マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語)

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、2次元の生体分子の割り当てを可能にし、イオン化可能な化合物のノンターゲット調査を提供し、特に生体試料におけるそれらの空間分布を決定する強力な方法です^1,2。20年間にわたり、この技術により、脂質、ペプチド、炭水化物、タンパク質、その他の代謝物、および治療薬などの合成分子の同時検出と同定が可能になりました^3,4。MALDI-IMSは、生体試料の抽出、精製、分離、標識、染色剤を介さずに、組織試料表面の化学分析を容易にします。しかし、分析を成功させるためには、この手法の極めて重要なステップは、特に環境順応のために広範囲にわたる複雑な器官に特殊化され、修飾された植物組織におけるサンプル調製^です5。

植物組織の固有の物理化学的特性のため、MALDI-IMS分析の要件に適合し、切片作成中に組織の元の形状を維持するための適応プロトコルが必要です^6,7。種子などの型破りなサンプルの場合、これらの組織は細胞壁が硬く、水分含有量が少ないため、切片の断片化を引き起こしやすく、化合物の非局^{在化を引き起こす}可能性があるため、確立されたプロトコル⁸は適用できません9。

私たちの研究グループは、レンタル可能なアサイーパルプ¹³ の生産中に大量に生成される副産物であるアサイー (Euterpe oleracea Mart.) 種子 10,11,12 の分子マッピングと MALDI-IMS 分析に適合したプロトコルに関する実験データを公開しました。アイデアは、アサイー種子のさまざまな代謝産物の in situ マッピングのプロトコルを開発し、現在商業的に調査されていないこの農業廃棄物の可能な用途を提案することでした。しかし、アサイーシードの抵抗性により、MALDI-IMS 分析から適切なサンプル切片を得るためのプロトコルをオーダーメイドする必要がありました。

これに関連して、経済的に重要なアサイーパルプは、同様の感覚特性を持つエウテルペ属のヤシの木からの他の果物の商業化の増加を動機付けました。アサイー^14,15 の代替として工業規模で生産されている 2 つの新興ヤシの木の果実は、アマゾンの乾燥地で育つ E. precatoria (アサイー ド アマゾナスとして知られている) と、大西洋岸森林から典型的な E. edulis (ジュサラとして知られている) です。それにもかかわらず、アサイー・ド・アマゾナスとジュサラの消費は、役に立たず、それらの詳細な化学組成に関してこれまで研究されていなかった耐性のある食べられない種子の同じ蓄積につながります。

したがって、MALDI-IMSによる分子マッピングのために E.precatoria および E.edulis 種子を分析するために、以前に考案されたプロトコルをほとんど適応せずに使用できることをここで実証し、これらのリソースの組成の分析に使用できる強力なツールであり、それらの潜在的なバイオテクノロジーの使用を決定するのに役立つことを証明します。さらに、ここでの詳細な説明は、MALDI-IMS分析用の耐性材料を調製する際に同様の困難を抱えている他の人に役立ちます。

Euterpe precatoria の種子は、Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia(ブラジル、マナウス)から寄贈され、 Euterpe edulis の種子は、産業パルプ化プロセスの後、Silo - Arte e Latitude Rural(Resende、ブラジル)から寄贈されました。種子は密封されたプラスチックの箱に室温で維持した。

1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)

