方法論記事

EV活性化凝固時間(EV-ACT)を用いた細胞外小胞(EV)の凝固促進活性の決定

DOI：

10.3791/65661

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2023年8月4日

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1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、EVの凝固能力の指標として細胞外小胞(EV)が豊富な血漿の使用を調査します。EVに富む血漿は、差動遠心分離とその後の再石灰化のプロセスによって得られます。

要約

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さまざまな疾患における細胞外小胞(EV)の役割は、特に強力な凝固促進活性により、ますます注目を集めています。しかし、臨床現場でのEVの凝固促進活性を評価するためのベッドサイドテストが緊急に必要とされています。この研究は、EVの凝固促進活性の尺度として、EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間の使用を提案しています。標準化された手順を使用してナトリウムクエン酸全血を採取し、続いて差動遠心分離を行ってEVに富む血漿を得ました。EVリッチ血漿と塩化カルシウムをテストカップに加え、分析装置を使用して粘弾性の変化をリアルタイムで監視しました。EV-ACTと呼ばれるEVリッチプラズマの自然凝固時間を決定しました。その結果、健康なボランティアから得られた血漿からEVを除去するとEV-ACTが有意に増加し、EVを濃縮すると有意に減少することが明らかになりました。さらに、子癇前症、大腿骨頸部骨折、肺がんのヒト検体ではEV-ACTが有意に短縮され、血漿EV濃度の上昇と血液凝固亢進の促進が示された。EV-ACTは、その簡単で迅速な手順により、血漿EVレベルが高い患者の凝固機能を評価するためのベッドサイドテストとして有望です。

概要

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凝固亢進によって引き起こされる血栓症は、脳外傷1、子癇前症2、腫瘍3、骨折患者4など、さまざまな疾患で重要な役割を果たしています。凝固亢進のメカニズムは複雑であり、近年、凝固障害における細胞外小胞(EV)の役割が注目されています。EVは、直径10nmから1000nmの範囲で、細胞膜から剥離する二重層構造を持つ小胞状の物体です。それらはさまざまな疾患プロセス、特に凝固障害に関連しています5。いくつかの研究により、EVが血栓症リスクの有望な予測因子であることが確認されています6,7。EVの凝固促進活性は、凝固因子、主に組織因子(TF)とホスファチジルセリン(PS)の発現に依存します。強力な凝固促進活性を持つEVは、テナーゼとプロトロンビン複合体の触媒効率を大幅に高め、それによってトロンビン媒介性フィブリノーゲンと局所血栓症を促進します8。EVのレベルの上昇と凝固亢進との因果関係は、多くの疾患で観察されています9。したがって、EVの検出を標準化し、その凝固促進活性を報告することは、重要な調査分野です10。

現在まで、EVの凝固促進活性を検出するための市販キットはごくわずかです。MP-ActivityアッセイおよびMP-TFアッセイは、営利企業によって製造され、血漿中のEVの凝固促進活性を測定するために使用される機能アッセイです11。これらのアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイと同様の原理を採用して、EVのPSおよびTFを検出します。しかし、これらのキットは高価であり、少数の高レベルの研究機関に限定されています。このプロセスは複雑で時間がかかるため、臨床現場での実装は困難です。さらに、市販の凝固促進剤リン脂質(PPL)アッセイは、PSフリー血漿と試験血漿を混合し、凝固時間を測定してPS陽性EVのレベルを定量的に検出します12。しかし、これらのアッセイは、主にEVのPSとTFに焦点を当てており、循環するEVが関与している可能性のある他の凝固経路を見落としています12。

