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方法論記事

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

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DOI：

10.3791/65664

⸱

2023年11月10日

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。

要約

パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患や、がんなどの細胞障害は、ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝を乱す疾患の一部です。ミトコンドリアは、エネルギー代謝と細胞の生存と死に関与する細胞プロセスの両方を制御する細胞小器官です。このため、ミトコンドリア機能を評価するアプローチは、病理学的および生理学的プロセスにおける細胞の状態に関する重要な洞察を提供することができます。この点で、高分解能スピロメトリー(HRR)プロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする。さらに、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学の研究には、 ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のような遺伝的および実験的に扱いやすいモデルが必要です。

このモデルには、人間の生理学との類似性、迅速なライフサイクル、メンテナンスの容易さ、費用対効果、高いスループット能力、倫理的懸念の数の最小化など、いくつかの利点があります。これらの特性は、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールとしてそれを総合的に確立します。本研究では、ショウ ジョウバエ(Drosophila melanogaster )PINK1B9欠損変異体を用いたミトコンドリア機能の解析方法について説明する。 pink1 遺伝子は、ミトコンドリアネットワークから機能不全のミトコンドリアを除去するために重要なマイトファジーとして認識されるプロセスを通じて、PTEN誘導推定キナーゼ1をコードする役割を担っています。この遺伝子の変異は、PDの常染色体劣性早期発症家族性型と関連している。このモデルは、PDの病態生理学に関与するミトコンドリア機能障害を研究するために使用できます。

概要

ミトコンドリアは、アポトーシス調節、カルシウム恒常性、生合成経路への参加などの重要な機能を制御する細胞小器官です。自律的な遺伝物質を持つことで、細胞の維持や修復プロセスに貢献することができます。その構造には、細胞エネルギーに不可欠な電子伝達鎖と酸化的リン酸化が収められています1,2,3。特に、酸化的リン酸化(OXPHOS)によるアデノシン三リン酸(ATP)の生成により、エネルギー制御が実現しています2。ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝の乱れは、細胞の生存と死の両方で起こり4,5、癌などの幅広いヒト病状やパーキンソン病(PD)などの神経変性疾患にしばしば関連しています3,6。

パーキンソン病は、慢性、進行性、神経障害です。この病気の主な原因は、脳細胞、特に運動を制御する神経伝達物質ドーパミンの産生に関与する黒質の死です6,7,8。パーキンソニズムとミトコンドリア機能障害を結びつけた最初の観察は、1988年に、呼吸鎖複合体Iを阻害する毒素を用いた実験モデルで行われた9。

現在、ミトコンドリアの機能不全を評価する方法はいくつかあります10,11,12,1 3;ただし、従来のアプローチと比較して、高分解能スピロメトリー(HRR)は優れた感度と利点を示します13,14。例えば、HRRプロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする14,15。ミトコンドリアの機能障害は、無傷の細胞、単離されたミトコンドリア、さらにはex vivoで評価できます10,11,13,14。

ミトコンドリアの機能障害は、多くの病理学的および生理学的プロセスと密接に関連しています。したがって、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学を、遺伝的および実験的に扱いやすいモデルシステムを用いて研究することが重要です。この点で、ショウジョウバエであるショウジョウバエの研究にはいくつかの利点があります。このモデルは、遺伝物質としてのDNAの使用、一般的な細胞小器官、発生、免疫、細胞シグナル伝達に関与する保存された分子経路など、基本的な細胞特性とプロセスをヒトと共有しています。さらに、ショウジョウバエはライフサイクルが速く、メンテナンスが容易で、低コスト、高スループット、倫理的懸念が少ないため、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールを構成しています16,17,18,19,20。

さらに、PTEN誘導推定キナーゼ1(pink1)遺伝子の相同体がD. melanogasterで発現している。これは、マイトファジー8のプロセスを通じて損傷したミトコンドリアの除去に重要な役割を果たします。ヒトでは、この遺伝子の変異により、ミトコンドリア機能障害に関連する常染色体劣性家族性PDの素因となります8,21,22,23。したがって、ショウジョウバエは、PDの病態生理学の研究や、ミトコンドリアの機能不全と生体エネルギー学に焦点を当てた医薬品候補のスクリーニングのための強力な動物モデルです。そこで本研究では、D. melanogaster由来のPDモデルにおけるミトコンドリア機能を、SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration)プロトコルを用いたオロボロスのHRR法を用いて解析する方法を解説する。

