腫瘍形成中の抗原特異的CD8⁺ T細胞の動態を評価するためのリンパ節転移モデル

がん免疫療法、特に免疫チェックポイント遮断(ICB)は、がん治療に革命をもたらしました¹。ICBは、腫瘍微小環境(TME)の枯渇したCD8⁺ T細胞で高発現する共抑制性免疫受容体(PD-1、Tim-3、LAG-3、TIGITなど)を遮断し、枯渇したCD8⁺ T細胞の再活性化を引き起こします²。枯渇したCD8⁺ T細胞の不均一性を考慮すると、蓄積された証拠により、ドレナーギンパ節(dLN)を含む末梢に由来する腫瘍特異的CD8⁺ T細胞が、TMEには存在しないことが明らかになった^3,4,5,6,7,8。最近、TdLN由来のTCF-1⁺TOX^腫瘍特異的メモリーCD8⁺ T細胞(TdLN-T_TSM)は、従来のメモリーT細胞のいくつかの機能的特性を具現化し、ICB治療によりさらに増殖し、子孫の疲弊細胞に分化できるICBの真のレスポンダーであることが確認されました⁹。全体として、これらの知見は、抗腫瘍免疫の獲得におけるLNの重要性を裏付けています。

リンパ節は、構造的基盤と生物学的シグナルを提供することにより、腫瘍特異的CD8⁺ T細胞のプライミングと活性化を促進する上で重要な場所として機能します¹⁰。数種類のがん細胞は、系統的な播種の前にセンチネルリンパ節(SLN、原発腫瘍を排出する最初のLN)に頻繁に播種する¹¹。SLN転移の存在は、ヒトの癌の予後不良と関連しており、前臨床モデルでは、TdLNの腫瘍細胞がリンパ節のリンパ管と血管の両方を介して遠隔臓器に広がる可能性があることが示されました^12,13,14,15。SLN生検は現在、多くの固形腫瘍タイプにおいて、その後の治療決定を導くための標準的な手順であり、関与していない^LN16,17の不必要な切除を回避できる可能性がある。関与したLNでさえ、いくつかの研究により、局所LNの切除は、局所LN切除なしで放射線療法または全身療法を受けた患者と比較して全生存期間の改善を示さなかったことが実証されているため、外科的切除が必要かどうか、およびいつ必要かについては議論の余地があります^18,19。1つの解釈は、顕微鏡的病変を伴う転移性LN(mLN)は、免疫細胞を教育する能力をある程度保持し、何らかの治療効果をもたらす可能性があるというものです。したがって、LN転移が抗腫瘍免疫応答、特にTdLN-T_TSMの特性と機能にどのように影響するかを解明することは非常に重要です。

これまで、前臨床データと臨床データの両方で、mLN²⁰の構造的および細胞的変化が明らかになりました。しかし、LN転移中の腫瘍特異的CD8⁺ T細胞の動的変化は説明されていません。したがって、さらなる調査のためには、LN転移の説得力のあるモデルを開発する必要があります。実際、いくつかの研究では、mLNマウスモデルがさまざまな方法で報告されています^14,21,22。例えば、腋窩LNにおける自然転移は、4T1乳癌細胞の乳腺脂肪パッド²²への移植を通じて行われた。別の研究では、Reticker-Flynnらは、解離したmLN組織から培養した腫瘍細胞の連続接種(9回)により、皮下原発腫瘍からLNへの転移の発生率が高い黒色腫細胞株を作製しました¹⁴。別の一般的に使用されるモデルは、フットパッドへの腫瘍細胞の注入によって調製され、転移性遺伝子座は膝窩^LN22に形成されるであろう。特に、これらのモデルにおけるLN転移は必ずしも忠実であるとは限らないため、介入の正確な時点を評価することは困難である。

本研究では、B16F10^細胞株のゲノムにLCMVウイルス糖タンパク質(GP)遺伝子配列をCRISPR/Cas9を介して挿入することにより、B16F10-GP細胞^23,24の節内注入により、マウスLN転移モデルが確立されました9。次に、これらのマウスに、H-2D^b GP_33-41エピトープ^25,26を特異的に認識するトランスジェニックT細胞受容体(TCR)を有するP14細胞を移植し、LN転移中の抗原特異的CD8⁺ T細胞の全身的および局所的動態を調べることができました。私たちの実験デザインは、免疫応答、特にバイスタンダーCD8⁺ T細胞の摂動を排除するLN転移中の抗原特異的CD8 ⁺ T細胞の研究に有用なモデルを提供します。これらの結果は、mLNを除去するか保持するかという臨床治療の選択肢に影響を与え、最大の治療効果を達成するためのmLNの操作に新たな光を当てるでしょう。

