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Summary

このプロトコルは複雑なセルにセルinterdigitationsおよび膜の構造を調査するためにimmunofluorescenceのために末梢、成熟した、および核目のレンズ繊維のセルを準備する方法を記述する。

Abstract

水晶体は、眼の前房にある透明な楕円形の器官で、形を変えて網膜に光を細かく集束させ、鮮明な画像を形成します。この組織の大部分は、六角形の断面を持ち、水晶体の前極から後極まで伸びる特殊な分化した線維細胞で構成されています。これらの細長い細胞は、隣接する細胞と緊密に対向しており、細胞の長さに沿って複雑な指間があります。特殊なインターロッキング構造は、レンズの通常の生体力学的特性に必要であり、電子顕微鏡技術を用いて広範囲に説明されています。このプロトコルはこれらの複雑に定形づけられたセル内の蛋白質の詳しいローカリゼーションを可能にするためにマウス レンズ繊維のセルの単一、また束を維持し、immunostainする最初の方法を示す。代表的なデータは、水晶体のすべての領域にわたる末梢細胞、分化細胞、成熟細胞、および核線維細胞の染色を示しています。この方法は、他の種のレンズから単離されたファイバーセルに使用できる可能性があります。

Introduction

水晶体は、眼の前房にある透明な卵形組織で、上皮細胞^と線維細胞1の2種類の細胞で構成されています(図1)。水晶体の前半球を覆う上皮細胞の単層があります。線維細胞は上皮細胞から分化し、水晶体の大部分を占めています。高度に特殊化された線維細胞は、伸長、分化、および成熟プログラミングを受け、水晶体周辺部から水晶体中心までの細胞膜形態の明瞭な変化を特徴とする2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 は、水晶体核とも呼ばれます。さまざまな距離から網膜に来る光を細かく焦点を合わせるレンズの機能は、剛性や弾力性などの生体力学的特性に依存します¹³、^14、15、16、¹⁷、^18、19。レンズファイバーの複雑なインターディジテーションは仮説が立てられており^20,21、最近ではレンズの剛性^22,23に重要であることが示されています。

図1:レンズの解剖図と、レンズファイバーからの代表的な走査型電子顕微鏡(SEM)画像。この漫画は、上皮細胞の前部単層(水色で網掛け)と水晶体線維細胞のバルクマス(白)の縦方向(上から下への前方から後方)の図を示しています。水晶体の中心(ピンク色)は核と呼ばれ、高度に圧縮されたファイバーセルで構成されています。右の断面図は、ハニカム状に詰め込まれたレンズファイバーの細長い六角形のセル形状を示しています。ファイバーセルには、2つの広い辺と4つの短辺があります。下部の代表的なSEM画像は、レンズの異なる深さにあるレンズファイバーセル間の複雑な膜インターディジテーションを示しています。右から、レンズ周辺部に新たに形成されたレンズファイバーは、短辺に沿って小さな突起があり、幅広側に沿ってボールとソケットがあります(赤枠)。成熟の過程で、レンズ繊維は短辺に沿った小さな突起(青いボックス)によって装飾された大きなパドルドメインを発達させます。成熟したファイバーセルは、小さな突起で示される大きなパドルドメインを持っています。これらの連動ドメインは、レンズの生体力学的特性にとって重要です。水晶体核の線維細胞は、短辺に沿った小さな突起が少なく、複雑な舌状溝の指間(紫色のボックス)を持っています。細胞の広い側面は球状膜の形態を示します。漫画は^22,32から変更され、縮尺に合わせて描かれませんでした。スケールバー = 3 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

水晶体は、前世代の繊維の上に新しい線維細胞の殻を重ねることによって成長する^24,25。ファイバーセルは、2つの広い辺と4つの短辺を持つ細長い六角形の断面形状をしています。これらの細胞は水晶体の前極から後極まで伸びており、種によっては水晶体線維の長さが数ミリメートルになることがあります。これらの細長い細胞の構造をサポートするために、広辺と短辺に沿った特殊なインターディジテーションがインターロッキング構造を作成し、レンズの形状と生体力学的特性を維持します。線維細胞の分化および成熟中の細胞膜形状の変化は、電子顕微鏡(EM)研究によって広く記録されています2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 .新しく形成されたファイバーセルは、その広い側面に沿ってボールとソケットを持ち、短辺に沿って非常に小さな突起を持っていますが、成熟したファイバーは短辺に沿って連動する突起とパドルを持っています。核線維は、舌状および溝状の歯状および球状膜形態を示す。これらの複雑なインターロッキングメンブレンに必要なタンパク質についてはほとんど知られていません。線維細胞におけるタンパク質の局在に関するこれまでの研究は、複雑な細胞構造を明確に可視化することができない水晶体組織切片に依存していました。