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プロトコル

ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(ID番号:34749)のw1118(白)およびw[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9と呼ぶ)(FlyBase ID:FBgn0029891)を用いた。本研究では、雄のD. melanogaster PINK1B9欠損変異体を、対照群(遺伝的背景)として用いたw1118株の雄のD. melanogasterと比較した。胸部の変形や移動障害など、ハエが正しい遺伝子型(Pink1B9/Y)を持っていることを確認するために、他のパラメータは、Pink1B9変異ハエ24,25,26でよく説明されています。

1.動物と住居

  1. ハエを10 mLの標準食(酵母1.73%、大豆粉0.9%、トウモロコシ粉7.3%、寒天0.5%、コーンシロップ7.6%、プロピオン酸0.48%)を含むガラス瓶に入れ、恒温恒湿(それぞれ25°Cおよび60%)で、12時間:12時間の明暗サイクルで保管します。
  2. 各実験では、閉鎖後1〜3日で熟成した2匹のハエを使用します。
    注: PINK1B9-null変異型処女雌バエを w1118 雄と交配し、遺伝子型Pink1B9/YのF1雄を得た。

2. サンプル調製

  1. 表 1 の説明に従って MiR05 バッファーを準備します。
  2. 氷の上でハエを麻酔し、微量遠心チューブ(チューブごとに2匹のハエ)に移します。
  3. 各チューブに、200 μL の冷蔵 MiR05 バッファーを添加し、ハエをホモジナイズします。ミトコンドリアの崩壊を防ぐために、穏やかな圧力(乳棒の約4〜6ストローク)を加えて、手動で均質化します。

3. ポーラログラフ式酸素センサの高分解能スピロメトリー校正

注:オロボロスチャンバーの総容量は約2 mLです。アッセイを開始するには、酸素流束が0pmolに近いことを確認するためのキャリブレーションが必要です。

  1. キャリブレーションを開始し、2 mL の MiR05 をチャンバーに加えます。チャンバーをストッパーで覆い、気泡を残さないようにします。次に、ストッパーを慎重に引いて、1つの気泡を形成します。
  2. OROBOROS Dat.Labソフトウェアを開きます。[Block temperature]フィールドに温度として25°Cを入力し、[Connect to Oxygraph-2k]をクリックします(図1A)。
  3. キャリブレーションを保存するフォルダをクリックして選択し、[ 保存]をクリックします。
  4. 新しいウィンドウが開いたら、実験とサンプルに名前を付け(キャリブレーションする場合は、 キャリブレーションという名前を入力するだけです)、[ 保存]をクリックします。
  5. [Layout](レイアウト)メニューに移動し、図1Bに示すように、最初のオプションとして[01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp]を選択します。
  6. プログラムがキャリブレーションレイアウトにリダイレクトされるのを待ち、赤い線が0 pmol付近の点を持つ標準直線を示すまで待ちます。次に、赤い線が正確にゼロにあるときに、チャンバーAとチャンバーBの2つのポイントを選択します(図1C)。
    注: 選択したポイントには、0 付近に酸素流束(赤い線)が必要です。
    1. 両方のチャンバーのポイントをマークするには、画面の右側でO2濃度を選択し、マークされたポイントを選択して、ポイントを基準にした温度と気圧の両方の値をコピーします。これらの値を下のボックスに貼り付け、画面の右下隅にある [Calibrate and Copy to Clipboard] をクリックします (図 2 を参照)。
    2. このプロセスを両方の チャンバー (A と B)に対して実行し、[ ファイル ]メニューに移動して[ 保存して切断]を選択します。
      注意: キャリブレーションプロセスの後、プログラムはユーザーをホーム画面にリダイレクトし、ソフトウェアがHRRテストを開始する準備が整います。このテストでは、SUITプロトコルを使用します。

