新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

サマリー

ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。

要約

蝸牛有毛細胞は、聴覚系の感覚受容器です。これらの細胞は、内耳の骨迷路内の聴覚を司る感覚器官であるコルチの器官にあります。蝸牛有毛細胞は、解剖学的にも機能的にも異なる2つのタイプ、すなわち外有毛細胞と内有毛細胞で構成されています。どちらかが損傷すると、難聴になります。特に、内有毛細胞は再生できず、損傷は永久的です。したがって、初代有毛細胞の in vitro 培養は、蝸牛有毛細胞の保護効果または再生効果を調べるために不可欠です。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。

蝸牛側壁を手作業で除去した後、顕微鏡下で蝸牛モディオルスから聴覚上皮を細心の注意を払って解剖し、0.25%トリプシン-EDTAからなる混合物中で37°Cで10分間インキュベートし、200μLのピペットチップを使用して培地に静かに懸濁した。細胞懸濁液を細胞フィルターに通し、濾液を遠心分離し、細胞を24ウェルプレートで培養した。有毛細胞は、運動緊張に関与するメカノトランスダクション複合体であるミオシン-VIIaを発現する能力と、ファロイジンを用いたF-アクチンの選択的標識に基づいて同定されました。細胞は、培養で4d後に>90%のコンフルエントに達しました。この方法は、in vitro培養有毛細胞の生物学的特性の理解を深め、蝸牛有毛細胞培養の効率を実証し、さらなる聴覚研究のための確固たる方法論的基盤を確立することができます。

概要

蝸牛有毛細胞は、音の検出と聴覚神経への信号伝達に重要な役割を果たします。有毛細胞は、脊椎動物の一次感覚受容器として機能し、音の振動を電気信号に変換する機構的な細胞です。哺乳類の内耳の感覚上皮は、1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞で構成されています。有毛細胞は、さまざまな基本膜領域で、異なる周波数(20〜2,000Hz^)の音を知覚します1。外有毛細胞の機能は、哺乳類の内耳を微調整するのに役立つ活発な機械的増幅プロセスであり、音に対する高い感度を与えます。内有毛細胞は音を検出する役割を担っています。段階的な脱分極の後、音響情報は聴覚神経線維²を介して脳に伝達される。

難聴は、遺伝的欠陥、加齢、騒音トラウマ、または耳毒性薬の過剰使用によって引き起こされる可能性があり、これらは世界中で主要な健康上の懸念を構成しています^3,4。難聴は、主に有毛細胞への不可逆的な損傷に起因します⁵.騒音性難聴に関しては、研究者はその病因のいくつかの詳細についてコンセンサスに達していますが、多くの根本的なメカニズムの包括的な理解が欠けています。外側の有毛細胞は、音響の^{過露出に対して}特に脆弱です6。機械感受性蝸牛有毛細胞は加齢性難聴に関与しています。しかし、有毛細胞の変性の根底にある分子的および細胞的メカニズムは不明のままです。分子プロセスにおけるいくつかの変化は、有毛細胞の老化、酸化ストレス、DNA損傷応答、オートファジー、および有毛細胞の特殊化に関連する遺伝子の発現と転写の調節不全につながります⁷。

内耳は側頭骨に包まれているため、体の最も硬い骨の奥深くにあるため、実験的にはアクセスできず、有毛細胞の修復と再生のメカニズムの研究に課題を投げかけています。したがって、有毛細胞の機能を調べるためのin vitro培養を確立することは、内耳の再生と損傷のメカニズムを研究するための理想的な方法となっています。蝸牛器官型培養を調製する手順は、以前の研究で説明されています^8,9,10。世界中の研究者は、さまざまな蝸牛の顕微解剖および表面調製技術を採用しています。根強い課題にもかかわらず、さまざまな初代有毛細胞培養システムがin vitroで成功裏に確立されています。蝸牛器官の培養には、有毛細胞、ダイター細胞、ヘンセン細胞、柱細胞、聴覚神経線維など、さまざまな種類の細胞が含まれています。受傷後の有毛細胞の変化を細胞レベルや分子レベルで深く理解することで、より強力な研究ツールの開発が可能になります。この研究は、新生児マウスから蝸牛器官を分離し、豊富な有毛細胞を酵素的に剥離してin vitro研究を行う手順を実証することを目的としていました。培養細胞の性質は、免疫蛍光染色を用いて確認した。

