眼球レンズの皮質および核からの束および単線維細胞の調製および免疫蛍光染色

サマリー

このプロトコルは複雑なセルにセルinterdigitationsおよび膜の構造を調査するためにimmunofluorescenceのために末梢、成熟した、および核目のレンズ繊維のセルを準備する方法を記述する。

要約

水晶体は、眼の前房にある透明な楕円形の器官で、形を変えて網膜に光を細かく集束させ、鮮明な画像を形成します。この組織の大部分は、六角形の断面を持ち、水晶体の前極から後極まで伸びる特殊な分化した線維細胞で構成されています。これらの細長い細胞は、隣接する細胞と緊密に対向しており、細胞の長さに沿って複雑な指間があります。特殊なインターロッキング構造は、レンズの通常の生体力学的特性に必要であり、電子顕微鏡技術を用いて広範囲に説明されています。このプロトコルはこれらの複雑に定形づけられたセル内の蛋白質の詳しいローカリゼーションを可能にするためにマウス レンズ繊維のセルの単一、また束を維持し、immunostainする最初の方法を示す。代表的なデータは、水晶体のすべての領域にわたる末梢細胞、分化細胞、成熟細胞、および核線維細胞の染色を示しています。この方法は、他の種のレンズから単離されたファイバーセルに使用できる可能性があります。

概要

水晶体は、眼の前房にある透明な卵形組織で、上皮細胞^と線維細胞1の2種類の細胞で構成されています(図1)。水晶体の前半球を覆う上皮細胞の単層があります。線維細胞は上皮細胞から分化し、水晶体の大部分を占めています。高度に特殊化された線維細胞は、伸長、分化、および成熟プログラミングを受け、水晶体周辺部から水晶体中心までの細胞膜形態の明瞭な変化を特徴とする2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 は、水晶体核とも呼ばれます。さまざまな距離から網膜に来る光を細かく焦点を合わせるレンズの機能は、....

プロトコル

マウスは、インディアナ大学ブルーミントン校の動物管理・利用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて飼育されています。代表的なデータを生成するために使用したマウスは、C57BL6/Jバックグラウンドの対照(野生型)動物、雌、および8〜12週齢でした。この実験には、マウスの性別が実験結果に影響を与える可能性が非常に低いため、雄と雌の両方のマウスを使用できます。

1. レンズの解剖とカプセル化解除

1. 米国国立衛生研究所(NIH)の「実験動物の飼育と使用に関するガイド」および同研究所が承認した動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させる。
   注:本研究では、マウスは_CO2 の過剰摂取によって安楽死させられ、その後、承認された動物プロトコル(インディアナ大学)に従って子宮頸部脱臼が続きました。
2. 湾曲した鉗子を使用してマウスから眼球を摘出し、鉗子の片側で目の周りの組織を押し下げて眼窩から眼球を移動させます。次に、目の下の鉗子を閉じ、持ち上げて眼窩から眼球を取り除きます。解剖トレイ内の新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に眼球を移します。
3. 視神経を極細ハサミで眼球にできるだけ近づけて切ります。先端の細いまっすぐなピンセットを、眼球の後部にある視神経の出口から眼球に慎重に挿入します。
4. ステップ1.3のピンセットと同じ場所にハサミを慎重に挿入し、後部か....

結果

水晶体線維細胞は、水晶体皮質(分化線維と成熟線維)と核から調製され、F-アクチンはファロイジン、細胞膜はWGAで染色されます。細胞の束または単一のレンズファイバーの混合物(図3)が観察され、画像化されます。水晶体皮質からは、2種類の細胞が見られます(図3A)。水晶体周辺の分化線維細胞はまっすぐで、短辺に沿って非常に小さな突起があります。細胞が分化するにつれて、繊維細胞は波状になり、小さな連動した突起が生じます。さらに、成熟プロセスに沿って、繊維細胞は小さなインターロッキング突起で飾られた大きなパドルを発達させます。マウスの水晶体では水晶体核は非常にコンパクトで剛性が高く、核水晶体線維の固定と染色の前に、柔らかい水晶体皮質を機械的に除去 することによって 単離されます。水晶体核からは、低倍率画像では容易に見ることのできない、直径が小さく、微細な膜構造を持つレンズ繊維の束が見つかります。

水晶体の異なる領域からの水晶体線維細胞の高倍率3D再構成(

ディスカッション

このプロトコルは忠実に水晶体のさまざまな深さからの束か単一のレンズ繊維の細胞の3D膜の形態を維持する固定、保存およびimmunostaining方法を実証した。染色されたレンズファイバーは、レンズファイバー細胞の形態を研究するために長い間使用されてきたSEM調製物と比較されます。結果は、両方の調製物間で同等の膜構造を示しています。EMは依然として細胞形態を研究するためのゴールドスタンダードですが、タンパク質^33、34、35を局在化するためのSEMサンプルでの免疫標識はより困難であり^、イメージングには電子顕微鏡が必要です。この免疫染色法の利点は、一度に複数のターゲットを標識でき、共焦点顕微鏡で画像を収集できることです。

この方法では複雑な細胞形態が維持されますが、遺伝子変異、老化、薬物治療などにより、対照レンズ線維と変化したレンズ線維のインターディジテーションを比較するためにSEMが必要です。免疫染.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5