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方法論記事

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

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DOI:

10.3791/65658

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2023年11月21日

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1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2 PVを使用して、COVID-19ワクチン接種後の患者の血清の中和能力をテストする方法を示す詳細なプロトコルを紹介します。

要約

シュードタイプウイルス(PV)は、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和能力をテストするために使用できる分子ツールであり、目的遺伝子を送達するための遺伝子治療での使用がよく知られています。PVは、ウイルスゲノムがPVに取り込まれない異なるプラスミドに分割されているため、複製に欠陥があります。この安全で汎用性の高いシステムにより、バイオセーフティレベル2のラボでPVを使用できます。ここでは、ここで述べた3つのプラスミドに基づいてレンチウイルスPVを産生する一般的な方法論を提示します:(1)感染を監視するために必要なレポーター遺伝子を運ぶバックボーンプラスミド。(2)PVを生成するために必要なすべての構造タンパク質の遺伝子を運ぶパッケージングプラスミド。(3)ウイルスの向性を決定し、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するエンベロープ表面の糖タンパク質発現プラスミド。この研究では、SARS-CoV-2スパイクは、非複製性SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの産生に使用されるエンベロープ糖タンパク質です。

簡単に説明すると、パッケージング細胞(HEK293T)を標準的な方法を用いて3つの異なるプラスミドと同時トランスフェクションしました。48時間後、PVを含む上清を回収し、ろ過し、-80°Cで保存した。 SARS-CoV-2 PVの感染力は、感染後48時間後の標的細胞株におけるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の発現を調べることによってテストされました。相対発光単位(RLU)の値が高いほど、感染/形質導入率は高くなります。さらに、感染性PVを段階希釈した血清サンプルに添加して、偽ウイルスが標的細胞に侵入する中和プロセスを調べ、RLU強度の低下として測定しました。

概要

偽型ウイルス(PV)は、微生物学において宿主ウイルスおよび病原体と病原体の相互作用を研究するために使用される分子ツールです1,2,3,4。PVは、ウイルスゲノムを保護するウイルスコアである内側の部分と、ウイルスの表面にあるエンベロープ糖タンパク質である外側の部分から構成され、屈性を規定しています5。偽ウイルスは、新しいウイルス粒子を生成するためのすべての遺伝情報を含んでいないため、標的細胞内で複製する能力がありません。この独特な特徴の組み合わせにより、PVは野生型ウイルスの安全な代替品となります。一方、野生型ウイルスは病原性が高く、BSL2の検査室では分析に使用できない6。

PVの感染力は、通常、蛍光タンパク質(GFP、RFP、YFP)または化学発光産物を産生する酵素(ルシフェラーゼ)をコードするレポーター遺伝子によってモニターできます。これは、PV産生に用いられるプラスミドの1つに含まれ、偽ウイルス7のゲノムに組み込まれる。

現在、HIV-1ゲノムに基づくレンチウイルス由来の粒子など、いくつかの種類のPVコアが存在します。HIV-1ベースのPVが他のプラットフォームよりも優れている点は、標的細胞ゲノム8への本質的な統合プロセスです。HIV-1は感染力の強いウイルスであり、エイズの原因物質ですが、これらのレンチウイルスベクターは、長年にわたる広範な最適化ステップにより、安全に使用できます。最適な安全条件は、形質導入能力に影響を与えることなくウイルス遺伝子を枯渇させた第2世代レンチウイルスベクターの導入によって達成されました9。第3世代と第4世代は、ウイルスゲノムを別々のプラスミドにさらに分割することで、レンチウイルスベクターの取り扱いの安全性の向上に貢献しました10,11。最新世代のPVは、一般的に遺伝子治療用のレンチウイルスベクターの製造に用いられています。

PVは、ウイルスと宿主細胞の間の相互作用を研究するために、生産段階と感染段階の両方において使用できます。PVは、特に偽ウイルス中和アッセイ(PVNA)に用いられます。PVNAは、PVのエンベロープ上のウイルス糖タンパク質を標的とすることにより、血清または血漿の中和能を評価するために広く検証されています12,13。中和活性は、阻害濃度50(IC50)として表され、ウイルス粒子の侵入の50%を遮断する血清/血漿の希釈として定義される14。このプロトコルでは、ブースターワクチンの接種前後に採取した血清中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)に対する抗体活性をテストするためのPVNAのセットアップについて説明しました。

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プロトコル

現在のプロトコルは、ヴェローナ大学の倫理委員会(承認プロトコル番号1538)によって承認され、それに従っています。インフォームドコンセントは、研究に参加している被験者から得られました。全血サンプルは、抗SARS-CoV-2ワクチンの接種過程にあった医療従事者(HCW)ボランティアから採取されました。これらのサンプルは、その後の血清15の単離のために抗凝固剤を含むプラスチックチューブに収集されました。

