本稿では、フォトチューナブルハイドロゲルを3Dバイオプリントして、細胞外マトリックスの硬化と線維芽細胞の活性化を研究する方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
フォトチューナブルハイドロゲルは、光曝露に応答して空間的および時間的に変化します。これらのタイプの生体材料を細胞培養プラットフォームに組み込み、微小環境の剛性を高めるなどの変化を動的に引き起こすことで、研究者は線維性疾患の進行中に発生する細胞外マトリックス(ECM)の変化をモデル化することができます。本明細書では、ゼラチン支持体浴内で2つの連続重合反応が可能な光可変ヒドロゲル生体材料を3Dバイオプリンティングする方法を提示する。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆的包埋(FRESH)バイオプリンティングの手法は、マイケル付加反応を促進するためにサポートバスのpHを調整することによって適応されました。まず、ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)を含むバイオインクを非化学量論的に細胞分解性架橋剤と反応させ、ソフトハイドロゲルを形成しました。これらの軟質ハイドロゲルは、後に光開始剤と光に曝露され、未反応基のホモ重合を誘導し、ヒドロゲルを硬くしました。このプロトコルは、ハイドロゲル合成、3Dバイオプリンティング、光硬化、および3D構造内の線維芽細胞の活性化を評価するためのエンドポイントの特性評価をカバーしています。今回紹介する手法により、研究者はpH触媒による重合反応を起こすさまざまな材料を3Dバイオプリントすることができ、組織の恒常性、疾患、修復のさまざまなモデルを設計するために実装することができます。
概要
3Dバイオプリンティングは、研究者が細胞や生体材料を3Dボリューム内に正確に堆積させ、生体組織の複雑な階層構造を再現することを可能にする革新的な技術です。過去10年間で、3Dバイオプリンティングの進歩により、鼓動するヒト心臓組織1、腎臓組織の機能モデル2、肺内のガス交換モデル3、がん研究用の腫瘍モデル4が作成されました。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆埋め込み(FRESH)バイオプリンティングなどの組み込み3Dバイオプリンティング技術の発明により、肺血管5 やヒトの心臓6 などの複雑な軟部組織構造を3Dで再現することが可能になりました。 FRESH 3Dバイオプリンティングは、せん断希釈サポートバスへの押し出しにより、軟質および低粘度のバイオインクの層ごとの印刷を容易にします。サポートバスは、ビンガムプラスチックとして機能し、印刷後にバイオインクの意図した形状と構造を維持する、密集したゼラチン微粒子などの材料で構成されています。プリントされた構造物が固まったら、温度を37°Cに上げることでサポートバスを溶解することができます7。
最近の総説で....
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プロトコル
1. PEGαMAの合成と特性評価
注:ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)合成は、Hewawasam ら から採用され、水分のない条件下で実施されました9。
- 反応物の秤量を量ります。
注:例えば、5 g 10 kg/mol 8アームPEG-ヒドロキシル(PEG-OH)と0.38 gの水素化ナトリウム(NaH)を秤量します( 材料表を参照)。 - 250 mLのシュレンクフラスコに攪拌子を加え、アルゴンでパージします。
- PEG-OHを、シュレンクフラスコ内での溶解に必要な最小量の無水テトラヒドロフラン(THF)に溶解します。
注:約80 mLのTHFは5 gのPEG-OHを溶解します。PEG-OHを溶解するのに必要な最小限のTHFを加えます。 - 反応混合物に3倍モルの過剰NaHを加え、室温(RT)で30分間撹拌します。
- 6倍モルの過剰なエチル2-(ブロモメチル)アクリレート(EBrMA、 材料表を参照)をシュレンクフラスコに滴下し、反応容器をアルミホイルで覆って光から保護します。室温で約48時間撹拌します。
注:5 g の PEG-OH および 0.38 g NaH の場合、こ....
