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方法論記事

マウスの挫傷性脊髄損傷モデルのための自動インパクター

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DOI:

10.3791/65656

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2024年1月19日

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1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、さまざまな程度の脊髄損傷挫傷モデルを正確に作成できる、マウス用の新しい自動脊髄損傷挫傷装置を紹介します。

要約

交通事故や転倒などの外傷による脊髄損傷(SCI)は、永久的な脊髄機能障害と関連しています。脊髄に衝撃を与えることによる脊髄損傷の挫傷モデルの作成は、臨床診療におけるほとんどの脊髄損傷と同様の病状をもたらします。脊髄損傷の研究には、正確で再現性が高く、便利な脊髄損傷の動物モデルが不可欠です。脊髄損傷挫傷モデルを精度、再現性、利便性で作成できる、マウス用の新しい自動脊髄損傷装置である広州済南大学スマート脊髄損傷システムを紹介します。このシステムは、自動化されたモバイルプラットフォームと高度なソフトウェアを組み合わせたレーザー距離センサー を介して 、さまざまな程度の脊髄損傷のモデルを正確に生成します。このシステムを用いて、3段階の脊髄損傷マウスモデルを作成し、バッソマウススケール(BMS)スコアを決定し、その正確性と再現性を実証するために、行動アッセイと染色アッセイを実施しました。この装置を使用した傷害モデルの開発の各ステップを示し、標準化された手順を形成します。この方法では、再現性のある脊髄損傷挫傷マウスモデルを作成し、便利な取り扱い手順により人間の操作要因を減らします。開発された動物モデルは、脊髄損傷のメカニズムと関連する治療アプローチを研究するための信頼性があります。

概要

脊髄損傷は、通常、損傷した部分の下に永久的な脊髄機能障害を引き起こします。交通事故や転倒など、脊椎に当たる物体や脊椎の過伸展によって引き起こされることがほとんどです1。脊髄損傷に対する有効な治療法の選択肢は限られているため、動物モデルを用いた脊髄損傷の病因の解明は、適切な治療アプローチの開発に有益です。脊髄への衝撃によって引き起こされる脊髄損傷の挫傷モデルは、ほとんどの臨床的脊髄損傷症例と同様の病態を持つ動物モデルの開発をもたらします2,3。したがって、脊髄損傷挫傷の正確で再現性があり、便利な動物モデルを作成することが重要です。

1911年にアレンが脊髄損傷の最初の動物モデルを発明して以来、脊髄損傷動物モデルを確立するための機器の開発に大きな進歩がありました4,5。脊髄損傷モデルは、損傷のメカニズムに基づいて、挫傷、圧迫、伸展、脱臼、離断、または化学物質に分類されます6。その中で、外力を利用して脊髄を変位させ、傷つける挫傷モデルは、ほとんどの脊髄損傷患者の臨床病因に最も近いものです。したがって、挫傷モデルは、脊髄損傷研究で多くの研究者によって使用されてきました3,7。脊髄損傷挫傷モデルの開発には、さまざまな機器が使用されています。ニューヨーク大学(NYU)の多施設動物脊髄損傷研究(MASCIS)のインパクターは、ウェイトドロップデバイス8によって脊髄損傷挫傷を引き起こします。いくつかのバージョンが更新された後、MASCISインパクターは脊髄損傷挫傷動物モデルの開発に広く使用されています9。しかし、MASCISのインパクトロッドが落下して脊髄に当たると、複数の損傷が発生することがあり、脊髄損傷モデルの損傷の程度に影響を与えます。さらに、機器の精度と製造モデルの再現性を確保するために機械的精度を達成することも困難です。無限の地平線インパクターは、重い落下ではなく脊髄に加わる力を制御することによって挫傷を引き起こす10。センサーに接続されたコンピューターを使用して、インパクターと脊髄の間の衝撃力を直接測定します。閾値に達すると、インパクターは直ちに後退し、それによって重量の跳ね返りを回避し、精度を向上させる10,11。しかし、この微細な運動モダリティを使用して損傷を与えると、一貫性のない損傷や機能障害が生じる可能性があります6。オハイオ州立大学(OSU)の装置は、電磁ドライバ12,13によって脊髄の背側表面を過渡的な速度で圧縮する。この装置は、短距離の圧迫を使用して脊髄損傷を引き起こすため、無限の地平線インパクターに似ています。しかし、零点の初期決定は、脳脊髄液6,14の存在による誤差を引き起こすという点で種々の限界を有する。要約すると、脊髄損傷挫傷動物モデルの開発に使用できる機器は多数ありますが、それらすべてにいくつかの制限があり、動物モデルの精度と再現性が不十分です。したがって、脊髄損傷のマウス挫傷モデルをより正確、便利、再現性よく作成するためには、自動化されたインテリジェントな脊髄損傷インパクターが必要です。