血漿凝固システムは複雑で、凝固剤、抗凝固剤、線溶系、血漿中に懸濁したEVなど、「目に見えない」成分と「見える」成分の両方で構成されています。生理学的には、これらの成分は動的なバランスを維持しています。病理学的状態では、循環中のEVの有意な増加は、特に脳外傷、子癇前症、骨折、およびさまざまな種類の癌の患者において、凝固亢進に寄与します13。現在、臨床検査室における凝固状態の評価は、主に凝固系、抗凝固系、および線溶系の評価を含む14,15,16,17。プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、トロンビン時間、および国際正規化比は、凝固システム18における凝固因子レベルを評価するために一般的に使用される。しかし、最近の研究では、これらの検査が特定の疾患の凝固亢進を完全には反映していないことが明らかになっています19。血栓エラストメトリー(TEG)、回転TEG、ソノクロット分析などの他のアッセイ法では、全血の粘弾性変化を測定します20,21。全血検体には多数の血球と血小板が含まれているため、これらの検査は検体全体の凝固状態を示す可能性が高くなります。一部の研究者は、凝固促進活性における血球と血小板の役割について報告しています22,23。最近の研究では、以前の凝固機能検査では、微粒子の凝固促進活性の変化を検出するのが困難であることも発見されました24。そこで、EVリッチ血漿中の活性化凝固時間(ACT)の粘弾性測定により、EVの凝固促進機能を評価できるという仮説が提唱されている。

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プロトコル

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ヒト検体の収集は、天津医科大学総合病院の医療倫理委員会によって承認されました。ヒト静脈血の採取は、中国国家衛生健康委員会が発行したガイドライン、すなわちWS / T 661-2020静脈血検体の収集に関するガイドラインに厳密に従いました。簡単に説明すると、前上腕静脈からインフォームドコンセントを得て健康な人から血液を採取し、サンプルを3.2%クエン酸ナトリウム抗凝固剤を使用して1:9の比率で混合しました。クエン酸ナトリウム抗凝固剤検体のみを採取した場合、最初の採取容器は廃棄した。処理フローは、サンプル採取から 0.5 時間以内に開始されました。成人の健康な被験者は、インフォームドコンセントを得た後、サンプル収集のために募集されました。患者の除外基準は、(1)最近の血管内血栓症、(2)肝および腎機能障害、(3)高血圧、高脂血症、糖尿病、およびその他の慢性疾患、(4)アスピリンまたは抗凝固剤治療、(5)月経および妊娠でした。.

1. EVリッチプラズマの分離

  1. サンプルを室温で120 x g で20分間遠心分離し、血球を除去します。上清は多血小板血漿です。次に、上清の上部1/2をピペットで新しい遠心チューブに移します。
  2. 多血小板血漿を室温で1500 x g で20分間遠心分離し、血小板を除去します。上清は血小板に乏しい血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心チューブに移します。
  3. 血小板に乏しい血漿を13000 x g で室温で2分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清はEVリッチ血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心分離管に移し、その後の検査を行います。

2. 分析装置による試料のEV-ACTの検出

  1. 血栓分析装置( 材料表を参照)の電源を入れ、装置を37°Cに予熱します。 使い捨てプローブとテストカップを取り付けてから、機械の品質管理手順を開始します。
    注:画面上の粘性抵抗信号値が直線で表示されている場合は、検出が妨げられず、分析器の状態の品質管理が認定されていることを意味します。テスト手順は、セルフテストが認定された後に開始できます。
  2. サンプル情報をシステムに入力します。次に、200 μL の EV リッチ血漿をテストカップに移し、続いて 20 mM 170 μL の塩化カルシウムを移します。スタートボタンをクリックします。テストカップの磁気攪拌棒は、サンプルと塩化カルシウムを完全に混合します。カバーを閉じると、プローブはサンプル抵抗の変化を検出し始めます。
    注:テストが終了すると、アナライザーは自動的に「テストが完了しました」というプロンプトを表示します。EV-ACTの時刻は、システムによって表示および記録されます。結果は時間「秒」という単位で表されます。プローブを廃棄し、カップをテストします。