使用したC57BL/6Jマウス(B6マウスと呼ぶ)およびナイーブP14トランスジェニックマウス^9,27は、体重18〜22gの6〜10週齢であった。男性と女性の両方を無作為化または盲検化なしで組み入れた。すべての動物実験は、青島農業大学の動物実験委員会のガイドラインに従って実施されました。

1. 培地・試薬の調製

1. DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L-グルタミンと追加の100 U/mLピューロマイシンを添加して、D10(完全DMEM培地)と名付けられたB16F10-GPメラノーマ細胞培養培地を調製します。滅菌済みのD10を維持し、2〜4°Cで最大2週間保管します。
2. RPMI-1640と2%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを添加して、R2培地(赤血球溶解の終了用)を調製します。
3. 2% FBSおよび0.01%のアジ化ナトリウムを含む1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加して、蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを調製します。アジ化ナトリウムの添加は、2〜4°Cで数ヶ月保存することができるFACS緩衝液の保存時間を延長することができる。
4. 155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、および 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を二重蒸留水に添加し、pH を 7.3 に調整して、赤血球溶解(RBL)バッファーを調製します。RBLバッファーは室温(RT)で保存すると、最大3か月間安定に保たれます。
5. 麻酔薬である2,2,2-トリブロモエタノールを、以下のように調製する。
   1. アルミホイルで包まれた50 mLの滅菌コニカルチューブに適切な量の2,2,2-トリブロモエタノール結晶を計量します。適量の2-メチル-2-ブタノールを結晶に添加し、濃度500mg/mLの原液を調製する。
   2. チューブを渦巻かせて混合し、結晶が溶解するまで37°Cのウォーターバスで温めます。すべての結晶が溶解していることを確認してください。
   3. 溶液を完全に混合します。原液を0.22μmフィルターで濾過し、滅菌容器に入れます。原液を凍結し、遮光して-20°Cで保存するか、PBSで希釈して12.5 mg/mLの濃度で作業溶液に入れ、4°Cで保存します。
      注意: 高濃度の液体は刺激性があるため、規定濃度を使用するのが最善です。

2. B16F10-GP細胞懸濁液の調製

1. 1 x 10⁶ B16F10-GP細胞のバイアルを5 mLのD10を含む細胞培養インキュベーターで37°C、5%_CO2で解凍し、培養します。後述するように、細胞が80%〜90%の密度に達したときの細胞を継代培養する。
   1. 元の培地をピペッティングガンで吸引して廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄します。細胞培養皿でPBSで接着細胞を洗浄する場合は、PBSを側壁に移動させるか、皿に落としてください。
   2. PBSを吸引した後、0.5〜1 mLの0.25%トリプシンEDTA溶液を細胞培養皿またはフラスコに加えます。静かに振って、セル表面全体を覆うようにします。細胞培養ディッシュまたはフラスコを37°Cのインキュベーターに約1分間、または室温で細胞が丸くなって分離するまで入れます。倒立顕微鏡の助けを借りて細胞の剥離を観察します。
   3. 新たに調合したD10を等量添加して、トリプシン消化を終了します。細胞培養フラスコの下面をピペッティングガンでパージし、すべての細胞が分離されたことを確認します。
   4. B16F10-GP細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移し、室温で163 x g で4分間遠心分離します。
   5. 上澄み液を吸引して廃棄する。細胞を1〜2 mLのD10に再懸濁して沈殿させます。B16F10-GP細胞懸濁液を8〜10 mLのD10を含む新しい細胞培養皿またはフラスコに移し、細胞インキュベーター内で37°C、5%_CO2でインキュベートします。
2. 腫瘍移植当日に、ステップ2.1.1〜2.1.4で説明したように、密度が約90%のB16F10-GP細胞を採取します。遠心分離後、上清を吸引して廃棄する。細胞沈殿物を1 mLのPBSに再懸濁します。
3. 0.4%トリパンブルー血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。PBSを添加して、細胞を100 μLあたり5 x 10⁵ 細胞に希釈します。 使用するまで細胞を氷上に置きます。

