で説明した段階的な手順の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 腫瘍の標的化

  1. 手術の前に、マルチパラメトリックまたはバイパラメトリック磁気共鳴画像法(mpMRIまたはbpMRI)17,18を利用して、腫瘍を特定し、前立腺内での位置をマッピングします。MRIから得られた情報を、経直腸超音波または直腸検査の結果と一致しない場合は、組み合わせます。
  2. 腫瘍の局在化を強化するために、術前の超音波ガイド下およびMRIガイド下経直腸前立腺生検の結果を確認します。
    注:前立腺がんの診断手順では、生検は経直腸アクセス を介して 前立腺から直接行われます。これらの生検には、前立腺からの体系的なサンプリング(腺全体に分布するシリンダーを含む)とMRIでの疑わしい所見を直接対象とするシリンダーが含まれます。これらのサンプルの検索を対象とするために、経直腸超音波が使用され、認知的な方法でMRI所見と組み合わされる(「認知融合」)か、利用可能な場合は「実際のMRI-超音波融合ソフトウェア」と組み合わされます。

2.根治的前立腺全摘除術と前立腺コレクション

  1. Huynh et al.19 で概説された手順に従って、経腹膜アプローチを通じて標準化されたロボット支援根治的前立腺全摘除術を実施します。
    1. 腹部へのアクセス、インスタフレーション、カメラポートの配置から始めます( 資料の表を参照)。残りの 5 つのポートを直視下に置きます。気腹を12mmに設定します。
    2. 腹膜を切開して膀胱を解放し、直腸周囲腔を解剖します。
    3. 両側の骨盤筋膜を開きます。
    4. 前立腺と膀胱の前面と外側の側面を完全に解剖します。
    5. 膀胱頸部の開口を行い、近位尿道を特定して切片化し、前立腺と膀胱の後面にアクセスします。
    6. 精嚢と直腸腔を解剖します19.
    7. 前立腺の外側を解剖し、神経血管束を温存します。
    8. 恥骨後腔の血管の止血を確保します。
    9. 頂点を解剖し、遠位尿道を切片にします。
    10. 膀胱尿道吻合を完了します。
    11. 前立腺を摘出し、切開部19の閉鎖を行う。
  2. 新鮮な前立腺を乾燥容器に集めます。サンプル試料を固定したり、パラフィンを埋め込んだりしないことが重要です。
  3. 前立腺全体を含む新鮮な手術標本をバイオバンクに輸送し、サンプル処理を行います。

3.前立腺の処理とサンプル収集

  1. 術前のmpMRI、術前の生検結果、および直接前立腺全摘除術標本の触診から取得した腫瘍の位置情報に基づいて、サンプリングの対象となる前立腺ゾーンを選択します。この情報を、患者の識別データ、最終的にサンプリングされた前立腺領域、収集されたサンプルの数を含むフォームに記録します。
    注: MRI 所見、術前生検結果、および直接前立腺切除術標本の触診が一致している場合は、すべてのサンプルをその場所またはそれらの場所 (4 から 6 シリンダーの間) に向けます。不一致がある場合は、シリンダーの数を増やし、これらの方法のいずれかの影響を受ける疑いのあるすべてのゾーンを個別にターゲットにします。
  2. 使い捨ての自動針(外科医)を使用して、選択した領域から円筒形のサンプルを取り出します(ステップ1.1)。次に、シリンダーの外側のゾーンを特定し(病理学者)、シリンダーを組織鉗子で固定し、スライド上に置き、外側のゾーンにティッシュインクで印を付けます。すべてのシリンダーを取った状態でこのプロセスを繰り返します。
  3. 集めたシリンダーをクライオスタット包埋媒体で満たされたサンプルホルダーディスク( 材料の表を参照)に水平に置き、ミクロトーム冷却プラテンに移して切断します。
  4. プラテンに置いたら、サンプルホルダーディスクを試料チャックに取り付け、次の手順に従ってホイールを慎重に動かしながら切断します。
    1. 最適な切断温度のコンパウンド(OCTコンパウンド、 材料表を参照)を使用して、ミクロトームクライオスタットに凍結切片を作製する前に組織サンプルを埋め込みます。
    2. その後、クライオスタットミクロトームを使用して-25°Cでサンプルを切断します。 組織の細い円柱状の切片(10 μm)を処理済みの顕微鏡スライドに集めます。バイオバンクに保管するための無傷の腫瘍組織を十分な量を確保するために、数ミクロンの組織のみを収集するようにしてください。
    3. スライドごとに2つまたは3つの薄い切片を集め、手動で染色して最終的な色を制御します。技術者の目は最適な染色を保証し、必要な再染色を行うことができます。次の手順に従います
      1. スライドを96%エタノールで固定し、蒸留水で水和させ、Harris hematoxylin( 材料表を参照)で1分間染色して核を染色します。スライドを蒸留水ですすいで、余分なヘマトキシリンを取り除きます。
      2. スライドを30%水酸化アンモニウムで処理して、ヘマトキシリンを青くします。蒸留水ですすいで余分な溶液を取り除きます。
      3. スライドをエオシン( 材料表参照)で30秒間染色します。
      4. 次に、アルコールの滴定を増やしてスライドを脱水し、キシレン(100%)で透明にし、DPX(キシレンバルサムに代わる合成樹脂封入剤として使用されるジスチレン、可塑剤、キシレンの混合物、 材料表を参照)でマウントします。これらのステップでは、スライドをCoplin溶液の瓶に浸して取り出します。
      5. 最後に、染色した組織の上にカバースリップを置き、顕微鏡で見るのに適した屈折率の培地( 材料の表を参照)を使用します。

