自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験

Summary

このプロトコルでは、自動化されたプラットフォーム Lustro を利用して、酵母の光遺伝学的システムのハイスループット特性評価を実行する手順を概説します。

Abstract

オプトジェネティクスは、遺伝的にコードされた光感受性タンパク質を利用することで、細胞の挙動を正確に制御します。しかし、これらのシステムを最適化して目的の機能を実現するには、多くの場合、設計、構築、テストのサイクルを複数回必要とし、時間と労力がかかります。この課題に対処するために、光刺激とラボラトリーオートメーションを組み合わせたプラットフォームであるLustroを開発し、オプトジェネティックシステムの効率的なハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にしました。

Lustro は、照明装置、振とう装置、プレートリーダーを備えた自動化ワークステーションを利用しています。Lustroは、ロボットアームを採用することで、これらのデバイス間のマイクロウェルプレートの移動を自動化し、光遺伝学的株の刺激とその応答の測定を可能にします。このプロトコルは出芽のイースト Saccharomycesのcerevisiaeの遺伝子発現制御のための光遺伝学システムを特徴付けるのにLustroの使用のステップバイステップガイドを提供する。このプロトコルは、照明装置とオートメーションワークステーションの統合など、Lustroのコンポーネントのセットアップをカバーしています。また、照明装置、プレートリーダー、ロボットのプログラミングに関する詳細な指示も提供し、実験プロセス全体を通してスムーズな操作とデータ取得を保証します。

Introduction

オプトジェネティクスは、光感受性タンパク質を利用して細胞の挙動を高精度に制御する強力な技術です^1,2,3。しかし、オプトジェネティックコンストラクトのプロトタイピングと最適な照明条件の特定には時間がかかる場合があり、オプトジェネティックシステムの最適化は困難です^4,5。オプトジェネティックシステムの活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するハイスループットメソッドは、コンストラクトのプロトタイピングとその機能の調査のための設計、構築、テストのサイクルを加速させることができます。

Lustro プラットフォームは、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価のために設計されたラボラトリーオートメーション技術として開発されました。マイクロプレートリーダー、照明装置、振とう装置をオートメーションワークステーション⁶と統合しています。Lustro は、マイクロウェルプレート(図1および補足図1)で細胞の自動培養と光刺激を組み合わせており、さまざまなオプトジェネティックシステムの迅速なスクリーニングと比較を可能にします。Lustroプラットフォームは適応性が高く、他のラボラトリーオートメーションロボット、照明装置、プレートリーダー、細胞タイプ、およびさまざまな波長の光に応答するものを含む光遺伝学的システムで動作するように一般化できます。

このプロトコルは、光遺伝学的システムの特性評価のためのLustrroのセットアップと使用を示しています。酵母における分裂転写因子の光遺伝学的制御は、光入力と蛍光レポーター遺伝子mScarlet-I⁷の発現との関係を調べることにより、プラットフォームの機能と有用性を説明するための例として使用されています。このプロトコルに従うことで、研究者は光遺伝学的システムの最適化を合理化し、生物学的システムの動的制御のための新しい戦略の発見を加速することができます。

Protocol

この研究で利用した酵母菌株は、 材料表に記載されています。これらの菌株は、22°C〜30°Cの温度範囲で強力な増殖を示し、さまざまな標準酵母培地で培養できます。

1. 自動化ワークステーションのセットアップ

1. マイクロウェルプレートを移動できるロボットグリッパーアーム(RGA、 材料表を参照)を自動ワークステーションに装備します(図1)。
2. マイクロプレートヒーターシェーカー(材料表を参照)を自動ワークステーション(図1(1))に設置し、RGAアクセスを提供する自動プレートロック機構を備えています。
3. マイクロプレートリーダーを自動ワークステーションに隣接して配置し(図1(2))、RGAへのアクセスを確保します。
4. RGAへのアクセスに便利なマイクロプレート照明装置(図1(3))を組み込みます。例としては、optoPlate⁸ (この研究で使用)やLITOS⁹ ( 材料表を参照)などがあります。

2.照明装置の準備

1. 確立された方法^8、10、11に従って、optoPlate(または代替照明装置)を構築および校正します。
2. 照明装置のアダプターを利用して、RGAアクセスを有効にします。
3. スプレッドシート入力¹⁰ またはグラフィカルインターフェース¹² を使用して optoPlate をプログラムします。ステップ3に従って、光刺激プログラムを実行します。

3. 光刺激プログラムの設計

1. 実験に必要な光条件を決定します。
2. 光強度、光開始時間、パルス長、パルス数、パルス間持続時間など、希望する光条件をスプレッドシートに入力します。
   注:GitHubリポジトリ github.com/mccleanlab/Optoplate-96 に記載されている手順に従って、この情報をoptoPlateにフラッシュします。サンプルプレートは、マイクロプレートリーダーまたはヒーターシェーカーで照らされないことに注意してください。これらのイベントの期間と頻度は、特定の実験要件に基づいて最適化する必要がある場合があります。
3. 適切なバックグラウンド測定を可能にするために、各菌株に暗い条件を含めます。
4. 形質転換機能を評価するための最初の特性評価実験では、高い光強度を使用します。
   注:過度の光は酵母¹³に光毒性を与える可能性があるため、光強度はより感度の高い実験用に最適化する必要があります。

