ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。
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方法論記事
ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患や、がんなどの細胞障害は、ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝を乱す疾患の一部です。ミトコンドリアは、エネルギー代謝と細胞の生存と死に関与する細胞プロセスの両方を制御する細胞小器官です。このため、ミトコンドリア機能を評価するアプローチは、病理学的および生理学的プロセスにおける細胞の状態に関する重要な洞察を提供することができます。この点で、高分解能スピロメトリー(HRR)プロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする。さらに、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学の研究には、 ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のような遺伝的および実験的に扱いやすいモデルが必要です。
このモデルには、人間の生理学との類似性、迅速なライフサイクル、メンテナンスの容易さ、費用対効果、高いスループット能力、倫理的懸念の数の最小化など、いくつかの利点があります。これらの特性は、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールとしてそれを総合的に確立します。本研究では、ショウ ジョウバエ(Drosophila melanogaster )PINK1B9欠損変異体を用いたミトコンドリア機能の解析方法について説明する。 pink1 遺伝子は、ミトコンドリアネットワークから機能不全のミトコンドリアを除去するために重要なマイトファジーとして認識されるプロセスを通じて、PTEN誘導推定キナーゼ1をコードする役割を担っています。この遺伝子の変異は、PDの常染色体劣性早期発症家族性型と関連している。このモデルは、PDの病態生理学に関与するミトコンドリア機能障害を研究するために使用できます。
概要
ミトコンドリアは、アポトーシス調節、カルシウム恒常性、生合成経路への参加などの重要な機能を制御する細胞小器官です。自律的な遺伝物質を持つことで、細胞の維持や修復プロセスに貢献することができます。その構造には、細胞エネルギーに不可欠な電子伝達鎖と酸化的リン酸化が収められています1,2,3。特に、酸化的リン酸化(OXPHOS)によるアデノシン三リン酸(ATP)の生成により、エネルギー制御が実現しています2。ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝の乱れは、細胞の生存と死の両方で起こり4,5、癌などの幅広いヒト病状やパーキンソン病(PD)などの神経変性疾患にしばしば関連しています3,6。
パーキンソン病は、慢性、進行性、神経障害です。この病気の主な原因は、脳細胞、特に運動を制御する神経伝達物質ドーパミンの産生に関与する黒質の死です
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プロトコル
ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(ID番号:34749)のw1118(白)およびw[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9と呼ぶ)(FlyBase ID:FBgn0029891)を用いた。本研究では、雄のD. melanogaster PINK1B9欠損変異体を、対照群(遺伝的背景)として用いたw1118株の雄のD. melanogasterと比較した。胸部の変形や移動障害など、ハエが正しい遺伝子型(Pink1B9/Y)を持っていることを確認するために、他のパラメータは、Pink1B9変異ハエ24,25,26でよく説明されています。
1.動物と住居
- ハエを10 mLの標準食(酵母1.73%、大豆粉0.9%、トウモロコシ粉7.3%、寒天0.5%、コーンシロップ7.6%、プロピオン酸0.48%)を含むガラス瓶に入れ、恒温恒湿(それぞれ25°Cおよび60%)....
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結果
ここで、PINK1B9 ヌルハエでは、OXPHOS CI(P = 0.0341)およびOXPHOS CI&II(P = 0.0392)状態のO2フラックスが減少する(図4)。この結果は、私たちのグループ29,30からの以前の調査結果でも観察されました。
CIとCIIは電子伝達系(ETS)の主要コンポーネントであり、CIはNADHからユビキノンへの電子の移動に関与し、CIIはコハク酸からユビキノンへの電子の移動に関与します31,32,33。PINK1B9ヌルハエは、ETS CI(P = 0.0338).......