3. マウスの両側鼠径部におけるB16F10-GP細胞の異所性接種

1. 調製したB16F10-GP細胞懸濁液100 μLを1 mLのシリンジで吸引します。チューブの壁をフリックして泡を上に移動し、ピストンを押して上の気泡を外に移動します。
2. マウスを仰臥位で保持し、腹部を露出させます。マウスの右後肢を仰臥位で指で押して、右鼠径部の皮膚が完全に露出するようにします(左鼠径部と同じ)。
3. 脱毛クリームで腹部の毛を取り除き、75%エタノールを含む綿で両側の腹部をきれいにします。
4. 針を挿入する前に、鼠径部の皮膚が引き締まっていることを確認してください。大腿上部の鼠径部の皮下腔に45°の角度で針を挿入します。針が上向きに斜めになっていて、針の深さが0.5〜1cmであることを確認してください。
5. 注射前に優しく吸引し、血液がない場合は皮下組織にゆっくりと注入した細胞を注入します。同時に、皮下領域に小さなボーラス(体液ポケットの形成)を観察します。
6. 注射後、針を取り外し、鋭利な箱に入れ、マウスをケージに戻します。

4. 担がんマウスへのP14 T細胞の養子移植

1. 腫瘍が触知可能(直径約3〜5 mm)の腫瘍移植後6〜8日後に、担がんマウスの養子移植を行います。移植前日に4mgのシクロホスファミドを腹腔内に注射する28,29,30。
   注:CTX注射の目的は、増殖するリンパ球を一過性に排除することにより、養子移植されたT細胞のためのリンパ区画にスペースを作ることです。
2. 以下に説明するように、ナイーブP14トランスジェニックマウスの脾臓およびLNからリンパ球を分離します^31,32(6〜10週齢、拒絶反応の問題を回避するために腫瘍担持マウスと同じ性別)。
   注意: バイオセーフティキャビネットで次の手順を実行して、厳密に無菌状態を確保してください。
   1. 6 cmのディッシュを2つ用意し、片方のディッシュに3 mLのR2培地を、もう1つのディッシュに3 mLのRBLバッファーを加えます。RBLバッファーを入れたペトリ皿に70 μmのセルフィルターを入れます。
   2. P14マウスをイソフルランを含む密閉容器に入れて安楽死させ、その後子宮頸部脱臼させる。レシピエントマウスの数に応じて、P14マウスの数を調整します。
   3. 安楽死させたマウスから脾臓、鼠径部、および腋窩リンパ節を採取し、4 mLのR2培地を含む6 cmの皿に移し、氷上に置いた。
   4. 3 mLのRBLバッファーを浸したストレーナーに脾臓を置き、1 mLのシリンジの内側のパターで脾臓をすりつぶします。細胞を室温で1〜2分間インキュベートし、3 mLの冷たいR2培地で反応を終了します。
   5. 70 μmのセルフィルターでストレーナーに結合組織だけが残るまで、1 mLシリンジ内のパターでLNを粉砕します。フィルターを冷たいR2培地ですすぎ、細胞懸濁液を新しい15 mL遠心チューブに移します。サンプルを500 x g で4°Cで6分間遠心分離します。
   6. 上清を廃棄し、細胞を3 mLのPBSで再懸濁します。70 μmのセルフィルターを使用して、細胞懸濁液から凝集物質を除去します。
   7. 細胞懸濁液を500 x g で4°Cで6分間遠心分離します。 細胞を3 mLのPBSで再懸濁し、チューブを氷上に置いてください。少量のサンプルを採取し、トリパンブルーと混合し、血球計数プレートを使用して細胞をカウントします。
3. フローサイトメトリーにより、P14(^生/死CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺)細胞の割合を測定します。移植されたドナー細胞がレシピエントマウスと異なるコンジェニックマーカーを示すことを確認します(担がんB6マウスはCD45.2⁺です)。転写前に染色を行い、転写した細胞の正しい表現型を確認します。
   1. 5 x 10⁴- 1 x 10⁵ 細胞を、1 mLのFACSバッファーを含む1.5 mLの遠心分離チューブに加えます。細胞懸濁液を500 x g 、4°C、3分間遠心分離します。
   2. 上澄みを捨て、チューブの底をはじいて細胞を分散させ、チューブを氷の上に置きます。
   3. 100μLのFACS緩衝液で希釈した以下の標識抗体混合物^9,32を調製する:抗CD8、1:200;抗TCR Vα2、1:100;抗CD45.1、1:200;生きている/死んだ染み、1:400。(材料表)。
   4. 抗体混合物を15,000 x g で3分間遠心分離し、粒子を凝集させます。混合物を氷の上に置き、ホイルで包んで光から保護します。粒子の吸引を避けるために、上澄みのみを服用してください。
   5. 細胞を100 μLの抗体混合物に再懸濁し、チューブ壁をはじいて完全に混合します。スズ箔で包んだ後、チューブを氷上で30分間インキュベートします。
   6. 細胞をFACSバッファーで2回洗浄します。チューブを500 x g 、4°C、3分間遠心分離します。細胞を200 μLのFACSバッファーで再懸濁し、細胞懸濁液をフローチューブに移します。
   7. フローサイトメーターで染色した細胞を含むフローチューブを流し、^生細胞/死細胞CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ 細胞の割合を測定します。
      注:一般に、P14トランスジェニックマウス由来のCD8⁺ T細胞の90%以上が、LCMV(リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス)のH-2D^b GP_33-41エピトープに特異的なVα2⁺TCRを保有していた。
4. 生^/死CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ 細胞の絶対数を、その割合とステップ4.2および4.3で得られた生細胞数を掛けて計算します。
5. 200 μL の P14 細胞 (5 x 10⁵ 細胞) 懸濁液を 100 U インスリンシリンジで吸引し、気泡を取り除きます。移植されたナイーブP14細胞の初期数(5 x 10³ - 5 x 10⁵)は、^{移植された細胞}の表現型に影響を与えなかった9。
6. マウスをケージに入れ、赤外線ランプで5〜10分間温めて尾静脈を広げます。適切なサイズのマウス固定具で所定の位置に保持し、尾をまっすぐにし、75%エタノールを含む綿球で拭いて静脈を見えるようにします。
7. 針を尾静脈と平行に挿入し、プランジャーを静かに引き戻します。シリンジに血液が流れている場合は、細胞懸濁液をゆっくりと静脈に押し込みます。
   注:噴射中にテールの抵抗や腫れがある場合は、噴射位置を調整する必要があります。注射部位は遠位端から開始する必要があります。
8. 注射が終わったら、素早く針を抜き、綿球で注射部位を軽く押します。マウスを新しい清潔なケージに戻し、悪影響がないか数分間注意深く観察します。