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結果
このプロトコルは、サポートバス内の光可変ヒドロゲルを3Dバイオプリントして、人間の組織を模倣する形状の線維芽細胞の活性化を研究するための動的および一時的な硬化が可能な構造物を作成する方法について説明します。まず、このプロトコルでは、この光可変ポリマー系のバックボーンであるPEGαMAを合成する方法が説明されました。核磁気共鳴(NMR)分光法測定では、96.5%でPEGαMAの官能基化に成功しました(図1)。この手順では、90% 以上の機能化値が許容されます。次に、肺血管系を模倣した中空円柱の3D CADモデルの作成方法について詳しく説明します。ダウンロード可能な3D CADモデルは補足 ファイル1で提供され 、この設計に関連するGコードは 補足ファイル2で入手できます。このCADモデルでは、高さ4mm、内径4mm、肉厚300μmの寸法の構造物を作成しました。
バイオプリンターのセットアップ手順を示します(図2
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ディスカッション
制御された光照射に応答する二段重合反応は、空間的および時間的制御によって生体材料を硬化させることができます。いくつかの研究では、この手法を利用して、さまざまなプラットフォーム5、8、9、10、11、21、22、23での細胞とマトリックスの相互作用を評価しています。より具体的には、フォトマスクまたは2光子励起法を使用して、3Dバイオプリントされたコンストラクトの個別のセクションを硬化させ、以前の出版物5,8.......
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開示事項
著者らには、開示すべき利益相反はありません。この原稿の一部は、IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf の©許可を得て転載しています。5 無断転載を禁じます。
謝辞
著者らは、Adam Feinberg博士(カーネギーメロン大学)と3Dバイオプリンティングオープンソースワークショップを主催した人々に感謝の意を表したいと思います。これらの人々は、FRESHバイオプリンティングの技術を学び、これらの研究に使用される3Dバイオプリンターを構築することを可能にしました。さらに、著者らは、この原稿の図を作成するために使用された Biorender.com に感謝したいと思います。この研究は、ローズコミュニティ財団(DDHおよびCMM)、コロラド肺血管疾患研究賞(DDHおよびCMM)、全米科学財団賞1941401(CMM)、陸軍省賞W81XWH-20-1-0037(CMM)、米国国立がん研究所(NIH賞R21 CA252172(CMM)など、複数のグループまたは資金源によって支援されました。 コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのルードマンファミリーセンター(DDHおよびCMM)、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL080396(CMM)、R01 HL153096(CMM)、F31 HL151122(DDH)、およびT32 HL072738(DDHおよびAT)の賞。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AccuMax 放射計/光度計キット | Spectronics Corporation | XPR-3000 | 光強度の測定、光硬化 |
| 酸に使用 | フィッシャーサイエンティフィック | BP2401-500 | PEGaMA合成時に使用 |
| アセトン | フィッシャーサイエンティフィック | A184 | クライオ切片と一緒に使用 |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | フィッシャーサイエンティフィック | R37110 | |
| アルミホイル | レイノルズ | F28028 | |
| 無水テトラヒドロフラン(THF) | シグマ・アルドリッチ | 401757-1L | 使用PEGaMA合成中 |
| アルゴン圧縮ガス | エアガス | AR R300 | PEGaMA合成中使用 |
| 8 アーム ポリ(エチレングリコール)-ヒドロキシル (PEG-OH) | JenKem テクノロジー | 8ARM-PEG-10K | PEGaMA合成中 |
| 365 nm バンドパスフィルター | エドモンド・オプティクス | 65-191 | 光硬化に使用 |
| ッシャー・サイエンティフィック | BP9700-100 | 染色プロセスで使用 | |
| ブフナーファンネル | クォークガラス | QFN-8-14 | PEGaMA合成で使用 |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | 染色プロセスで使用 |
| Celite 545 (ろ過助剤) | EMD Millipore | CX0574-1 | PEGaMA合成で使用 |
| チャージ顕微鏡スライド | Globe Scientific | 1358W | |
| クロロホルム-d | シグマ-アルドリッチ | 151823-10X0.75ML | PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU 細胞増殖キット | Invitrogen | C10637 | |
| 50 mL コニカルチューブの | CELLTREAT | 667050B | |
| 極低温安全キット | コールパーマー | EW-25000-85 | |
| クライオスタット | ライカ | CM 1850-3-1 | |
| 透析チューブ | Repligen | 132105 | |
| 4',6-ジアミジノ-2-フィリンドール (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| ジエチルエーテル | フィッシャーサイエンティフィック | E1384 | PEGaMA合成中に使用 |
| 1,4-ジチオスレイトール(DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioinkコンポーネント |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271. | |
| 濾紙 | Whatman | 1001-090 | PEGaMA合成中に使用 |
| Freezone 2.5L 凍結乾燥システム | Labconco | LA-2.5LR | 凍結乾燥機 |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | ソフトウェアダウンロード |
| 2.5 mL ガスタイトシリンジ | ハミルトン | 81420 | バイオプリンティングに使用 |
| 15ゲージ 1.5インチ ITシリーズ ヒント | Jensen Global | JG15-1.5X | バイオプリンティングに使用 |
| 30ゲージ 0.5インチ HPシリーズ チップ | ジェンセングローバル | JG30-0.5HPX | バイオプリンティングに使用 |
