Method Article

自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、自動化されたプラットフォーム Lustro を利用して、酵母の光遺伝学的システムのハイスループット特性評価を実行する手順を概説します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

オプトジェネティクスは、遺伝的にコードされた光感受性タンパク質を利用することで、細胞の挙動を正確に制御します。しかし、これらのシステムを最適化して目的の機能を実現するには、多くの場合、設計、構築、テストのサイクルを複数回必要とし、時間と労力がかかります。この課題に対処するために、光刺激とラボラトリーオートメーションを組み合わせたプラットフォームであるLustroを開発し、オプトジェネティックシステムの効率的なハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にしました。

Lustro は、照明装置、振とう装置、プレートリーダーを備えた自動化ワークステーションを利用しています。Lustroは、ロボットアームを採用することで、これらのデバイス間のマイクロウェルプレートの移動を自動化し、光遺伝学的株の刺激とその応答の測定を可能にします。このプロトコルは出芽のイースト Saccharomycesのcerevisiaeの遺伝子発現制御のための光遺伝学システムを特徴付けるのにLustroの使用のステップバイステップガイドを提供する。このプロトコルは、照明装置とオートメーションワークステーションの統合など、Lustroのコンポーネントのセットアップをカバーしています。また、照明装置、プレートリーダー、ロボットのプログラミングに関する詳細な指示も提供し、実験プロセス全体を通してスムーズな操作とデータ取得を保証します。

Introduction

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オプトジェネティクスは、光感受性タンパク質を利用して細胞の挙動を高精度に制御する強力な技術です1,2,3。しかし、オプトジェネティックコンストラクトのプロトタイピングと最適な照明条件の特定には時間がかかる場合があり、オプトジェネティックシステムの最適化は困難です4,5。オプトジェネティックシステムの活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するハイスループットメソッドは、コンストラクトのプロトタイピングとその機能の調査のための設計、構築、テストのサイクルを加速させることができます。

Lustro プラットフォームは、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価のために設計されたラボラトリーオートメーション技術として開発されました。マイクロプレートリーダー、照明装置、振とう装置をオートメーションワークステーション6と統合しています。Lustro は、マイクロウェルプレート(図1および補足図1)で細胞の自動培養と光刺激を組み合わ....

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Protocol

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この研究で利用した酵母菌株は、 材料表に記載されています。これらの菌株は、22°C〜30°Cの温度範囲で強力な増殖を示し、さまざまな標準酵母培地で培養できます。

1. 自動化ワークステーションのセットアップ

  1. マイクロウェルプレートを移動できるロボットグリッパーアーム(RGA、 材料表を参照)を自動ワークステーションに装備します(図1)。
  2. マイクロプレートヒーターシェーカー(材料表を参照)を自動ワークステーション(図1(1))に設置し、RGAアクセスを提供する自動プレートロック機構を備えています。
  3. マイクロプレートリーダーを自動ワークステーションに隣接して配置し(図1(2))、RGAへのアクセスを確保します。
  4. RGAへのアクセスに便利なマイクロプレート照明装置(図1(3))を組み込みます。例としては、optoPlate

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Results

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図4A は、光誘導性スプリット転写因子によって制御される蛍光レポーターを発現するオプトジェネティック株の経時的な蛍光値を示しています。実験で使用されたさまざまな光条件は、光が点灯している時間の割合を表すデューティサイクルの変動によって反映されます。全体的な蛍光レベルは、光刺激のデューティサイクルに比例することが観察されます。 図4B は、同じ実験に対応するOD700 の値を示しています。異なる光条件における光学濃度測定値の一貫性は、実験手法がさまざまな光条件下での菌株の成長速度に有意な影響を与えないことを示唆しています。

蛍光と光学濃度を経時的に測定することで、光遺伝学的システムがさまざまな光刺激プログラムにどのように反応するかをより深く理解することができます。この時系列データは、特定の時点を選択して、さまざまな菌株や条件を比較するのに役立ちます。 図5 は、異なる光刺激プログラムに.......

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Discussion

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ここで紹介するLustroプロトコルは、培養、照明、測定プロセスを自動化し、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にします6。これは、照明装置、マイクロプレートリーダー、振とう装置をオートメーションワークステーションに統合することで実現されます。このプロトコルは、酵母 S.cerevisiae に統合されたさまざまな光遺伝学的構造をスクリーニングし、光誘導プログラムを比較するためのLustroの有用性を具体的に示しています。

このプロトコルで強調されているいくつかの重要なステップは、Lustroを効果的に利用するために不可欠です。研究中の光遺伝学的構築物の動態に合致するカスタマイズされた光プログラムの慎重な設計が必要である。さらに、信頼性の高い測定を得るためには、プレートリーダーの正確な校正が重要です。スクリプトを円滑に実行するためには、照明プログラムとの適切な同期を確保するために必要な調整を含め、ロボットでの実験の徹底的な予行演習が重要です。

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Disclosures

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著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R35GM128873と米国国立科学財団の助成金2045493(M.N.M.に授与)の支援を受けました。Megan Nicole McClean博士は、バロウズ・ウェルカム基金のサイエンティフィック・インターフェースでキャリア賞を受賞しています。Z.P.H.は、ゲノム科学トレーニングプログラム5T32HG002760へのNHGRIトレーニング助成金の支援を受けました。McClean研究室のメンバーとの実りある議論を認めており、特に、原稿にコメントを寄せてくださったKieran Sweeney氏に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96ウェルガラス底板  #1.5カバーガラスCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (ヒーターシェーカー)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (alternative illumination device)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)2019
Robotic Gripper ArmTecan
Spark (plate reader)Tecan
Synthetic Complete mediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (user alert app)Tecan
yMM1734 (BY4741 マット&アルファ; ura3&デルタ;0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 相同性, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 相同性 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD 寒天SigmaAldrichY1500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....

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