5.原発腫瘍の切除

注意: 使用前に、すべての手術器具がオートクレーブ滅菌されていることを確認してください。バイオセーフティキャビネット内の操作領域を75%エタノールで滅菌し、続いて少なくとも30分間UVを照射します。手術中は、清潔なガウン、帽子、マスク、滅菌手袋を着用してください。

1. 腫瘍が触知可能(直径約5mm)になったら、原発腫瘍を切除します。
2. ケタミン(75 mg / kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.麻酔の程度を評価するためにフットパッドをつまみ、痛み反射がない場合は、手術の適切なタイミングを示します。後肢が引き抜かれた場合は、10〜30μLの別の用量を提供します。.
   注:または、腹腔内メデトミジン(1 mg / kg体重;ドミター)は、マウスに麻酔をかけるために推奨されます。
3. 乾燥予防軟膏をマウスの目に塗布します。脱毛クリームで腹部の毛皮を取り除き、術野を完全に露出させます。
4. マウスをバイオセーフティキャビネットに置き、マウスの縦軸が実験者と平行になるように、清潔な吸収紙で覆われた解剖ボードの上に仰臥位で置きます。
   注意: 厳格な無菌環境を維持するには、バイオセーフティキャビネットで次の手順を実行する必要があります。
5. ポビドンヨードに浸した綿球でマウスの腹部を消毒します。無菌メスまたは眼科ハサミで腫瘍のある部位の近くの皮膚を切開します。閉じたハサミの先端を切開部に挿入して、腫瘍をはっきりと露出させます。皮膚を切開するときは、鼠径部のリンパ節を傷つけないように注意してください。
6. 腫瘍の除去中は、カプセルをできるだけ無傷に保ちます。滅菌ハサミで腫瘍に隣接する結合組織を慎重かつ穏やかに除去します。 腫瘍をその場 で完全に切除しないと、再発する可能性があります。

