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方法論記事

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

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DOI:

10.3791/65672

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2024年1月26日

 ,  , 
1Innovative Regenerative Medicine, Kansai Medical University Graduate School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。

要約

無限の自己増殖能力を持つヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、希少疾患の病態解明、新薬開発、損傷臓器の修復を目的とした再生医療など、多くの分野での応用が期待されています。しかし、iPS細胞の社会実装はまだまだ限定的です。これは、iPS細胞が微細な環境変化に対して高い感度を持つため、高度な知識や高度な技術をもってしても、培養における分化の再現が困難であることも一因です。自動培養システムの適用により、この問題を解決できます。研究者の技量によらず、再現性の高い実験が、各機関で共通の手順で実施されることが期待されます。iPS細胞の培養を維持し、分化を誘導できる自動培養システムはこれまでにもいくつか開発されていますが、これらのシステムは、ヒト化された多関節ロボットアームを使用するため、重く、大きく、コストがかかります。上記の課題を改善すべく、シンプルなX-Y-Z軸スライドレール方式を採用し、小型・軽量・安価化を実現した新システムを開発しました。さらに、ユーザーは新しいシステムのパラメータを簡単に変更して、新しい処理タスクを開発することができます。タスクが決まれば、あとはiPS細胞を準備し、目的のタスクに必要な試薬や消耗品を事前に用意し、タスク番号を選択し、時間を指定するだけです。このシステムにより、iPS細胞をフィーダー細胞を使わずに数回継代で未分化状態に維持し、心筋細胞、肝細胞、神経前駆細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞種に分化できることを確認しました。これにより、熟練した研究者を必要とせず、施設間で再現性の高い実験が可能となり、新規参入の障壁が減り、より幅広い研究分野でのiPS細胞の社会実装が促進されます。

概要

本稿では、企業と共同で作製したヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の自動培養システムについて、実際の詳細な取り扱い手順と代表的な成果を示すことを目的としています。

2007年の論文発表以来、iPS細胞は世界中で注目を集めています1。あらゆる体細胞に分化できるという最大の特徴から、再生医療、難治性疾患の原因解明、新規治療薬の開発など、さまざまな分野への応用が期待されています2,3。また、ヒトiPS細胞由来の体細胞を用いることで、倫理的制約の大きい動物実験を減らすことができます。iPS細胞を用いた新しい方法の研究には、常に多くの均質なiPS細胞が必要ですが、その管理は手間がかかります。また、iPS細胞は感度が高いため、微妙な文化や環境の変化にも敏感に反応するため、取り扱いが困難です。

この問題を解決するために、自動化された培養システムが人間の代わりにタスクを実行することが期待されています。いくつかのグループは、細胞の維持と分化のためのいくつかの自動化されたヒト多能性幹細胞培養システムを開発し、その成果を発表しました4,5,6。これらのシステムは、多関節ロボットアームを装備しています。ロボットアームは、人間の腕の動きを高度に模倣するというメリットがあるだけでなく、アームのコストが高く、システムのパッケージングが大きくて重く、目的の動きを得るためにエンジニアの教育に時間がかかるというデメリットもあります7,8。経済的、スペース的、人的資源の消費の点で、より多くの研究施設に装置を導入しやすくするために、iPS細胞を様々な細胞種に維持・分化するための新しい自動培養システムを開発しました9。

新しいシステムの理論的根拠は、多関節ロボットアーム9の代わりにX-Y-Z軸レールシステムを採用することでした。ロボットアームの複雑な手のような機能を置き換えるために、3種類の特定の機能アームの先端を自動的に変更できるという新しいアイデアを適用しました。また、ここでは、プロセス全体を通してエンジニアの貢献が要求されないため、ユーザーがソフトウェア上で簡単な注文でタスクスケジュールを簡単に作成できることも示します。