新しい脊髄損傷インパクターである広州済南大学スマート脊髄損傷システム(GスマートSCIシステム; 図1)、脊髄損傷挫傷モデルを作成するため。このデバイスは、位置決めデバイスとしてレーザー距離計を使用し、自動化されたモバイルプラットフォームと組み合わせて、ストライク速度、ストライク深度、滞留時間などの設定されたストライクパラメータに従ってストライクを自動化します。自動運転により、人的要因が軽減され、動物モデルの精度と再現性が向上します。

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プロトコル

動物を用いた研究は、済南大学の倫理委員会によって審査され、承認されました。

1.動物の麻酔とT10脊椎椎弓切除術

  1. この研究では、8週齢の雌の若年成体C57 / 6Jマウスを使用します。ケタミン(100 mg / kg)とジアゼパム(5 mg / kg)の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。疼痛反射の喪失によって示される麻酔の成功を確認します。.麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医の軟膏を目に塗ります。
  2. ネズミの背中の毛をシェーバーで剃り、肌を露出させます。ヨードフォアとアルコールを交互に3回繰り返して皮膚を消毒します。
  3. メスで背側皮膚を内側縦2.5cm切開し、ピンセットでT9-T11レベルで脊椎を露出させます。
  4. 脊椎固定具を使用して T10 ファセットを両側で固定します。脊椎が安定して固定されていることを確認してください。傍脊椎筋が剥がれていることを確認し、マイクログラインディングドリルを使用して棘突起と椎弓を取り除き、T10セグメントの脊髄を露出させます。

2. GスマートSCIシステムを用いたT10脊髄の挫傷

  1. スイッチをオンにして、デバイスが自動的に元の状態に戻るのを待ちます。脊椎固定具をGスマートSCIシステムに配置し、ネジで固定します。
  2. 操作用タッチスクリーン(図2A)を使用して、衝撃速度(1 m/s)、衝撃深さ(3組のマウスで0.5 mm、0.8 mm、1.1 mm)、滞留時間(500 ms)などの損傷パラメータを設定します15。
  3. プラットフォームを動かして、露出した脊髄の中心にレーザー距離計を合わせます。(図2B)
  4. タッチスクリーンの[Ready](準備完了)ボタンをクリックします(図2C)。インパクトヘッドは、設定パラメータに基づいて特定の高さに自動的に調整されます。キャリアテーブルは、脊髄の衝撃部位をインパクトヘッドの下に自動的に移動させます。
  5. インパクトヘッドを手動で押して、インパクトサイトをさらに決定します。 [スタート ]ボタンをクリックすると、設定されたパラメータに基づいてインパクトヘッドが脊髄に当たります。
  6. マウスを装置から取り出し、実体顕微鏡(20倍)で観察して脊髄損傷を判断します(図3)。モデル開発の成功を判断するには、局所的なうっ血、虚脱、および脊髄膜破裂を観察します。
  7. 筋肉、筋膜、皮膚を3-0の縫合糸で層ごとに縫合します。マウスを温かい箱に入れ、回復を待ちます。

3. 術後のケア

  1. 手術後7日間、メロキシカム(5 mg / kg)を毎日皮下注射します。.膀胱の機能が回復するまで、8時間ごとに手動で膀胱を空にします。.
  2. 手術後14日目に、縫合糸を取り外します。