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ディスカッション
HRRは、 D. melanogaster やその他の生物のミトコンドリア呼吸とエネルギー代謝を研究するための強力な技術です。ミトコンドリア機能を詳細かつ定量的に評価し、研究者が細胞の生体エネルギー学に関する洞察を得ることを可能にします。ここに示されるプロトコルはD .のmelanogasterのスーツのプロトコルを使用してミトコンドリアの呼吸鎖機能そして特定のミトコンドリア複合体の活動の評価を記述する。SUITプロトコルでは、さまざまな基質、脱共役剤、および阻害剤を体系的に操作して、ミトコンドリア呼吸のさまざまな側面を調べます。
記載された技術により、OXPHOSまたはETS、デヒドロゲナーゼ活性(CIおよびCII)、および膜完全性(OXPHOSのカップリング)への影響に起因する呼吸抑制の評価が可能になります。ここでは、PINK1B9-nullハエを用いて実験を行い、PD34,35と関連しているミトコンドリ.......
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開示事項
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、ブラジルの機関Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)に謝意を表します。PM(#88887.512821/2020-00)とTD(#88887.512883/2020-00)は、研究フェローシップの受賞者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ADP | シグマ-アルドリッチ | A5285 | アデノシン5′-二リン酸ナトリウムサル(CAS番号72696-48-1); ≥95%;分子量= 501.31 g / mol。 |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | 細菌学用 |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0) のアンチマイシン A 分子量 540 g/mol; |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | ウシ血清アルブミン (CAS番号 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlabソフトウェア | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | データ収集および分析用ソフトウェア |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS番号 11024-24-1 |
| 蒸留水 | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained サンタマリア連邦大学 | ||
| EGTA | から Sigma-Aldrich | E8145 | エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (CAS番号 13638-13-3); ≥97%;分子量 =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | シアン化カルボニル 4- (トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (CAS番号370-86-5);≥98%(TLC)、粉末 |
| GraphPad Prismバージョン8.0.1。 | データ取得および分析用ソフトウェア | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸 (CAS番号 7365-45-9); ≥99,5%(滴定)、細胞培養試験済み。分子量 = 238.30 g/mol |
| 高分解能呼吸計 Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | スタートアップ O2K 呼吸計キット |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | リン酸一カリウム (CAS 番号 7778-77-0);Reagente Plus、分子 weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | 水酸化カリウム (CAS 番号 1310-58-3);ACS試薬、≥85%、ペレット |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | マロン酸 (CAS 番号 141-82-2); 99%、分子量 = 104.06 g/mol)。溶液はpHを約7.0に調整します。 |
| リンゴ酸 | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-ヒドロキシコハク酸(CAS番号97-67-6);≥95% ;分子量 = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (CAS 番号 4432-31-9); ≥99%(滴定);分子量 = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 塩化マグネシウム (CAS 番号 7786-30-3); 無水、≥98%、分子量= 95.21 g / mol |
| 量遠心チューブ | エッペンドルフ | ||
| O2K-滴定セット | Oroboros Instruments、インスブルック、オーストリア | 20820-03 | ハミルトンシリンジ、容量の異なる |
| ゴマイシン | Sigma-Aldrich | O 4876 | オリゴマイシン from Streptomyces diastatochromogenes(CAS番号 1404-19-9);≥90% 総オリゴマイシンベース (HPLC) |
| 雌しべから均質化 | |||
| プロリン | Sigma-Aldrich | P0380 | L-プロリン (CAS 番号 147-85-3); 粉末; 99%; 分子量 = 115.13 g/mol |
| ピルビン酸 | Sigma-Aldrich | P2256 | ピルビン酸ナトリウム (CAS 番号 113-24-6), ≥99%;分子量 = 110.04 g/mol |
| ロテノン | Sigma-Aldrich | R8875 | ロテトン (CAS 番号 83-79-4); ≥95%, 分子量 394.42 g/mol |
| コハク酸 | Sigma-Aldrich | S 2378 | コハク酸ナトリウム二塩基性六水和物 (CAS 番号 6106-21-4); ≥99% |
| スクロース | メルク | 107,651,000 | スクロース 微生物用 (CAS 番号 57-50-1) |
| タウリン | シグマ - アルドリッチ | T0625 | CAS 番号 107-35-7 |
参考文献
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardi....
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