この研究は、複雑な形態を維持し、細胞膜および細胞質内のタンパク質の免疫染色を可能にするために、レンズ線維細胞の単一および束を固定する新しい方法を作成し、完成させました。この方法は、EM研究のデータに匹敵する細胞膜構造を忠実に保持し、特定のタンパク質の一次抗体で染色することができます。我々は以前、分化と成熟を経る皮質水晶体線維を免疫染色したことがある^22,23。このプロトコルでは、水晶体核から繊維細胞を汚す新しい方法もあります。このプロトコルは繊維のセル成熟および水晶体の核の圧縮の間に膜のinterdigitationsの形成そして変更のためのメカニズムを理解することへの扉を開ける。

Protocol

マウスは、インディアナ大学ブルーミントン校の動物管理・利用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて飼育されています。代表的なデータを生成するために使用したマウスは、C57BL6/Jバックグラウンドの対照(野生型)動物、雌、および8〜12週齢でした。この実験には、マウスの性別が実験結果に影響を与える可能性が非常に低いため、雄と雌の両方のマウスを使用できます。 1. レンズの解剖とカプセル化解除 米国国立衛生研究所(NIH)の「実験動物の飼育と使用に関するガイド」および同研究所が承認した動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させる。注:本研究では、マウスはCO2 の過剰摂取によって安楽死させられ、その後、承認された動物プロトコル(インディアナ大学)に従って子宮頸部脱臼が続きました。 湾曲した鉗子を使用してマウスから眼球を摘出し、鉗子の片側で目の周りの組織を押し下げて眼窩から眼球を移動させます。次に、目の下の鉗子を閉じ、持ち上げて眼窩から眼球を取り除きます。解剖トレイ内の新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に眼球を移します。 視神経を極細ハサミで眼球にできるだけ近づけて切ります。先端の細いまっすぐなピンセットを、眼球の後部にある視神経の出口から眼球に慎重に挿入します。 ステップ1.3のピンセットと同じ場所にハサミを慎重に挿入し、後部から角膜と強膜の接合部に向かって切開を開始します。注:げっ歯類のレンズは目の~30%を占めています。ピンセットやハサミが目の奥深くまで挿入されすぎると、偶発的な損傷が発生します。 角膜と強膜の接合部の少なくとも半分が分離するまで、角膜と強膜の接合部に沿って切断を続けます。 ピンセットを使用して角膜をそっと押し、手順1.4と1.5で行った切開から水晶体が出るようにします。 先端の細いまっすぐなピンセットを使用して、レンズから大きな組織片を慎重に取り除きます。レンズを点検して、赤道領域を見つけます。 先端の細いまっすぐなピンセットを使用してレンズを浅く突き刺し、レンズカプセルを取り外します。水晶体線維細胞の塊は無傷のままであり、水晶体上皮単層は水晶体嚢に付着したままである。レンズカプセルを廃棄します。 2. レンズ単線維細胞染色 レンズファイバー細胞の塊を、新たに調製した1%パラホルムアルデヒド(PFA;1x PBS)溶液500 μLのウェルプレートに移し、サンプルを4°Cで一晩、穏やかなナーションでインキュベートします(図2A)。注:記載されている溶液の容量は、48 ウェルプレート用に最適化されています。別のサイズのウェルプレートまたはチューブを使用する場合は、それに応じて溶液の量を調整してください。固定、ブロッキング、洗浄(1x PTX、0.1% Triton X-100 in 1x PBS)溶液を、10 x PBS と二重蒸留水(ddH2O)で最終濃度が 1 x PBS になるまで作製しました。 レンズファイバーセルを1%PFAを含む60mmディッシュに移します。鋭利なメスを使用して、繊維細胞のボールを前後軸に沿って半分に分割します(図2B)。同じ軸に沿って半分に再び半分に切り、四分の一を作ります。注:前後軸は、組織塊内の線維細胞の方向によって容易に認識されます。 まっすぐなピンセットを使用して、水晶体ファイバーセルの四分の一から核領域を取り除きます(図2C)。注:げっ歯類の水晶体では水晶体核領域は硬く、水晶体の中心は柔らかい皮質線維から簡単に分離します。 水晶体皮質領域の四分の一を200 μLの1% PFAで、室温(RT)で15分間、穏やかに振とう(プレートシェーカーで300rpm)後固定します。 750 μL の 1x PBS で 5 分間、RT で穏やかに振とうしながら、組織クォーターを 2 回洗浄します。 200 μL のブロッキング溶液(5% 血清、0.3% Triton X-100、1x PBS)を使用して、穏やかに振とうしながら室温で 1 時間、サンプルをブロッキングします。注:このプロトコルの代表的なデータでは、サンプルは一次抗体または二次抗体で染色されていません。ブロッキングステップの後、サンプルを小麦胚芽凝集素(WGA;1:100)およびファロイジン(1:100)(材料表参照)と室温で穏やかに振とうし、光から保護しながら3時間インキュベートしました。一次抗体染色は、以前の出版物22,23で実証されています。 