4.脊椎損傷の影響のテスト

  1. 術後最初の日目からマウスのBMSスコアを計算します16,17。
  2. 術後30日目に、キャットウォーク、フットフォルト、ロータロッド16,17などの動物行動実験を行います。キャットウォーク:45cmの記録距離。最大実行時間8秒。カメラゲイン28.02;強度しきい値 0.01。フットフォルト:マウスごとに60歩を記録します。ロータロッド:回転数20rpm。マウスが落下するまでの時間を記録し、120秒以上120秒として記録します。
  3. 術後31日目に、ケタミン(100mg/kg)とジアゼパム(5mg/kg)の腹腔内注射でマウスに麻酔をかけ、4%PFAを用いた灌流により安楽死させる。脊髄を慎重に取り外し、パラフィン包埋のために損傷部位の上下5mmを遮断します。マウス脊髄損傷の中心を5μm切片とし、ヘマトキシリンとエオシンの染色を行う17。
  4. 統計分析には、市販のソフトウェアを使用してください。データを平均±平均の標準誤差(SEM)として表し、一元配置分散分析を使用して比較します。0.05

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結果

椎弓切除術は、上記のように24匹の雌マウス(8週齢)に対して実施された。偽群(n=6)のマウスは脊髄損傷を受けなかったが、0.5mm群(n=6)、0.8mm群(n=6)、1.1mm群(n=6)を含む残りのマウスは、異なる深さの脊髄インピンジメントを受けた。BMSスコアは、術後1か月まで定期的に記録されました(図4)。異なる群のマウスの術後BMSスコアには有意差があった。1ヶ月後、0.5mm群のマウスは術後スコアが4〜6となり、偽群と同程度に回復した。0.8mm群と1.1mm群のマウスは、術後スコアが1〜2であった。1ヶ月後、0.8mm群は4〜6スコアに回復したが、1.1mm群のマウスはほとんど回復しなかった。

1ヶ月後、足のフォルト、ロータロッド、キャットウォークなどの動物行動アッセイを実施しました。足の故障アッセイ(図5A)では、0.5mm群と偽群の間で後肢の足の断裂に有意差はありませんでした。しかし、0.8mm群の後肢足の断層は、他のすべての群と有意に異なって...

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ディスカッション

脊髄損傷は、感覚障害や運動障害を引き起こし、重度の身体的および精神的障害を引き起こす可能性があります。中国では、省によって脊髄損傷の発生率は100万人あたり14.6人から60.6人までさまざまである18。SCIの有病率の増加は、医療システムにさらなる圧力をかけるでしょう。現在、脊髄損傷、その病態メカニズムと修復プロセスがまだ完全に理解されていないため、損傷に対する効果的な治療法の選択肢は限られています19。脊髄損傷の病態メカニズムと修復過程を調査するために、正確で再現性のある脊髄損傷動物モデルを作成する必要があります。この目的のために、私たちは正確で再現性があり、シンプルな脊髄損傷器具を開発しました。

脊髄損傷の挫傷モデルを作成するために、NYU-MACISインパクター、インフィニットホライズンインパクター、OSUインパクターなど、多くの装置が使用されています8,9,12,13,20。

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会第82102314号(ZSJ宛)、32170977(HSL宛)、広東省自然科学基金会(No.2022A1515010438)(ZSJ宛)および2022A1515012306号(HSL宛)の支援を受けて行われました。この研究は、中国曁南大学第一附属病院の臨床フロンティア技術プログラム、番号JNU1AF-CFTP-2022-a01206(HSLへ)の支援を受けました。本研究は、広州科学技術計画プロジェクト第 202201020018号(HSLへ)、2023A04J1284(ZSJへ)、2023A03J1024(HSLへ)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.01M PBS(粉末、pH7.2-7.4)Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-TribromoethanolMacklin75-80-9
4%パラホルムアルデヒド組織固定剤Biosharp Life scienceBL539A
BiomicroscopeLeicaLCC50 HD
CatWalk ノルダス情報技術CatWalk XT 9.1
カバーガラスCITOTEST Scientific10212432C
埋め込み機常州 Zhongwei 電子機器BMJ-A
エタノール 絶対DAMAO64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
スライドガラスCITOTEST Scientific80302-2104
ヘマトキシリンおよびエオシン染色キットBeyotime BiotechnologyC0105S
マイクログラインディングドリル FEIYUBIO19-7010
マウス脊椎固定器RWD ライフサイエンス68094
パラフィン ミクロトームサーモシャンドンフィネス 325
マウス用 RotaRodウーゴ バジーレ47600
実体顕微鏡KUY NICESZM-7045
Tert-アミルアルコールマックリン75-85-4
キシレン中国国立医薬品#10023418

参考文献

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