このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。
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方法論記事
人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腎臓オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からさまざまなアプローチで作製することができます。これらのオルガノイドは、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および潜在的な治療用途に大きな期待が寄せられています。本稿では、iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製する手順を、後原始線条(PS)から中間中胚葉(IM)まで順を追って説明します。このアプローチは、動物成分を含まない定義された培地であるAPEL 2培地に依存しています。高濃度のWNTアゴニスト(CHIR99021)を4日間補給し、続いて線維芽細胞成長因子9(FGF9)/ヘパリンと低濃度のCHIR99021をさらに3日間補給します。このプロセスでは、iPS細胞の開始時に最適な細胞密度とCHIR99021濃度を選択することに重点が置かれます。このプロトコルの重要な面は、IMが徐々にネフロン構造に発展し、糸球体、近位管状、および遠位管状構造を網羅し、すべて視覚的に理解可能な形式で提示されるようにする、低接着プレートでの懸濁培養です。全体として、この詳細なプロトコールは、多様なiPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための効率的で特異的な技術を提供し、成功し、一貫した結果を保証します。
概要
腎臓は、その機能単位に応じて、生理学的恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。老廃物を排泄するネフロンは、体液の組成を調節することができます。遺伝性突然変異などの高リスク因子によって引き起こされる慢性腎臓病(CKD)は、最終的には末期腎臓病(ESKD)に進行します1,2。ESKDは、ネフロンの再生能力が限られていることが原因と思われます。したがって、腎代替療法が必要です。ヒトiPS細胞の分化を指示することで、患者特異的な3D腎臓オルガノイドをin vitroで作製することができ、腎臓の発生の研究、患者固有の疾患のモデル化、腎毒性薬物スクリーニングの実施に使用できます3,4。
胚発生中、腎臓は中間中胚葉(IM)に由来し、原始線条(PS)と区別されます。古典的なWNTシグナル伝達経路は、FGF(FGF9、FGF20)とBMP(JNKを介したBmp7シグナル伝達)の協調的な関与により、IMのさらなる分化を誘導する可能性があります5,6,7。それ....
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プロトコル
本研究に用いたiPS細胞は、市販のものを入手したものである。細胞は、市販の基底膜マトリックスコーティングプレート上でmTeSR培地で維持しました( 材料表を参照)。 表1 には、研究で利用されたすべての培地組成が含まれています。
1. iPS細胞の分化と後原始線条(PS)誘導のためのプレーティング
- メンブレンマトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上のiPS細胞を2 mLのDPBSで洗浄します。ピペットを使用してDPBSを吸引します。
- 市販の細胞剥離液( 材料表参照)を1 mL添加してiPS細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートします。
- iPS細胞にmTeSRを1 mL添加し、細胞がプラスチック表面から浮き上がっていることを確認します。
- 細胞を室温(RT)で400 x g で3分間遠心分離します。細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
- メンブレンマトリックスでコーティングした24ウェルまたは6ウェルプレートにさまざまな細胞密度を播種し、10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSRで培養します( 材料表を参照)。37°Cの
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結果
IMの産生は、GSK3阻害剤CHIR99021を用いて標準的なWNTシグナル伝達を活性化し、続いてFGF9/ヘパリンを活性化することによって達成されます。0日目から4日目にかけて、iPS細胞は急速に拡大し、菱形や三角形の形をします。合流点は90%〜100%に達し、7日目まで均等に蓄積します。浮遊培養では、凝集体は7日目に解離した後、自発的にネフロン構造を形成します。浮遊培養で作製された腎臓オルガノイドは管状の構造を示し、凝集から18日後に明視野画像で容易に観察できます(図2 および 図3)。
典型的には、iPS細胞の24ウェルプレートのウェルから開始した1回のアッセイで、200〜300個のオルガノイドが得られます。このうち、80%〜90%がネフロン様構造を含んでいます(図2)。iPS細胞-B1 iPS細胞株の場合、腎臓オルガノイドの作製に最適な条件は、8 μMのCHIR99021で24ウェルプレートのウェ.......
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ディスカッション
iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルが記載されており、基礎培地、初期細胞密度、およびCHIR99021濃度にわずかな変更を加えます。さまざまな実験において、腎臓オルガノイドの作製を成功させるための重要な要素は、中間中胚葉(IM)の初期分化と7日目の細胞状態であることがわかりました。さらに、iPS細胞株が異なれば、細胞増殖能や分化能にもばらつきがあり、その結果、最適な細胞密度やCHIR99021濃度にばらつきが見られました5,13,14。したがって、患者特異的なiPS細胞からかなりの数の腎臓オルガノイドを作製するためには、各iPS細胞株の理想的な状態を決定することが不可欠です。
最適な条件を特定するには、24ウェルプレートを使用して予備実験を行い、その後、培養を6ウェルプレートにスケールアップして大規模生産を行うことをお勧めします。このステップにより、研究者は細胞の形態と量.......
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開示事項
著者らは、利益相反の可能性はないと報告した。
謝辞
過去と現在のMaoとHu Labのメンバーの皆さんには、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献をしていただき、心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 to Lidan Hu)、江蘇省自然科学基金会(助成金番号。BK20210150 Gang Wang)に。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェル細胞培養プレート、平底 | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| 抗体 | |||
| ベンジルアルコール | Sigma-Aldrich | 猫 #100-51-6 | |
| 安息香酸ベンジル | Sigma-Aldrich | 猫 #120-51-4 | |
| 生物学的安全キャビネット | ハイアール | キャット #HR40  A2 | |
| ビオチン抗ヒトLTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| 血液単核球 hiPS-B1 (iPSc, 女性) | 該当なし | ||
| 濃度シェーカー | ハマニー | Cat #C0-06UC6 | |
| 化学物質、ペプチド、および組換えタンパク質 | |||
| CHIR99021 (Wnt経路活性化剤) | STEMCELLTechnologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | ThermoSCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPESフリー | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | アブカム | キャット #ab150179 | |
| ロバ セラム ストステ | メイルンバイオ | キャット #MB4516-1 | |
| D-PBS (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし) | ソーラーバイオ ライフサイエンス | キャット #D1040 | |
| ドライバス インキュベーター | 上海 景新 | キャット #JX-10 | |
| ダイライト 488-ヤギ 抗マウス IgG (1:400) | アーソックス | キャット #E032210 | |
| ダイライト488-ヤギ抗ウサギIgG(1:400) | アーソックス | キャット #E032220 | |
| ダイライト549-ヤギ抗マウスIgG(1:400) | アーソックス | キャット #E032310 | |
| ダイライト549-ヤギ抗ウサギIgG(1:400) | アーソックス | キャット #E032320 | |
| ダイライト649-ヤギ抗ウサギIgG(1:400) | アーソックス | キャット #E032620 | |
| 実験モデル:細胞株 | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 インキュベーター | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (細胞培養サプリメント) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| 倒立顕微鏡 | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| レーザー走査型共焦点顕微鏡 | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| メチルセルロー | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (ポリビニルアルコール 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-human PDGFR (1:300) | アブカム | Cat #ab32570 | |
| 組換えヒト血清アルブミン (rHSA) | イイーセン | ネコ #20901ES03 | |
| ヒツジ抗ヒトNPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (二塩酸塩) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
参考文献
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
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再版と許可