以下のすべてのプロセスは、クラス2の生物学的フードで実行し、無菌条件下で作業する必要があります。ウイルスの取り扱いは慎重に行う必要があり、すべての廃棄物は希釈された漂白剤溶液で中和する必要があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。

figure-protocol-1
図1:中和アッセイのグラフ表示。 (A)PV生産、(B)PV滴定、および(C)中和アッセイ。すべての手順は、クラス2の生物学的フード内で無菌条件下で行われます。滴定ステップ(B)は、中和アッセイ(C)で使用する前にPVの感染レベルを標準化するために実行する必要があります。この図は BioRender で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

1. SARS-CoV-2 PVの生産と感染力試験

  1. 5 x 105 HEK293T細胞を完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、高グルコース、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を6ウェルプレート(6WP)に播種し、使用するトランスフェクション試薬に適合する適切な細胞密度に到達します。ポリエチレンイミン(PEI)を用いてトランスフェクションを行う場合(メーカーの指示に従って試薬を調製してください)、トランスフェクション当日に細胞が40〜60%の密度に達するようにします(ステップ1.3)。細胞を加湿したインキュベーターで37°C、5%CO2で保管します。




figure-protocol-2


figure-protocol-3

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結果

このプロトコルでは、SARS-CoV-2 PVの産生と、抗COVID-19ワクチン接種を受けている被験者の血清/血漿の中和活性を分析するためのこれらのPVの下流アプリケーションについて説明します17。さらに、このプロトコルを適用して、懸念される各SARS-CoV-2変異株(VOC)の偽型を生成して、中和応答の進化をテストできます。このプロトコルは、COVID-19ワクチン接種後の液性免疫応答の研究を容易にするにもかかわらず、さまざまなウイルスに対するさまざまな血清/血漿の中和を簡単にテストできるように適応させることができます13,18,19。

図4A は、RLUシグナルの増加に対応する血清の希釈率(Log(dilution))の増分を表しています。したがって、サンプルの希釈率が高いほど、ウイ...

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ディスカッション

野生型ウイルスの使用は実際の感染をシミュレートしますが、レンチウイルスPVは、病原性ウイルスを扱うために必要な厳格な安全要件なしに、ウイルスの侵入と感染に関連するメカニズムを研究するためのより安全な選択肢です4,20,21。PVは、複製欠損ウイルスコアと、本研究の目的である病原性ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質に囲まれたコアで構成されています。

HIV-1ベースのPVは、最も広く使用されているプラットフォームの1つであり、SARS-CoV-2偽ウイルス粒子の製造のためにこのプロトコルで採用されています。レポーター遺伝子は、PVの使用によって異なる場合があります。この場合、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を選択することで、産生されたPVの感染性を簡単、迅速、かつ高感度に読み取ることができます。

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

私たちは、医療従事者のボランティアの貢献に感謝します。このプロジェクトは、イタリアのMURにあるDepartment of Excellence 2023/2027の支援を受けました。ARとDZはPRIN2022(EUの資金援助;ネクストジェネレーションEU)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 μ;m フィルターSARSTEDT83 1826
6 ウェルプレートSARSTEDT83 3920
96 ウェルプレートSARSTEDT8,33,924
Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニットメルク10403892
黒色不透明 96 ウェル マイクロプレートパーキン エルマー60005270
ダルベッコのモディファイド イーグル ミディアム SIGMA-ALDRICHD6546 - 500ML
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS 1x)AUROGENEAU-L0615-500
ウシ胎児血清AUROGENEAU-S1810-500
Graphpad Prism version 7graphpad dotmaticsNA原稿では、商品名を「データ分析プログラム」に置き換え
HEK293T細胞ATCCCRL-3216
HEK293T/ACE2細胞ATCCCRL-3216HEK293Tは、レンチウイルスベクターでACE2を過剰発現するように形質導入されています。
L-グルタミン AUROGENEAU-X0550-100
ルミノメーター - Victor3Perkin ElmerHH35000500原稿では、商品名を  'luminometer'  に置き換えています。
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021原稿では、商品名を「還元血清培地」に置き換えています。
p8.91 パッケージングプラスミドDi Genova et al., 2021ナイジェル・テンパートン教授からの親切な贈り物 (参考文献 16.)
pCSFLW reporter plasmidDi Genova et al., 2021ナイジェル・テンパートン教授からの親切な贈り物 (参考文献 16.)
ペニシリン/ストレプトマイシンAUROGENEAU-L0022-100
ポリエチレン、分岐 (PEI) (25 kDa)SIGMA-ALDRICH408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)Addgene145839
を発現する HEK293Tcells/ACE2 SARS-CoV-2 Spike の生成に使用されましたステディライトプラスレポーター遺伝子アッセイシステムパーキン・エルマー6066759原稿では、商品名を「ルシフェラーゼ読み取り試薬」に置き換えましたトリ
プシンEDTA 1xAUROGENEAU-L0949-100
ています このプラスミドは、プラスミド Addgene pGBW-m4137382

参考文献

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