ロボット培養システムの1つでは、96ウェルプレートを分化のための3D細胞凝集体として使用して胚様体を作ることを実証しました4。ここで報告するシステムでは、96 ウェルプレートを処理できません。1つは、ヒト多能性幹細胞ではなかったが、細胞株を用いて現在の適正製造基準(cGMP)グレードを達成した5。ここで詳述する自動培養システムは、実験室での実験を支援することを特に目的として開発されました(図1)。但しそれはレベルIVの安全キャビネットと同等のきれいなレベルを保つ十分なシステムを有する。

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プロトコル

関西医科大学倫理委員会は、KMUR001と名付けられた健康なボランティア由来iPS細胞の作製と使用を承認しました(承認番号2020197)。公然と募集されたドナーは、正式なインフォームドコンセントを提供し、細胞の科学的使用に同意しました。

メモ: 現在のインターフェイス(Windows XPオペレーティングシステムで実行されている「ccssHMI」という名前の特別なソフトウェア)は、基本的な操作画面です。前述のインターフェイスの下には、一連のタブが配置されており、ユーザーはさまざまな操作を開始できます。

1. ローディング作業

  1. ソフトウェアのトップ画面にある [読み込み 中]ボタンをクリックします。「 Loading Preparation Start 」ボタンをクリックします。
  2. 装置に入れる皿またはプレートを装置内の所定の位置に置きます。
    注意: 皿の識別に必要な情報は、各蓋に記入する必要があります。
  3. フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。
  4. ソフトウェアで料理またはプレートの種類と数量を選択します。
  5. 「 Loading Preparation Completed 」ボタンをクリックします。[ 読み込み開始 ]ボタンをクリックします。
  6. ディッシュをシステムにアップロードしたら、iPS細胞の有無など、ディッシュ上の情報をソフトウェア上で選択します。ソフトウェアに各料理に関するメモを登録します。
  7. 最後にある [登録 ]ボタンをクリックして、ロード操作を完了します。

2. 荷降ろし作業

  1. ソフトウェアのトップ画面にある[ アンロード ]ボタンをクリックします。ソフトウェアで削除するディッシュを選択します。
  2. ディッシュを選択したら、[ アンロード準備開始 ]ボタンをクリックします。「 アンロード開始」 ボタンをクリックします。
  3. ディッシュがインキュベーターからシステムのワークベンチに移されたら、 ディッシュ取り外し ボタンを押します。
  4. 前面のスライドウィンドウを手動で開き、皿を取り出します。フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。

3.消耗品の補充:ピペット、チューブ、培地

  1. ピペット、チューブ、培地などの消耗品を補充するには、ソフトウェアのトップ画面で消耗 品 ボタンをクリックし、補充するアイテムを選択します。
    1. ピペット
      1. [ ピペット ]ボタンをクリックします。[ 補充 ] ボタンを選択します。
      2. ユーザーがソフトウェアで補充するラックを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。
      3. 作業台上のピペット保管場所の蓋が開いていることを確認したら、手動で前面のスライドウィンドウを開き、必要に応じてピペットを補充します。
      4. フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。[ 補充完了 ]ボタンをクリックします。
      5. [ 補充設定 ]ボタンをクリックし、補充の情報を入力して、[ 登録 ]ボタンをクリックします。
      6. [ 補充完了 ]ボタンをクリックします。
    2. チューブ
      1. [ チューブ ]ボタンをクリックします。[ 補充 ] ボタンを選択します。
      2. ユーザーがソフトウェアで補充するラックを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。
      3. ラックが上部に移動したことを確認したら、[ 補充チューブ ]ボタンをクリックします。
      4. フロントスライディングウィンドウを手動で開き、必要に応じてチューブを補充します。
      5. フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。
      6. [ 補充完了 ]ボタンをクリックします。
      7. [ 補充設定 ]ボタンをクリックし、補充の情報を入力して、[ 登録 ]ボタンをクリックします。[ 閉じる ] ボタンをクリックします。
    3. 中程度
      1. [ 中] ボタンをクリックします。ソフトウェアの[ 補充 ]ボタンを選択します。
      2. ユーザーが補充する 3 つのラックから 1 つを選択します。[ 補充開始 ]ボタンをクリックします。
      3. 培地保管エリアの蓋が開けられたことを確認したら、前面のスライドウィンドウを手動で開き、培地を補充します。
      4. フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。
      5. [ 補充完了 ]ボタンをクリックします。
      6. [ 補充 ]ボタンをクリックし、培地の名前や量など、培地の情報を入力します。必要に応じて、追加のコメントを入力します。
      7. 「 登録 」ボタンをクリックします。
      8. [ 閉じる ] ボタンをクリックします。