4. サンプルの特性評価

  1. 光学顕微鏡(病理学者)でサンプルを分析し、がん腫の領域を識別し、腫瘍のグリーソンスコアを決定します。これらすべてのデータを文書化し、スライド上に正確な腫瘍ゾーンをマークします。
  2. このステップでは、腫瘍の正確な位置とそれぞれのグリーソンスコア20でスライドにラベルを付けます。また、形態学的同定に基づいてPIN(前立腺上皮内腫瘍)の位置をマークします。

5. サンプルのミクロマクロ解剖と保存

  1. スライド上の明確なマーカーでさまざまな組織学的コンポーネントを明確にマークします(病理学者)そしてそれらをディスク上の凍結組織と直接関連付けます。
  2. 次に、外科用ブレードを使用して、OCTディスク内のスライドにマークされたサンプルの領域をマクロミクロで解剖し、腫瘍性、腫瘍周囲、PIN、および正常な前立腺組織に分割します。
  3. 埋め込み培地が解凍し始めたら、鉗子で組織を取り扱い、正しく標識されたクライオチューブに入れます。
    注:クライオスライスの組織学的診断に従って、解剖した各フラグメントを対応するチューブ内に慎重に保管します。
  4. 標識されたクライオチューブは、完全に特性評価された組織学的サンプルとともに、その後の研究研究で使用するために、バイオバンクに-80°Cで保存します。
    注意: このセクションで説明する手順は、病理医の監督の下で訓練を受けた技術者が実行できます。手術標本は、組織と核酸の分解を防ぐために、できるだけ早くバイオバンクに輸送する必要があります。リファレンスガイドによると、虚血時間の延長(>30分)を避けるための努力を払わなければなりません21。サンプルは、サンプルの品質原則が維持されている限り、無期限にバイオバンクに保管することができます。

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結果

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その結果、この技術により、研究された症例の61%(41例中25例)で腫瘍物質を得ることが可能になったことが明らかになりました(表1)。

表1:研究サンプルの組織病理学的データ。 研究で使用されたサンプルの組織病理学的データの概要。診断用シリンダーとは、診断目的で得られた前立腺生検サンプルを指し、処理されたシリンダーは、研究目的で前立腺切除標本から得られたシリンダーに対応します。ND: データなし。LL:左小葉;RL:右小葉;TTB:総腫瘍量。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

この分析では、各小葉からの根治的前立腺全摘除術標本から取得したシリンダー内に腫瘍が存在するサンプルの数を、診断のために実施された生検のシリンダー内の腫瘍の存在と比較しました。...

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ディスカッション

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どのような調査研究においても、体系的なバイアスを減らし、信頼性の高い結果を得るためには、質の高いサンプルを取得することが不可欠である22。したがって、サンプルが処理および保存される温度、サンプルの収集から保存までの経過時間、滅菌材料の使用、または防腐剤やその他の添加剤の添加がサンプルに及ぼす影響などの分析前変数の制御は、生物学的サンプルを含む任意のプロトコルで考慮する必要があります。これは重要なことであるだけでなく、サンプルの正しい同定とコード化、およびそれらの病理学的特性評価も重要です。そうしないと、高品質のサンプルが多数保存されているが、未使用のままになっている可能性があります。

バイオバンクに保管する前に腫瘍サンプルと非腫瘍サンプルを収集し、類型化することは、PCの文脈で非常に重要であるため、このプロトコルの主な焦点です。研究のために新鮮なPC組織を得ることは、腫瘍サンプリングの成功が困難であるため、方法論的観点から非常に困難である9。通常、研究のために腫瘍サンプルを収集するために...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.L.は「Margarita Salas」ポスドク契約(番号21-076)を、MAM-Tは「Maria Zambrano」研究契約(番号MAZ/2021/03 UP2021-021)を認めています。どちらの契約も、欧州連合(EU)の次世代EUから資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cadiere鉗子IntuitivePN1052082-US 2021年10月部品番号:471049.18回使用。
従来のスライドニットガラス2021グランド/フロストエンド
クライオスタット ミクロトームサーモフィッシャーサイエンティフィック---クリオスタット クライオスター NX50
クライオチューブグライナー バイオワン GmbHRef.: 122280.CRYO S. PP、スクリューキャップ付き、滅菌済み。
ダヴィンチ手術システム直感的なPN1052082-US 2021年10月XIモデル
解剖器具バイエル---2本のピンセットと手術用ブレード 
DPXユーキット Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Fenestrated Bipolar Forceps直感的PN1052082-US 2021年10月部品番号:471205.14 lives.
フォースバイポーラインテュイティブPN1052082-US 2021年10月部品番号:471405.12回使用。
冷凍庫Thermo ScientificMODEL 907. -80 ºC
ヘマトキシリンアジレント157251
インムノヒストケミストリー スライドアジレントダコK802021-2
大型ニードルドライバー直感的PN1052082-US 2021年10月品番:471006.15 使用。
メリーランド州バイポーラ鉗子直感的PN1052082-US 2021年10月部品番号:471172.14回使用。
顕微鏡Olympus---Olympus cx40
ミクロトームブレードPFM Medicala35
モノポーラカーブハサミ直感的に直感PN1052082-US 2021年10月部品番号:470179.10回使用します。
OCTコンパウンドNEG-50LOT.117340
PlusSpeed S 片回生検装置 斜め先端付きPeter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
ProGasp 鉗子直感型PN1052082-US 2021年10月部品番号:471093.18回使用。
サンプルホルダー ディスクデビッドソン クライオチャック。ブラッドリープロダクツ30 mm 
ティッシュインクペリカン2021インク 4001 ブリリアントブラック (301168)
キシロールキミプールRef. 169
的に

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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