1. 種子セクショニングプロトコル
   1. 各種から3つの種子を脱イオン水に24時間置きます。
   2. 翌日、クライオスタット( 材料表参照)の電源を入れ、-20°Cにします。
   3. 湿った種を水から取り出します。ミクロトームブレードを使用して種子を半分に切ります( 材料表を参照)。
   4. 新鮮で温かい(10%)ゼラチン溶液を調製します( 材料表を参照)。
   5. 種の半分を型に置き、作りたてのゼラチンを入れます。クライオスタットに移す前に、-80°Cで2時間凍結します。
   6. 最適な切断温度コンパウンド(OCT、 材料表を参照)を使用して、埋め込まれたシードをクライオスタット支持体に付着させ、OCT硬化のためにクライオスタット内に10分間放置します。
   7. 酸化インジウムスズでコーティングされたスライドガラス(ITOスライド、材料表参照)に銅両面粘着テープ(材料表参照)を追加します。
   8. 各種から20μm厚の切片を作製し、ITOスライドガラスに貼付した銅製両面粘着テープ上に貼付する。
      注:この時点で、スライドに集められたスライスは-80°Cの冷凍庫に保存できます。または、マトリックス堆積に進みます。スライドはホルダースライドボックスに入れ、ガス状のN₂で洗い流し、サンプルの酸化を防ぐためにフィルムで密封する必要があります( 材料表を参照)。
2. マトリックス堆積
   1. スライスを含むスライドを真空デシケーターに入れ、室温に達するまで置きます。
   2. 各スライドの隅に修正ペンを使用してティーチングマークを作成します。テーブルスキャナーを使用してスライドをスキャンします。解像度を 4,800 ppi に設定します。
   3. 分析天びんを使用して、30 mgの2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB、 材料表を参照)を秤量し、1:1メタノール:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA; 資料表)DHBを溶解する溶液。
   4. 1 mLのガラスシリンジ( 材料表を参照)にDHB溶液を充填し、流速0.8 mL/hに設定したシリンジポンプ( 材料表を参照)に入れます。
   5. PEEKチューブを使用して、シリンジを大気圧化学イオン化(APCI)針に接続します( 材料表を参照)。
   6. N₂ を APCI ニードルに接続し、 12.5 psi の流量に設定します。
   7. APCIニードルをxyモーションプラットフォームに取り付けます( 材料表を参照)。APCI針の先端がスライドから 4cm 上にあることを確認します。
   8. 描画ソフトウェア( 材料表 と 補足図1を参照)を使用して、xyモーションプラットフォームをテンプレートに従うように設定します。テンプレートは、1mm間隔の水平平行線で構成されています。
   9. マトリクス堆積を実現するには、xyモーションプラットフォームがテンプレートを20回繰り返すのを待ちます。
      注意: マトリックス堆積は、化学ドラフトで実行する必要があります。
3. 画像取得
   1. スライドを質量分析計に置きます( 材料表を参照)。
   2. 修正ペンマークを使用して、参照先のソフトウェアにティーチングポイントを設定します( 材料表を参照)。
   3. レーザー出力(60%)、レーザーフォーカス(中)、ショット数(100)、極性をソフトウェアで設定します( 材料表を参照)。 99%のデータ削減係数 を設定し、事後データキャリブレーション用にFIDファイルを保存します。メソッドを保存します。
   4. 質量分析計ソフトウェアの add polygon measurement region ツールを使用して、分析する領域を区切ります。前のステップで保存した方法を示す測定領域パラメータを編集し、 ラスター幅を100μmにします (補足図S4A)。
   5. 画像取得を開始します。
4. データ解析
   1. マトリックスクラスターと既知の汚染物質を使用して、参照ソフトウェア( 材料表を参照)の キャリブラント タブ(補足図S4B)で質量リストを作成します。
      1. 参照されているソフトウェアでキャリブレーションするデータを開きます( 材料表を参照)。 キャリブレーション タブで、作成した質量リストを開き、右クリックしてダイアログボックスを開き、 ロック質量の設定 オプションを選択します(補足図S4C)。
      2. 0.5 ガウス幅拡大と 3.5 線幅拡大のガウス ウィンドウ モードを選択します。オンラインキャリブレーションはオフのままにします。モード(単一)、しきい値(1,000)、質量許容差(5 ppm)を選択します。プロセスでデータをキャリブレーションし、2Dデータツールを保存します(補足図S4C)。
   2. キャリブレーション後、データをSCiLS labまたはその他の互換性のあるソフトウェアにエクスポートし、目的の m/z 値のしきい値を設定します(選択範囲:150〜2,500)。
      メモ: ファイルサイズやコンピュータの特性によっては、この処理に時間がかかる場合があります。
   3. 総イオン数(TIC)または二乗平均平方根(RMS)から正規化方法を選択します。
      注:この分析では、TICを選択しました。
   4. マッピングする分析対象物がわかっている場合は、各分析対象物の各 m/z 値をプロットし、生成された画像とスペクトル平均プロットを保存します。
      注:この研究では、ヘキソースオリゴマーの m/z 値は、カリウム付加物を考慮して選択されました。

2. エネルギー分散型分光法(EDS)

1. 種子セクショニングプロトコル
   1. セクショニングソーマシンで薄いシードスライスを取得します( 材料表を参照)。
   2. 500 RPMの切断速度、100 Nの負荷チャージ、および15 HCダイヤモンドウェーハブレード(材料表を参照)でシードを切断します。
      注意: ゴニオメーターに取り付けられた精密バイスのホールドに必要な接着のために、シードからの繊維の手動除去を処理します。使用前にブレードを清掃し、種子の一部を切断して、分析中に望ましくない鉱物が添加されないようにします。
   3. 圧縮空気でサンプルを除去し、切断からすべての粒子の残留物を取り除きます( 材料表を参照)。
   4. 支持体のカーボン両面導電性テープ( 材料表を参照)でシードセクションを固定します。
2. 解析条件
   1. EDSと組み合わせた走査型電子顕微鏡(SEM)の真空チャンバー内にシードセクションを備えたサポートを取り付けます( 材料表を参照)。
   2. 加速度20kV、スポットサイズ4.0の模型顕微鏡で、二次電子信号(材料表参照)、反射電子(極片に固定された固体検出器)、およびこれら2種類の信号の混合(MIX)を使用して電子顕微鏡写真を取得し、人工的に着色された画像を構築します。
   3. EDSスペクトルの取得には、前述のSEMと組み合わせた分光計( 材料表を参照)を使用します。EDSからの画像取得の条件構成はSEMと同じです。
   4. 傾斜角度、仰角、方位角をそれぞれ 0.0、35.0、0.0 に設定します。
3. データ・アクイジション
   1. シード部を91倍の倍率で3つの異なる領域に設定してデータを取得します。
   2. アクイジション終了時またはアクイジション中のスペクトラムのピークを特定します。 Confirm Elementsステップ ボタンを使用して、ピークを手動で同定します。
   3. 選択した領域ごとに取得時間を60秒に設定します。処理時間を 5 に設定します。パラメータは、1 から 6 の処理時間で使用できます。
      注:要素の兆候は一定で加算されますが、ノイズはランダムで有害です。処理時間が長いほど、ノイズは低くなります。
   4. 有意な定量的結果を表示するためのデフォルト設定は、2シグマ(標準偏差)を超えています。2 つのシグマを 0 に設定して、望ましくない結果を減らします。
   5. 要素の各強度を正規化します。これは、ソフトウェアで標準化されたパラメータです( 材料表を参照)。
   6. データを分析するには、DOCファイルにエクスポートします。
4. データ解析
   1. 定量的な元素分析のためにピーク強度を正確に測定します。
   2. ピークが重なり合っている場合は、ピーク分離を改善するためにデコンボリューションが必要です。必要に応じて、ノイズの多い背景を減算します。
   3. オーバーラップがない場合は、ゲインを上げて信号を増幅し、スペクトル品質を向上させます。