4. タスクの選択

  1. ソフトウェアのトップ画面にある [タスク ]ボタンをクリックします。
  2. [ タスク設定 ]ボタンを選択します。タスクリストから目的のタスクを選択し、「 次のステップ 」ボタンをクリックします。
  3. タスクを実行する日時を指定し、[ 登録 ]ボタンをクリックします。タスクを実行する皿またはプレートを選択し、[ 登録 ]ボタンをクリックします。
  4. 選択したタスクを再確認したら、[ 登録 ]ボタンをクリックします。次の画面でタスクが登録されていることを確認します。
  5. 必要に応じて、次のタスクも同じように設定します。
  6. 最後にある[ スタート ]ボタンをクリックします。その後、タスクは指定された日時に自動的に開始されます。
    注意: すべてのタスクが終了した直後に、UVライト(フードの両側にあります)が自動的にオンになり、5〜30分後に補助設定に従ってオフになり、フードを無菌状態に保ちます。停止するには、ユーザーは [開始 ] ボタンをクリックします。
  7. スケジュールされたタスクを事前にキャンセルする場合は、[ 停止 ] ボタンをクリックします。
  8. 中止するタスクを選択したら、[ タスクの編集 ]ボタンをクリックします。
  9. [ タスクのキャンセル ]ボタンをクリックします。次の画面でタスクが削除されたことを確認します。

5.セルの画像を確認します

  1. すべての作業には、作業の前後に顕微鏡観察(写真を撮る)が含まれます。細胞培養の進行を写真で観察するには、各タスクの前後に顕微鏡撮影のタスクを組み込みます。
  2. ディッシュやウェルプレートの複数の特定の位置を事前に選択して定点観察し、同じ場所を経時的に監視するなど、事前に設定されたタスクプログラムを選択します。

6. 継代と分化

  1. セクション 1 から 5 の手順に従って、継代と分化を実行するように自動細胞培養システムを設定します。継代、心筋細胞分化、肝細胞分化、神経前駆細胞分化、およびケラチノサイト分化の機器設定を、それぞれ 表1、表2、表3、表4、 および表5に示します。

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結果

ヒト人工多能性幹細胞の維持
3系統(理研-2F、253G1、KMUR001)を用いた。日々の手作業による実験でメンテナンスプロトコルを最適化し、さらにシステムによる7回の予備実験で詳細なプログラムを最適化しました。たとえば、人間とシステムが扱う異なるピペットからのスピットフローの液体速度によって引き起こされるせん断応力は大きく異なります。そこで、酵素消化の時間の長さと、システムによる細胞分散のためのピペッティング回数を最適化しました。

ヒト人工多能性幹細胞を、0.5 μg/cm2 細胞培養マトリックスでコーティングした 10 cm のディッシュと iPS細胞培養培地 (Neutristem や StemFit AK02N など) で維持しました。継代については、5 mLのカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS[-])でhiPS細胞を3回洗浄し、次に3 mLのTrypLE Express酵素に10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加して37°Cで15分間処理するようにプログラムしました。 その後、...