| ヤギ アンチマウス アレクサ フルーオ 555 抗体 | フィッシャー・サイエンティフィック | A21422 | 染色に使用 |
| グリシン | ・フィッシャー・サイエンティフィック | ・サイエンティフィック C2H5NO2 | 染色プロセス中に使用 |
| 血球計算盤 | フィッシャー・サイエンティフィック | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | 染色プロセス中に使用 |
| ヒト肺動脈外膜線維芽細胞 (HPAAF) | AcceGen | ABC-TC3773 | 2歳の男性患者様から |
| 塩酸 (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | 溶液のpH調整に使用 |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | フリーソフトのダウンロード |
| ImmEdge®ペン | ベクトル研究所 | H-4000 | 染色プロセス中に使用されます |
| インキュベーター | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport ゼラチン 微粒子スラリー (ゼラチン スラリー) | 高度なバイオマトリックス | 5244-10GM | バイオプリンティングに使用されます |
| 光学顕微鏡 | オリンパス | CKX53 | 倒立光学顕微鏡 |
| リチウム フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸 (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | 光硬化剤 |
| 液体窒素 | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | 株式会社ポリサイエンス | 669775-30-8 | |
| 2-メチルブタン | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman キャピラリー ピストン CP1000 | VWR | 76178-166 | 容積式ピペットチップ |
| MMP2 分解性架橋剤 (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink コンポーネント |
| マウス アンチヒト &SMA モノクローナル抗体 | Fisher Scientific | MA5-11547 | 染色に使用 |
| OmniCureシリーズ2000 | パラ | フォトスティフニングに使用されるLumen | S2000-XLA |
| 電子顕微鏡科学 | 15710 | サンプルの固定に使用 | |
| pHメーター | メトラー・トレド | FP20 | |
| pHストリップ | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256. | |
| ピペットセット | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µLピペットのヒント | USAサイエンティフィック | 1120-3710 | |
| 20 µLピペットチップ | USAサイエンティフィック | 1183-1510 | |
| 200 µLピペットチップ | USAサイエンティフィック | 1111-0700 | |
| 1000 µL ピペットチップ | USA Scientific | 1111-2721 | |
| ポリ(エチレングリコール) - アルファメタクリレート( PEG&alpha ;MA) | N/A | N/A | 合成ステップの原稿を参照してください |
| ポリ(エチレンオキシド) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | バイオインク成分 |
| 容積式ピペット | フィッシャーサイエンティフィック | FD10004G 100-1000 & マイクロ;L | |
| 水酸化カリウム (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | pH調整液 |
| ProLong Gold 退色防止剤 | Invitrogen | P36930 | プロセスで使用 |
| Pronterface | All3DP | N/A | ソフトウェア ダウンロード |
| ヨウ化プロピジウム | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| RGDペプチド(CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioinkコンポーネント |
| ロッカーVWR | 10127-876 | ||
| ロータリーエバポレーター | Thomas Scientific | 11100V2022 | PEGaMA合成中に使用 |
| ラバーバンド | ステープル | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtechアメリカ | F902450 | PEGaMA合成中に使用 |
| Slic3r | Slic3r | N/A | ソフトウェアのダウンロード |
| 平滑筋細胞増殖培地-2 (SmGM-2) BulletKit | ロンザ | CC-3182 | キットにはCC-3181およびCC-4149コンポーネントが含まれています |
| 水素化ナトリウム | Sigma-Aldrich | 223441-50G | PEGaMA合成中に使用 |
| Sorvall ST 40R 遠心分離機 | フィッシャーサイエンティフィック | 75-004-525 | |
| 攪拌子 | VWR | 58948-091 | |
| シリンジフィルター | VWR | 28145-483 | フィルター溶液の滅菌に使用 |
| T-75 組織培養処理フラスコ | VWR | 82050-856 | 細胞培養作業 |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T化合物 (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | 染色プロセスに使用 |
| トリパンブルー | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | 細胞培養に使用作業 |
| 0.05% トリプシン-EDTA | Gibco | 25-300-062 | 細胞培養作業に使用 |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | 染色プロセス中に使用 |
| 正立顕微鏡 | オリンパス | BX63F | 蛍光顕微鏡機能 |
| ウォーターバス | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24ウェル 組織培養プレート | コーニング | 3527 |
参考文献
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
- Lin, N. Y. C., et al.
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