6.鼠径リンパ節におけるB16F10-GP細胞の節内注射

注:両側腫瘍クリアランス後、B16F10-GP細胞を片側鼠径リンパ節に注入し、PBSを反対側に注入しました。

1. 20 μL(5 x 10⁴ 細胞)のB16F10-GP細胞懸濁液を100 Uインスリンシリンジで吸引し、気泡を取り除き、1つの鼠径リンパ節に注入します。反対側の鼠径リンパ節に等量のPBSを注入します。
   1. 注射中は、リンパ節の遠位端から針を挿入し、リンパ節の中心にゆっくりと針を挿入します。このとき、リンパ節に正確に液体を注入すると、リンパ節が大きく腫れているのがわかります。
      注意: 針をリンパ節の遠位端から挿入するときは、リンパ節に穴を開けないように注意してください。
2. 3-0縫合糸を使用して、2〜3針で切開部を縫合します。ポビドンヨードを含浸させた綿で傷口の周囲の皮膚を消毒します。縫合中はリンパ節をバイパスするように注意してください。
3. マウスを清潔なケージに入れ、外側褥瘡の位置で赤外線を使用して暖かく保ちます。意識が回復するまで継続的に監視します。手術を受けたマウスは、完全に回復するまで他の動物の仲間に戻さないようにしてください。
4. 術後の痛みを和らげるために、手術後3日間連続して4〜6時間ごとにブプレノルフィンを投与します(0.1〜0.5 mg / kg、SQ、またはIPの用量)。マウスの摂食、飲用、運動、および活動領域を監視します。典型的には、マウスは3日以内に外科的外傷から回復する。
   注:マウスが通常の摂食や活動を再開できず、感染の兆候が見られる場合は、獣医師に介入を依頼するか、安楽死させてください。
5. 異なる時点でマウスを犠牲にします:腫瘍細胞の節内注射後8日目と18日目。フローサイトメトリー解析を用いて活性化ドナー細胞を回収します。

この実験計画の概略図を図1Aに示します。100μLのPBS中の合計5×105 B16F10-GP細胞をCD45.2 C57BL/6Jマウスの両側鼠径部に皮下(s.c.)移植した。7日後、これらの担がんマウスに4mgのCTXを腹腔内(i.p.)注射し、続いて尾部静脈内(i.v.)注射により5×105個のCD45.1+P14細胞を養子移植した。腫瘍が直径約3〜5mmに成長したとき(P14細胞移植の約7日後)、原発腫瘍を切除し、20μLのPBS中の5 x 104 B16F10-GP細胞を片側鼠径リンパ節に直接注入した。反対側の鼠径リンパ節に等量のPBSを注入しました。示された時点での非転移性リンパ節(nLN)および転移性リンパ節(mLN)の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E、100x)染色を図1Bに示します。nLNの構造は損なわれていませんでした。LN転移の初期(D8)では、mLNは腫瘍細胞で部分的に占められており(黒矢印)、腫瘍細胞に侵�されていないリンパ球が残っている領域が残っています(赤矢印)。LN転移(D18)の後期段階では、mLNは腫瘍血管新生と小さなリンパ球を伴う腫瘍細胞で満たされています。TdLNで回収された活性化P14細胞は、GP33-41ペプチド刺激後に高レベルのIFN-γを産生した9,31。ここでは、活性化されたP14細胞の割合をフローサイトメトリーで異なる時点で解析し、ゲーティング戦略を図2に示します。末梢血中の抗原特異的CD8+ T細胞の頻度は、初期(D8)および後期(D18)でそれぞれ2.81%および1.48%である(図3A)。腫瘍特異的なCD8+ T細胞は、腫瘍形成中にdLNに厳密に存在し、非排出LNは限られたドナー細胞を回収したことが報告されている33。nLN中の抗原特異的P14細胞の割合は、LN転移中に安定していました。興味深いことに、mLNの抗原特異的CD8+ T細胞は、nLNと比較してP14細胞の頻度が高いことから、初期段階では一過性に増強され、後期には急激に減少しました(図3B)。

図1:実験計画の概略図。(A) C57BL/6Jマウス(CD45.2+)に、両側鼠径部に5 x 105 B16F10-GP 腫瘍細胞を移植した。7日後、これらのマウスに4mgのCTXを腹腔内に注射し、翌日に異なる先天的にマークされた(CD45.1+)P14細胞を養子移植した。腫瘍が直径約3〜5mmに成長した場合(P14細胞転移後約7日後)、原発腫瘍を切除し、20μLのPBS中の5×104 個のB16F10-GP細胞を片側鼠径リンパ節に直接注入し、反対側の鼠径リンパ節に等量のPBSを注入します。 (B) LNの代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E、100x)染色。 略語:s.c. = 皮下;CTX =シクロホスファミド;iv = 静脈内;Sac = 犠牲;nLN = 非転移性LN;mLN = 転移性LN。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。 ドナー由来の活性化抗原特異的CD8+ T細胞を同定するために使用されるゲーティング戦略。略語:L / D =生きている/死んでいる。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:LN転移中の抗原特異的CD8+ T細胞の動態。 異なる時点での(A)末梢血、(B)nLNおよびmLN中の抗原特異的CD8+ T細胞の割合。略語: nLN = non-metastatic LN;mLN = 転移性LN。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。