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ディスカッション

プロトコルの重要なステップは、ユーザーが障害を見つけた場合、いつでもキャンセル、停止、またはリセットボタンをクリックして、最初のステップからやり直すことです。このソフトウェアは、ダブルブッキング、システムタスクがアクティブなときにドアを開ける、補充の欠如などの人為的ミスを回避できます。目的の体細胞への分化を成功させ、効率的に行うためのもう一つの重要なポイントは、各多能性幹細胞がその分化特性に制御不能なバイアスを持っているため、多能性幹細胞株の適切な選択である14,15。

人工多能性幹細胞の自動培養システムは、多能性幹細胞を維持し、様々な体細胞タイプに分化させることができます。このシステムのサイズは、幅200cm、奥行き110cm、高さ233cmで、総重量は1.2トンです。装置に内蔵されたインキュベーターは、36枚の10cm皿と9枚のマルチウェルプレートを同時に保持することができます。

従来機から改良されたのは、...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、パナソニックプロダクションエンジニアリング株式会社(大阪市)新事業推進センターからの助成金を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.15% ウシ血清アルブミン画分 V富士フイルム和光化学工業株式会社, 宮崎, 日本 9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm プラスチックプレート Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  マウスAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  ウサギDakoA0001
All-trans Retinoic acid富士フイルム 和光化学工業186-01114
全自動培養システムパナソニック
B-27サプリメントサーモフィッシャー・サイエンティフィック17504044
bFGF富士フイルム和光化学工業株式会社 062-06661
BMP4 サーモフィッシャーサイエンティフィックPHC9531
ウシ血清アルブミンメルク810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC、オンタリオ州、カナダ13071-60-8rac-1,2-ジヘキサデシルグリセロール
使い捨て血球計算盤CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco's モディファイドイーグルミディアム/F12 富士フイルム和光ケミカル株式会社
EGF富士フイルム和光化学工業(株) 053-07751
エッセンシャル 8 サーモフィッシャーサイエンティフィックA1517001ヒト多能性幹細胞培地
ウシ胎児血清 Biowest、FL、米国S140T
FGF-basic ナカライテスク株式会社19155-07
ForskolinサーモフィッシャーサイエンティフィックJ63292。
グルタミンサーモフィッシャーサイエンティフィック25030081グルタミンサプリメント
ヤギ IgG(H+L) AlexaFluo546サーモサイエンティフィックA11056
HNF-4A  ヤギサンタクルス6556
ヒドロコルチゾンサーモフィッシャーサイエンティフィックA16292.06
ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸メルクH2882
iMatrix511 シルク ニッピ株式会社892 021細胞培養マトリックス
インスリントランスフェリンセレンサーモフィッシャーサイエンティフィック41400045
ケラチン 1  マウスサンタクルス376224
ケラチン 10 KMUR001; ウサギBioLegend19054
関西医科大学 患者由来iPS細胞 
ノックアウト血清補充サーモフィッシャーサイエンティフィック10828010
L-アスコルビン酸 2-リン酸 A8960、メルクA8960
リーボビッツ's L-15 ミディアム 富士フイルム和光ケミカル株式会社128-06075
マトリゲルコーニング株式会社
マウス IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific Scientific 17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
ニュートリステム・サルトリウスAG、Göttingen, Germany05-100-1A細胞培養培地 
10月3/4  マウスBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
組換えヒトアルブミン A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rhoキナーゼ阻害剤, Y-27632 株式会社セレック〒129830-38-2
理化学研究所 2階RKEN バイオリソース研究センターHPS0014未分化 iPS細胞 
RPMI 1640 サーモフィッシャーサイエンティフィック#1187512633020
SB431542サーモフィッシャーサイエンティフィック301836-41-9
L-アスコルビン酸ナトリウムメルクA4034-100G
SSEA-4  マウスミリポアMAB4304
StemFit AK02N 味の素、東京、日本AK02細胞培養液 
TnT ウサギAbcamab92546
TRA 1-81 マウスミリポアMAB4381
トリヨードチロニンサーモフィッシャーサイエンティフィックH34068.06
TripLETM 発現酵素 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
トリパンブルー溶液 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
リン酸トリプトースブロスメルクT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne、NB、イギリス5148
&ベータ; figure-materials-1 チューブリン マウスPromegaG712A
県12634010MF354277

参考文献

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

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