4. マイクロプレートリーダーの準備

1. 実験を行う前に、目的の目的量を測定するようにマイクロプレートリーダーを設定します。
   注:この例では、マイクロプレートリーダーは、目的の菌株で発現したレポーターからの蛍光を測定するように構成されています。ルミネッセンスや光学濃度などの他の出力は、実験の要件に応じて使用できます。
2. 合成完全(SC)培地¹⁴ (または別の低蛍光培地)( 材料表を参照)で、測定する細胞密度が最も高いまで、目的の菌株を(非蛍光コントロールとともに)培養します。培養物をガラス底の黒壁マイクロウェルプレート( 材料表を参照)に移し、測定して最適なマイクロプレートリーダー設定を決定します。
   注意: プレートの寸法を正しく入力し、プレートを下から測定することにより、正確な読み取り値を確保します。
3. 蛍光タンパク質データベース(例えば、fpbase.org)を参照して、標的蛍光タンパク質¹⁵のおおよその吸収および発光スペクトルを得る。
4. 蛍光株と非蛍光株を含むウェルでZスキャンを実行して、Z値(プレートとリーダーの間の距離)を決定します。S/N 比が最大になる Z 値を選択します。
5. 蛍光株と非蛍光株の吸収および発光スキャンを実施して、吸収スペクトルと発光スペクトルを最適化し、最適なS/N比を決定します。
6. ゲインを最適なレベルに設定して蛍光ひずみを測定し、オーバーフロー測定誤差を生じさせることなく使用できる最高の光学ゲインを決定します。
   注:この光学ゲインは、結果の一貫性を確保するために、同じひずみを含む実験間で一貫して手動で設定する必要があります。
7. マイクロプレートリーダーソフトウェアで測定スクリプト( 図2を参照)を準備します。このスクリプトは、培養物の光学密度と、測定する蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを測定するように装置を設定します。
   注:赤色蛍光タンパク質を発現していない株の光学濃度を600 nmで測定します。赤色蛍光タンパク質を発現する株については、バイアス¹⁶を避けるために700 nmで光学濃度を測定します。
8. 測定中は、内部インキュベーション温度を30°Cに維持するように測定スクリプトを設定します。
9. 必要に応じて、データをスプレッドシートまたはASCIIファイルにエクスポートするように測定スクリプトを設定します。

5. ロボットのプログラミング

1. キャリア(ヒーターシェーカー、ネストプラットフォーム、照明装置など)と実験器具(96ウェルプレートなど)の物理的なレイアウトに基づいて、自動ワークステーションソフトウェアで作業台定義を設定します( 材料表を参照)。以下の手順に従って、オートメーションワークステーションソフトウェアで光誘導と測定を実行するスクリプトを作成します(図3)。
2. 光遺伝学的システムのバックグラウンド活性化を防ぐために、内部照明光源を無効にします。
3. ヒーターシェーカーの温度を30°Cに維持するように設定します。 プレートがヒーターシェーカー上にないときは、周囲温度(22°C)になります。
4. ループ、タイマー、およびループカウント変数を利用して、一定の間隔で細胞を誘導および測定するステップを繰り返します。
5. 測定値を記録する前に、サンプルプレートを振って、すべての細胞が適切に懸濁するようにしてください。通常、2 mmの眼窩で1,000 rpmで60秒振とうするだけで、S288C S. cerevisiae 細胞を再懸濁し、測定バイアスを回避することができます。
6. ロボットアームを使用してサンプルプレートをマイクロプレートリーダーに移動し、蓋を取り外して(該当する場合)、光学濃度測定の偏りを防ぎます。マイクロプレートリーダーのキャリア定義が蓋を許可しないように設定されている場合、制御ソフトウェアは蓋を自動的に取り外して指定された位置に交換します。
7. ステップ4の説明に従って、マイクロプレートリーダー測定スクリプトを実行します。
8. サンプルプレートの蓋を元に戻し、ロボットアームを使用してプレートを照明装置に移動します。
9. タイマーが指定された時間間隔(例:30分にループカウント変数を掛けたもの)に達するまで待機し、必要な反復回数(例:24時間の実験で48回)ループ全体を繰り返すようにスクリプトを設定します。
10. 潜在的なエラーをトラブルシューティングし、キャリアと実験器具の定義が適切に機能していること、およびスクリプトループに空のプレートを複数回通すことでプレートを正確にピックアップして配置するRGAの能力を確認します。
11. プロトコルの実行中に発生する可能性のある機器の状態の変化やエラーをユーザーに通知するようにユーザーアラートを設定します。