考案されたプロトコルにより、E. precatoria および E. edulis 種子の MALDI-IMS 解析が可能になりました。その結果、部分的な構造解明として、糖質の分子量と重合度(DP)を確認することができました。MALDI-IMS分析(図1および図2)で得られた分子情報では、マトリックスに塩を添加することなく、ヘキソースオリゴマー(Δ = 162 Da)の[M+K]+付加物を表すピークが示されました。ヘキソース二量体(m/z 381)、三量体(m/z 543)、四量体(m/z 705)、五量体(m/z 867)、六量体(m/z 1029)、および最大14単位のオリゴマー(m/z 2325)が両方の種子組織で同定されました。両方のサンプルの箱ひげ図(図 3)は、種子胚乳に見られる各ヘキソースオリゴマーのピーク強度を示しており、その分布と高 DP オリゴマーの含有量がわずかに高いことを示しています。

以前、 E. oleracea の種子に関するEDSデータを提供し、MALDI-IMS分析で検出されたカリウム付加物は、カリウム含有量の上昇というサンプルの本質的な特性によるものであることを示しました10。また、 E. precatoria と E. edulis の種子を分析し、試料の切片の主要元素を同定した(補足図S2 および 補足図S3)。組織表面で観察された原子組成は均一に分布しており、主に炭素や酸素などの非鉱物元素を示し、ミネラル含有量は低かった。どちらのサンプルでも、EDS分析で検出された主なミネラル元素はカリウムでした(補足図S2 および 補足図S3)。

図1:ポジティブモードのMALDI-IMSによるEuterpe precatoria種子中のヘキソースオリゴマー分布。 (A)得られたマススペクトル。(B)MALDI-IMS解析に用いた組織画像とフレーム。(C-O)種子の胚乳中の六量体二量体(C)、三量体(D)、最大14単位(E-O)からの各[M+K]+付加物について、組織内の強度を表す特定のm/zシグナルの画像表現。スケールバー = 4 mm (B)。略称:MALDI-IMS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ポジティブモードのMALDI-IMSによるEuterpe edulis種子中のヘキソースオリゴマー分布。 (A)得られたマススペクトル。(B)MALDI-IMS解析に用いた組織画像とフレーム。(C-O)種子の胚乳中の六量体二量体(C)、三量体(D)、最大14単位(E-O)からの各[M+K]+付加物について、組織内の強度を表す特定のm/zシグナルの画像表現。スケールバー = 5 mm (B)。略称:MALDI-IMS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:箱ひげ図の可視化。 (A) E. precatoria および (B) E. edulis、種子組織に見られる各ヘキソースオリゴマーのピーク強度と分布を示す。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図S1:マトリックスコーティングテンプレート。 DHBマトリックスは、1mm間隔で水平平行線を75 mm x 25 mmスライドで均等に分配するために、描画ソフトウェアを使用してプラットフォームにスプレーされました。 この ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:エネルギー分散型X線分析による E. precatoria 種子の元素組成分析。 (A) E. precatoria 種子試料表面断面。(B)半定量化された主要元素。主成分は、炭素(C)約47.0%、酸素(O)約52.7%、カリウム(K)0.2%に相当します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:エネルギー分散型X線分析による E. edulis 種子の元素組成分析。 (A) E. edulis 試料表面断面。(B)半定量化された主要元素。主成分は、約47.7%の炭素(C)、53.8%の酸素(O)、0.3%のカリウム(K)、および微量の塩素(Cl)に対応します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:画像とデータ分析における領域の区切り。 (A)分析する領域を区切り、パラメータとラスター幅を100μmに編集します。 (B)マトリックスクラスターの識別と質量リストの作成。(C)データのキャリブレーションと2Dデータツールの保存。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は利益相反がないことを宣言します。