プロトコル

すべての動物実験は、西安交通大学動物の使用と管理に関する委員会によって承認されました(No.2021-847)。

1.滅菌と材料の準備

1. 解剖器具を高温高圧蒸気消毒で滅菌し、50°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン10 mg/mLを含む培地100 mLを事前に調製し(10 mLのFBSと10 μLのペニシリン原液をダルベッコ修正イーグル培地(EMEM)90 mLに加える)し、4°Cで保存します。

2.聴覚上皮採取のための側頭骨の解剖と除去

1. 合計10匹の新生児マウス(P3からP5)を氷上で首を切って安楽死させる。必要に応じて、倫理的に承認された別の方法論を使用します。
2. 図1Aに示すように、頭を所定の位置に保持し、マイクロ操作ハサミを使用して矢状縫合糸に沿って頭皮を開き、指で頭皮を両側に分離して固定します。
3. 小さな骨膜エレベーターを使用して脳を取り除き、基底頭蓋骨を二等分します。はさみで頭蓋骨を切り、前方にひっくり返して頭蓋骨を開きます。ハサミの先で脳を削り、頭蓋骨の付け根を露出させます。
4. 頭蓋骨の基部にある両側側頭骨を観察します(図1C)。ハサミを使用して頭蓋骨の基部を正中線に沿って切り、皮膚をこすり落とし、不要な骨を取り除きます(図1D、D')。
5. 側頭骨を保持し、新鮮なハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む35mmの滅菌ペトリ皿に移します(図1E)。
6. 2つの#5尖った鉗子を使用して、側頭骨の錐体部分から水疱と周囲の組織を取り除きます(図1E)。
   注:この段階では、マウスの側頭骨の骨迷路は完全に石灰化しておらず、鉗子を使用して簡単に解剖できます。
7. 片手で鉗子を持って側頭骨の半円形部分を固定し、もう一方の手で鉗子の下部を丸い窓のニッチに突き刺して、蝸牛の外側骨をスカラ前庭から分離します。OC上皮に触れずに側頭骨の錐体部分を慎重に取り除きます。続いて、蝸牛の骨迷路を基底端から頂端まで慎重に分離して除去します(図1F)。
8. #5尖った鉗子を使用して、コルチ感覚上皮の器官をモディオルスから慎重にマイクロ分離します(図1G)。
9. らせん靭帯を保持し、微小手術鉗子で脈理血管から慎重に分離し、200 μLのピペットを使用して、清潔な聴覚上皮をHBSSを含む3 mmの滅菌培養皿に移します(図1H)。
10. 各動物から20個の検体を採取し、次の調製ステップのためにHBSSを含む100 mm滅菌シャーレにすばやく移します(図1)。

3. 聴覚有毛細胞を得るための酵素解離

1. 0.25%トリプシンを含む10 mLの新鮮DMEMに聴覚上皮を移し、37°Cで12分間インキュベートします。
2. 200 μLのピペットチップを使用して、手術顕微鏡下で有毛細胞を基底層および他の細胞から静かに分離します。
3. さらに10 mLの培地を加えて、凝集を阻害します。
4. 培地中の懸濁細胞を70μmフィルターでろ過し、濾液を清潔な50mLチューブに回収し、300× g で5分間遠心分離します。
5. 有毛細胞を少なくとも5 mLの培養培地に再懸濁し、1,000 μLのピペットチップを使用してゆっくりと上下にピペッティングします。気泡の発生は避けてください。
6. あらかじめ6ウェルプレートの底にカバーガラスを置きます。細胞をカウントし、6ウェルプレートで10⁶ 細胞/mLの密度で培養します。
7. 接着細胞を2 mLのDMEM(FBS10%、ペニシリン100ユニット/mL、ストレプトマイシン100 μg/mLを含む)で37°Cおよび5%_CO2で増殖させます。培地は毎日交換してください。
   注:このプロトコルを使用しても、純粋な有毛細胞は得られないことに注意してください。この初代細胞培養法に基づくと、有毛細胞が培養細胞の約70%を占め、良好な状態にある可能性があるため、さらなる研究にはd2またはd3細胞を使用することをお勧めします。