6. サンプルプレートのセットアップ

1. YPD 寒天¹⁷ などのリッチ培地プレートで酵母株を増殖させます ( 材料表を参照)。非蛍光(ネガティブ)コントロールを含めます。
2. プレートからコロニーを選択し、ガラス培養チューブ内の3 mLのSC培地¹⁴ (またはLFM¹⁸などの別の低蛍光培地)に接種します。培養物をローラードラム上で30°Cで一晩インキュベートし、暗所または非反応性光条件下(青色光応答性システムの場合は赤色光など)で保管します。
3. 各培養物200 μLを1 mLのSC培地に希釈し、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを使用して600 nm(OD600)での光学濃度を記録することにより、一晩培養の光学濃度を測定します。
4. ガラス培養チューブで各一晩培養液をOD₆₀₀ 0.1 に希釈します。ハイスループットのひずみ試験には、マイクロウェルプレートで自動希釈を実施します。
5. 希釈した培養液を96ウェルプレートにピペットで移します。技術的なばらつきを考慮して、各条件に3つのウェル(つまり、同じひずみと光の条件を持つ3つの同一のウェル)を含めます。バックグラウンド蛍光と光学密度を測定するためのネガティブコントロールとして、ブランク培地と非蛍光細胞を含むウェルを含めます。
6. プレートを30°Cで5時間振とうしながらインキュベートしてから、光誘導実験を開始します。必要に応じて希釈量とインキュベーション時間を調整し、特定の菌株や実験条件に合わせて最適化します。

7. 実験の実施

1. サンプルプレートをヒーターシェーカーに置き、ステップ5で概説したように自動化スクリプトを開始します。
2. プレートリーダーでの初期測定が記録されたら、ステップ3で説明したように光刺激プログラムを開始します。
3. オートメーションワークステーションが暗い部屋にない場合は、遮光カーテンで覆い、背景の照明を避けます。

8. データ分析

1. 96ウェルプレートの8 x 12レイアウトを反映した実験用のスプレッドシートマップを作成します。マップに、1つのグリッドで測定されるひずみの名前と、別のグリッドで使用される照明条件の説明が含まれていることを確認します。
2. Python スクリプトまたは別の優先プログラミング言語を使用して、エクスポートされたデータを分析します。マップスプレッドシートを配列にインポートし、ひずみ名と条件名をプレートの各ウェルに関連付けます。
   注:分析用のサンプルコードは、https://github.com/mccleanlab/Lustro にあります。或いは、種々のプレートリーダ¹⁹からのデータを解析するアプリケーションを採用することもできる。
3. エクスポートした実験スプレッドシートから別の配列にデータを読み取ります。
4. 図 4 に示すように、各ひずみと条件の光学濃度値と蛍光値を経時的にプロットします。
5. 光学濃度プロットを調べて、培養物の指数関数的な成長または飽和の段階を判断します。この情報は、 図 5 に示すように、菌株間または条件間で蛍光測定値を比較するための適切な時点を選択するのに役立ちます。

Results

図4A は、光誘導性スプリット転写因子によって制御される蛍光レポーターを発現するオプトジェネティック株の経時的な蛍光値を示しています。実験で使用されたさまざまな光条件は、光が点灯している時間の割合を表すデューティサイクルの変動によって反映されます。全体的な蛍光レベルは、光刺激のデューティサイクルに比例することが観察されます。 図4B は、同じ実験に対応するOD₇₀₀ の値を示しています。異なる光条件における光学濃度測定値の一貫性は、実験手法がさまざまな光条件下での菌株の成長速度に有意な影響を与えないことを示唆しています。

蛍光と光学濃度を経時的に測定することで、光遺伝学的システムがさまざまな光刺激プログラムにどのように反応するかをより深く理解することができます。この時系列データは、特定の時点を選択して、さまざまな菌株や条件を比較するのに役立ちます。 図5 は、異なる光刺激プログラムに...

Discussion

ここで紹介するLustroプロトコルは、培養、照明、測定プロセスを自動化し、光遺伝^{学的システムのハイ}スループットスクリーニングと特性評価を可能にします6。これは、照明装置、マイクロプレートリーダー、振とう装置をオートメーションワークステーションに統合することで実現されます。このプロトコルは、酵母 S.cerevisiae に統合されたさまざまな光遺伝学的構造をスクリーニングし、光誘導プログラムを比較するためのLustroの有用性を具体的に示しています。

このプロトコルで強調されているいくつかの重要なステップは、Lustroを効果的に利用するために不可欠です。研究中の光遺伝学的構築物の動態に合致するカスタマイズされた光プログラムの慎重な設計が必要である。さらに、信頼性の高い測定を得るためには、プレートリーダーの正確な校正が重要です。スクリプトを円滑に実行するためには、照明プログラムとの適切な同期を確保するために必要な調整を含め、ロボットでの実験の徹底的な予行演習が重要です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェルガラス底板  #1.5カバーガラス	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (ヒーターシェーカー)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 マット&アルファ; ura3&デルタ;0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD 寒天	SigmaAldrich	Y1500