4. SUITプロトコル

  1. キャリブレーションが完了したら、ストッパーを取り外してチャンバーを開きます。
  2. ストッパー(試料に触れない先端を保持する)とチャンバーをエタノール100%、エタノール70%、蒸留水の順に洗浄する。
    注:サンプルを交換するたびに、このプロセスを繰り返します。
  3. 200 μLのバッファーでハエをホモジナイズし、マイクロピペットを使用してすべてのサンプルをチャンバーに入れ、気泡を発生させないように注意しながらチャンバー内のストッパーを再配置します。
    注:気泡が発生した場合は、ストッパーを慎重に取り外し、100 μLのMIR05バッファーを加えます。
  4. [Layout]メニューをクリックし、図1Bに示すように、オプション05 Flow by Corrected Volumeを選択します。
  5. 新しいウィンドウにリダイレクトされるのを待ちます。[ 保存 ] をクリックして、実験を保存するフォルダーを選択します。
  6. 別の新しいウィンドウが開くのを待ちます。スペース内の実験に「Experimental Code」という名前を付けます。次に、[Sample]フィールドでチャンバー内の各サンプルに「A」と「B」という名前を付け、Unitフィールドをunitに設定します。
    注:他の単位、たとえば、 数百万個の細胞 や mgを選択することもできます。
  7. このプロトコルでは 2 つのハエ(2 ユニット)を使用し、チャンバー容量が 2 mL であることを考慮し、[ 濃度 ]フィールドで 1 mL あたり 1 mL と定義します(図 1D)。
    注:ここでは、サンプル量はハエの数で正規化されました。ただし、この標準化は、サンプルのタンパク質含有量、ミトコンドリアDNAの定量、またはクエン酸合成酵素の活性によって実行できます。
  8. 酸素流束シグナル(赤線)が正の値で安定している場合は、基質、阻害剤、および脱共役剤の滴定からHRRプロトコルを開始します(図3)。その後のすべての試薬および機器を 表1に示す。
    1. ジギトニン(5 μg/mL)を添加してミトコンドリア膜を透過処理します。
    2. ピルビン酸(5 mM)、リンゴ酸(2 mM)、プロリン(10 mM)基質を添加し、酸素フラックスが増加して安定するまで待ちます。試薬を追加するたびにイベントをマークするには、キーボードの F4 キーを押して、各試薬 の名前 を入力します。
    3. ADP(5mM)を加えてミトコンドリア呼吸鎖を結合させ、酸素フラックスの増加と安定化を待ちます。
    4. コハク酸塩(10 mM)を添加し、酸素流束の増加と安定化を待ちます。
    5. オリゴマイシン(2.5 μM)を添加してATP合成酵素を阻害し、酸素フラックスの減少を観察します。
    6. 赤い線が安定するまで待ち、力価0.25 μMのカルボニル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾンシアン化物(FCCP)を使用してミトコンドリアの電子移動を分離し、最大酸素消費量に達するまで、赤線の上昇で示されます。酸素フラックスが安定したら、各複合体の阻害剤を1つずつ添加し始めます。
    7. 複合体I阻害剤であるロテノン(0.5 μM)を添加します。酸素フラックスの減少と安定化を待って、次の阻害剤を追加します。
    8. 複合体II阻害剤であるマロネート(5 mM)を添加します。酸素フラックスの減少と安定化を待って、次の阻害剤を追加します。
    9. 最後に、複合体III阻害剤であるアンチマイシン(2.5 μM)を添加します。酸素流束の減少とそれに続く増加と安定化を待ちます。
      注:酸素フラックスは正の値で安定する必要がありますが、ミトコンドリアタンパク質複合体の最後の阻害の値を下回る必要があります。
  9. 分析の最後に、マイクロピペットを使用してチャンバーの内容物をすべて除去します。必要に応じて、将来の分析のために-20°Cで保存してください。

5. データ解析

  1. データ分析には、適切な統計ソフトウェアパッケージを利用します。
  2. t検定を実行して、2つのグループ間の差を評価します。複数の処理を伴う状況では、分散分析(ANOVA)を統計的検定27として使用します。
  3. ソフトウェアによって生成されたグラフからO2 フラックス値を抽出します。OXPHOS CIは、ADPを添加した後のO2 フラックスの値を指します。OXPHOS CIIは、OXPHOS CI&CII - OXPHOS CIを引いたものです。OXPHOS CI&CIIは、コハク酸塩を添加した後に抽出されたO2 フラックスの値です。ETS CI&CIIは、FCCPを加算した後のO2 フラックス値です。ETS CI = FCCP - ロテノンおよび ETS CII = ロテノン - マロネート。
  4. ATP合成をOXPHOS(P)とLEAK(L)(P-L)の差として計算します28。
  5. OXPHOS/LEAK比(RCR = P/L)を計算して、呼吸制御比(RCR)を決定します。

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結果

ここで、PINK1B9 ヌルハエでは、OXPHOS CI(P = 0.0341)およびOXPHOS CI&II(P = 0.0392)状態のO2フラックスが減少する(図4)。この結果は、私たちのグループ29,30からの以前の調査結果でも観察されました。

CIとCIIは電子伝達系(ETS)の主要コンポーネントであり、CIはNADHからユビキノンへの電子の移動に関与し、CIIはコハク酸からユビキノンへの電子の移動に関与します31,32,33。PINK1B9ヌルハエは、ETS CI(P = 0.0338)...