100 μLの一次抗体溶液とともに、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。注:抗体はブロッキング溶液で希釈されています。組織切片のあるスライドと比較して、このタイプの調製物にはより多くの細胞があります。一次抗体の濃度を上げて、より多くの細胞を染色するための十分な抗体を提供する必要があります。抗体濃度は、組織切片に使用する濃度の2倍にすることが推奨されます。二次抗体も同様です。 1x PTX(0.1% Triton X-100、1x PBS)で、室温でそれぞれ5分間、穏やかに振とうしながら組織クォーターを3回洗浄します。 ファイバー細胞を100 μLの二次抗体/色素溶液と室温で穏やかに振とうしながら3時間インキュベートします。このステップとその後のステップでは、サンプルを光から保護してください。注:WGA、ファロイジン、およびその他の蛍光色素を二次抗体溶液に添加して、一次抗体を標識しながら、細胞膜、細胞骨格、またはその他の細胞小器官を同時に標識することができます。 ファイバーセルを 1x PTX で 5 分間、室温で穏やかに振とうしながら 4 回洗浄します。 プラスチャージした顕微鏡スライドに1滴または50 μLの封入剤を加えてから、組織クォーターをスライドに移します。 ピンセットを使用して繊維セルを互いに穏やかに分離し、セルバンドルの重なりを制限します。 #1.5のカバーガラスを封入剤のサンプルの上にそっと貼り付けます。封入剤はカバーガラスの端まで広がる必要があります。これが発生しない場合は、カバーガラスの端に封入剤を追加します。カバーガラスの端の周りの余分な封入剤を吸引し、マニキュアを使用してスライド上のカバーガラスの端を密封します。注:これらの実験には、共焦点顕微鏡用に調製されたあらゆる種類の封入剤を使用できます。 3. 水晶体核単線維細胞染色 セクション 1 で概説した解剖を完了します。 水晶体線維細胞のボールから皮質線維を機械的に除去し、水晶体核を残し、線維細胞塊を湿った手袋をはめた指先にそっと移し、組織塊を静かに転がします。注:マウスレンズでは、手袋をはめた指先の間で水晶体線維細胞のボールを転がすことは、硬水晶体核から皮質線維細胞を除去するための効果的な方法である28,30。この機械的方法が効果的でないレンズについては、慎重な解剖またはボルテックス法29を使用して皮質線維細胞を除去してもよい。 水晶体核をウェルプレートで作りたての1%PFA溶液に移し、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。 サンプルを1%PFAを含む60mmディッシュに移し、鋭利なメスを使用して水晶体核を前後軸に沿って分割します。組織サンプルを再び半分にして、核四分の一を生成します。 ステップ2.4-2.13で概説されているプロセスに従って、免疫染色とサンプルの埋め込みを行います。 図2:水晶体線維細胞の調製と免疫染色を詳述したグラフィカルな要約 。 (A)この 48 ウェルプレートは、記載されたメソッドのサンプルプレートのセットアップを示すためにカラムごとに色分けされており、鉗子を使用した穏やかな取り扱いにより、さまざまな免疫染色ステップ間でサンプルを簡単に移すことができます。このプロトコルの代表的なデータは一次抗体とインキュベートされていませんが、図には一次抗体インキュベーション用のカラムが含まれており、使用済みの洗浄バッファーを吸引して除去した後、洗浄用のウェルを再利用できます。(B)水晶体線維細胞塊を固定した後、細胞の元の構造を保存するために、組織を前後軸(赤い破線)に沿って分割します。組織塊が半分になると、サンプルを回転させ、前後軸に沿って半分を四分の一に分割します(赤い破線)。(C)水晶体核領域(ピンク色)の除去は、ピンセットを使用して皮質線維細胞(青色)から密集した中央組織を掘り出すと簡単にできます。漫画の図は、部分的に BioRender.com を使用して作成され、縮尺どおりに描画されていません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Representative Results

水晶体線維細胞は、水晶体皮質(分化線維と成熟線維)と核から調製され、F-アクチンはファロイジン、細胞膜はWGAで染色されます。細胞の束または単一のレンズファイバーの混合物(図3)が観察され、画像化されます。水晶体皮質からは、2種類の細胞が見られます(図3A)。水晶体周辺の分化線維細胞はまっすぐで、短辺に沿って非常に小さな突起があ?…

Discussion

このプロトコルは忠実に水晶体のさまざまな深さからの束か単一のレンズ繊維の細胞の3D膜の形態を維持する固定、保存およびimmunostaining方法を実証した。染色されたレンズファイバーは、レンズファイバー細胞の形態を研究するために長い間使用されてきたSEM調製物と比較されます。結果は、両方の調製物間で同等の膜構造を示しています。EMは依然として細胞形態を研究するためのゴール?…

Materials

100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5