4. 免疫蛍光染色

1. 培養細胞をd1からd6まで(1日1ウェル)収穫します。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回すすぎます。
2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。
3. 固定液を取り除き、PBSで3 x 3分間細胞をすすぎます。
4. 0.2% Triton X-100 を含む PBS で細胞を室温で 10 分間透過処理します。
5. 透過処理した細胞を、PBS中の10%FBSからなるブロッキング溶液と室温で20分間インキュベートします。
6. 抗ミオシンモノクローナル抗体(PBSで1:200に希釈)で4°Cで一晩細胞を染色します。
7. 細胞を滅菌PBSで3回洗浄し、二次抗体(Alexa Fluor 594ヤギ抗ウサギMYO7A、PBSで1:500希釈)およびフルオレセイン標識ファロイジン(Alexa Fluor 488、細胞構造を同定)とともに室温で2時間インキュベートします。
8. 細胞をPBSで3回すすぎ、二次抗体を除去します。
9. DAPIを含む封入剤を1〜2滴スライドに加え、カバーガラスをマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡の下に置いて細胞の写真を撮ります。

5. 統計解析

1. 二元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの事後検定を実行して、ミオシン-VIIaとファロイジンの灰色値の経時的な変化を分析します。文字マーキング方法を使用して、統計的な差異をマークします。
2. 追加の一元配置分散分析を実行し、続いてテューキーの事後検定を実行して、1日目から6日目までの細胞サンプル間のファロイジン陽性細胞比と、同じ日のミオシン-VII陽性細胞比を比較します。

結果

このプロトコルに続いて、単離された細胞に播種しました。初代蝸牛有毛細胞の種子は、細胞が培地中に浮遊せず、24時間以内に拡散した場合に成功したと見なされました。有毛細胞が付着し、皿の底で平らな凝集体に広がった後の有毛細胞の数を決定しました。1日後、生きた有毛細胞を培養皿の底にしっかりと接着させ、PBSでリンスすることにより非接着細胞を除去した。通常、細胞数は3d培養後に2倍になります(図2)。

免疫蛍光法(IF)により、ミオシン-VIIaおよびファロイジンの発現がd6まで明らかになりました(図3A)。その結果、ミオシン-VIIaのグレー値と陽性細胞比は時間とともに減少するのに対し、ファロイジンのグレー値と陽性細胞比は培養後のd1のものと比較して変わらないことが観察されました(図3B-D)。有機培養をポジティブコントロールとして使用し、ミオシ...

ディスカッション

HEI-OC1細胞株と比較して、有毛細胞の初代培養は、in vivoでの細胞の生理学的状態をより正確に再現しました。したがって、蝸牛器官から生細胞を単離し、直ちに培養する聴覚初代培養法は、聴覚系を広く研究する上で貴重なツールとなると考えられます。成功する文化には、特定のテクニックが不可欠です。第一に、側頭骨からコルチの器官が分離する期間を最小限に抑えることで、有毛細胞の活動が持続する可能性が高まります。したがって、研究者は臓器の解剖とPBSへの浸漬の間の時間間隔を最小限に抑えることが不可欠です。私たちの実験的観察に基づくと、約2〜3時間の持続時間は、10匹のマウスを解剖し、一度に20個の内耳を得るのに十分です。酵素解離プロセス中は、持続時間を12分に制限し、8分のインキュベーション期間後に蝸牛器官をピペットに移すことをお勧めします。約10回のピペッティングサイクル後に臓器を顕微鏡で観察し、ほぼすべての細胞が基底膜から剥離した時点で酵素的解離を停止しました。そうでなければ、臓器はさらに4分間インキュベーターに戻された。抗生物質の選択も重要です。一部のアミノグリコシド系抗生物質は耳毒性があり、有毛細胞死につながる可能性があるため、潜在的な汚...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mm BioLite細胞培養ディッシュ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	130182	に使用
35 mm Nunc細胞培養ディッシュ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150318	に使用
6ウェル口蓋	サーモフィッシャーサイエンティフィック	310109005	使用
70 µフィルターに使用したm細胞ス	トレーナーBD会社	352350
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	蛍光染色
抗ウサギIgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	蛍光染色
3-5日目新生児マウス			提供:西安交通大学
ダルベッコs モディファイドイーグル ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965092	培養
胎児ウシ血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	培養に使用する12483020
鉗子	デュモン	5#	解剖に使用する
ライカ解剖顕微鏡	ドイツ	S9i	剖に使用する
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15140-122
培養用ウサギ プライクローナル Myosin VIIa	Abcam 社	ab92996	免疫蛍光
ザー	Belevor	10cm/04.0524.10	解剖用
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	トリ
プシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200072	の培養用

培養培養培養に免疫免疫に使用する 解ック染色 シ免疫蛍光染色