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ディスカッション

HRRは、 D. melanogaster やその他の生物のミトコンドリア呼吸とエネルギー代謝を研究するための強力な技術です。ミトコンドリア機能を詳細かつ定量的に評価し、研究者が細胞の生体エネルギー学に関する洞察を得ることを可能にします。ここに示されるプロトコルはD .のmelanogasterのスーツのプロトコルを使用してミトコンドリアの呼吸鎖機能そして特定のミトコンドリア複合体の活動の評価を記述する。SUITプロトコルでは、さまざまな基質、脱共役剤、および阻害剤を体系的に操作して、ミトコンドリア呼吸のさまざまな側面を調べます。

記載された技術により、OXPHOSまたはETS、デヒドロゲナーゼ活性(CIおよびCII)、および膜完全性(OXPHOSのカップリング)への影響に起因する呼吸抑制の評価が可能になります。ここでは、PINK1B9-nullハエを用いて実験を行い、PD34,35と関連しているミトコンドリ...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、ブラジルの機関Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)に謝意を表します。PM(#88887.512821/2020-00)とTD(#88887.512883/2020-00)は、研究フェローシップの受賞者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ADPシグマ-アルドリッチA5285アデノシン5′-二リン酸ナトリウムサル(CAS番号72696-48-1); ≥95%;分子量= 501.31 g / mol。
ÁgarKasvK25-1800細菌学用
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0) のアンチマイシン A 分子量  540 g/mol;
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA7030ウシ血清アルブミン (CAS番号 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
DatlabソフトウェアOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700データ収集および分析用ソフトウェア
DigitoninSigma-AldrichD 5628CAS番号 11024-24-1
蒸留水
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118Obtained   サンタマリア連邦大学
EGTAから Sigma-AldrichE8145エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (CAS番号 13638-13-3); ≥97%;分子量 =468.28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920シアン化カルボニル 4- (トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (CAS番号370-86-5);≥98%(TLC)、粉末 
GraphPad Prismバージョン8.0.1。データ取得および分析用ソフトウェア
HepesSigma-AldrichH40344-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸 (CAS番号 7365-45-9); ≥99,5%(滴定)、細胞培養試験済み。分子量 = 238.30 g/mol
高分解能呼吸計 Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02スタートアップ O2K 呼吸計キット
KH2PO4Sigma-AldrichP5379リン酸一カリウム (CAS 番号 7778-77-0);Reagente Plus、分子 weigt = 136.09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473水酸化カリウム (CAS 番号 1310-58-3);ACS試薬、≥85%、ペレット
MalateSigma-AldrichM1296マロン酸 (CAS 番号 141-82-2); 99%、分子量 = 104.06 g/mol)。溶液はpHを約7.0に調整します。
リンゴ酸Sigma-AldrichM1000(S)-(−)-2-ヒドロキシコハク酸(CAS番号97-67-6);≥95% ;分子量 = 134.09 g/mol
MESSigma-AldrichM36712-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (CAS 番号 4432-31-9); ≥99%(滴定);分子量 = 195.24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266塩化マグネシウム (CAS 番号 7786-30-3); 無水、≥98%、分子量= 95.21 g / mol
量遠心チューブエッペンドルフ
O2K-滴定セットOroboros Instruments、インスブルック、オーストリア20820-03ハミルトンシリンジ、容量の異なる
ゴマイシンSigma-AldrichO 4876オリゴマイシン from Streptomyces diastatochromogenes(CAS番号  1404-19-9);≥90% 総オリゴマイシンベース (HPLC)
雌しべから均質化
プロリンSigma-AldrichP0380L-プロリン (CAS 番号 147-85-3); 粉末; 99%; 分子量 = 115.13 g/mol
ピルビン酸Sigma-AldrichP2256ピルビン酸ナトリウム (CAS 番号 113-24-6), ≥99%;分子量 = 110.04 g/mol
ロテノンSigma-AldrichR8875ロテトン (CAS 番号 83-79-4); ≥95%, 分子量 394.42 g/mol
コハク酸Sigma-AldrichS 2378コハク酸ナトリウム二塩基性六水和物 (CAS 番号 6106-21-4); ≥99%
スクロースメルク107,651,000スクロース 微生物用 (CAS 番号 57-50-1)
タウリンシグマ - アルドリッチT0625CAS 番号 107-35-7
微オリ

参考文献

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