3. フローサイトメトリーによるEVリッチ血漿サンプルの品質管理

  1. EVはまず、そのサイズ(0.1-1μm)で識別されました。あらかじめフローサイトメーターのパラメータを調整し、市販のポリスチレンビーズ(0.5、0.9、3.0μm)を用いてEVの「ゲート」をセットします( 材料表参照)。
    注:ビーズ混合物は、マイクロベシクル(0.5および0.9μm)および血小板(0.9μmおよび3μm)のサイズ範囲をカバーする異なる直径の蛍光球で構成されています。
  2. 前方散乱光と側方散乱光の電圧を調整し、0.9 μmの微小球が適切な領域に収まるようにします。EV領域は、微小球の直径に応じて描くことができます。
  3. 50 μL の EV リッチ血漿をフローチューブに移し、続いて 450 μL のろ過済みリン酸緩衝生理食塩水を移します。フローチューブ内の液体を完全に混合します。最後に、フローサイトメトリー25を用いてサンプルを検出します。
  4. Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 材料表を参照)を使用して、EVs.In ブリーフの数を定量し、フロー検出前に10 μLの粒子をサンプルに添加し、サンプル検出完了後に次の式を使用してEV濃度を計算します:10,120 * EV(#)/(マイクロビーズ*容量)*希釈係数26。

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結果

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EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間は、プラズマ凝固時間測定用粘弾性法分析装置を用いて測定した。この機械は、電子信号変換器、プローブ、検出タンク、発熱体の4つの主要コンポーネントで構成されています(図1A、B)。このプローブは、高周波および低振幅の振動を利用して、プラズマ粘度の変化を検出します。日常の品質管理には、主にテストプラットフォームの安定性を評価し、プローブの物理的な障害を特定するための空気品質管理が含まれます。性能品質管理では、プローブによって検出された抵抗値が設定範囲内に収まることを確認するために、標準粘度オイルでテストします。

EVリッチ血漿を取得した後、サンプルの品質管理のためにフローサイトメトリーを使用してEVを測定しました。不適格なサンプルは、EVの「ゲート」付近にわずかに大きい粒子径の明瞭なクラスターを示します(図2A)。対照的に、EVリッチなサンプルは、ほとんどの信号が単一のグループとしてEVの「ゲート」内...

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ディスカッション

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本研究では、EVリッチ血漿の調製について記述し、フローサイトメトリーを用いてその方法の合理性を検証した。続いて、再石灰化した血漿試料を、粘弾性原理24に基づく血栓分析装置を用いてACT時間で分析した。図3Aに示すように、超遠心分離で得られたEVの濃度はEV-ACT時間を短縮する一方で、EVレベルを低下させた超遠心分離後の上清はEV-ACT時間を長くすることがわかりました。これらの知見は、EV-ACTの結果とEVレベルの間に密接な関係があることを示唆しています。図3Bでは、子癇前症、大腿骨頸部骨折、および肺がんの患者の血漿サンプルのEV-ACTを健康なボランティアと比較したところ、疾患群ではEV-ACT時間が有意に短いことが明らかになりました。以前の報告では、これらの疾患の血漿中の凝固促進EVのレベルの上昇が示されています27,28,29。

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開示事項

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すべての著者は、潜在的な利益相反はないと宣言しました。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学基金会(81901525年)の助成金第81930031号の助成金によって支援されました。さらに、機械と技術指導を提供してくれたTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co.、Ltd.に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles3.8 μm;Spherotech, Lake Forest, IL, USAMPの定量的検出用
カルシウムWerfen (中国)002000680020 mM
センチュリー クロット分析装置天津センチュリー 宜康医療技術開発有限公司原理は、粘弾性法でプラズマ粘度を測定することです
使い捨てプローブとテストカップ天津センチュリー宜康医療技術開発有限公司
LSR Fortessa フローサイトメーターBD, USA
MegamixポリスチレンビーズBiocytex, Marseille, France7801Megamixは、選択した直径のマイクロビーズの混合物で構成されています。メートル、0.9 &マイクロ;m と 3 µm.
塩化 MP の検出に使用

参考文献

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