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方法論記事

人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成

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DOI：

10.3791/65698

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2023年9月1日

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1Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Zhejiang University School of Medicine, 3Hubei Normal University, 4National Clinical Research Center of Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing University School of Medicine, 5Clinical Laboratory, The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。

要約

腎臓オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からさまざまなアプローチで作製することができます。これらのオルガノイドは、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および潜在的な治療用途に大きな期待が寄せられています。本稿では、iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製する手順を、後原始線条(PS)から中間中胚葉(IM)まで順を追って説明します。このアプローチは、動物成分を含まない定義された培地であるAPEL 2培地に依存しています。高濃度のWNTアゴニスト(CHIR99021)を4日間補給し、続いて線維芽細胞成長因子9(FGF9)/ヘパリンと低濃度のCHIR99021をさらに3日間補給します。このプロセスでは、iPS細胞の開始時に最適な細胞密度とCHIR99021濃度を選択することに重点が置かれます。このプロトコルの重要な面は、IMが徐々にネフロン構造に発展し、糸球体、近位管状、および遠位管状構造を網羅し、すべて視覚的に理解可能な形式で提示されるようにする、低接着プレートでの懸濁培養です。全体として、この詳細なプロトコールは、多様なiPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための効率的で特異的な技術を提供し、成功し、一貫した結果を保証します。

概要

腎臓は、その機能単位に応じて、生理学的恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。老廃物を排泄するネフロンは、体液の組成を調節することができます。遺伝性突然変異などの高リスク因子によって引き起こされる慢性腎臓病(CKD)は、最終的には末期腎臓病(ESKD)に進行します1,2。ESKDは、ネフロンの再生能力が限られていることが原因と思われます。したがって、腎代替療法が必要です。ヒトiPS細胞の分化を指示することで、患者特異的な3D腎臓オルガノイドをin vitroで作製することができ、腎臓の発生の研究、患者固有の疾患のモデル化、腎毒性薬物スクリーニングの実施に使用できます3,4。

胚発生中、腎臓は中間中胚葉(IM)に由来し、原始線条(PS)と区別されます。古典的なWNTシグナル伝達経路は、FGF(FGF9、FGF20)とBMP(JNKを介したBmp7シグナル伝達)の協調的な関与により、IMのさらなる分化を誘導する可能性があります5,6,7。それらは、腎前駆細胞(NPC)の2つの重要な細胞集団、すなわち尿管芽(UB)と中腎間充織(MM)を産生し、それぞれ集合管とネフロンを形成する8,9。各ネフロンは、近位尿細管や遠位尿細管などの糸球体と管状のセグメント、およびヘンレのループで構成されています10,11。上記の理論によると、現在公開されているプロトコルは、シグナルカスケードと成長因子刺激を模倣して腎臓オルガノイドを誘導します5,12。

過去数年間で、ヒトiPS細胞を腎臓オルガノイドに分化するための多くのプロトコルが開発されてきました5,6,7,12。Takasato et al.7は、FGF9で置き換える前に、CHIR(WNTアゴニスト)治療の期間を最適化しました。彼らのプロトコルによると、CHIRを4日間曝露し、その後FGF9を3日間曝露することが、iPS細胞からのIMを誘導する最も効果的な方法です。トランズウェルフィルターは、その手順の培養フォーマットとして利用されました。ただし、この方法は初心者には難しいです。そのため、Kumar et al.13は培養形式を変えようとし、培養を中断することを選択しました。7日目に接着細胞を解離し、ネフロン様構造を含む胚様体(EB)に集合するのを助けるために、接着性の低いプレートに播種した。しかし、これらの方法のバッチ効果は、特に異なるiPS細胞で明らかでした。さらに、さまざまな文献で、CHIRの濃度が7μMから12μMまで変化したことが報告されています5,13,14。

細胞密度とCHIRの濃度が、異なるiPS細胞におけるオルガノイドの生成に影響を与えるのではないかと推測し、実験で何度も検証してきました。本プロトコルは、Kumarらの研究方法をわずかに変更し13 、ユーザーに段階的な手順を提供しました。このアプローチのスケジュールと概略図を 図1に示します。

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プロトコル

本研究に用いたiPS細胞は、市販のものを入手したものである。細胞は、市販の基底膜マトリックスコーティングプレート上でmTeSR培地で維持しました( 材料表を参照)。 表1 には、研究で利用されたすべての培地組成が含まれています。

1. iPS細胞の分化と後原始線条(PS)誘導のためのプレーティング

  1. メンブレンマトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上のiPS細胞を2 mLのDPBSで洗浄します。ピペットを使用してDPBSを吸引します。
  2. 市販の細胞剥離液( 材料表参照)を1 mL添加してiPS細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートします。
  3. iPS細胞にmTeSRを1 mL添加し、細胞がプラスチック表面から浮き上がっていることを確認します。
  4. 細胞を室温(RT)で400 x g で3分間遠心分離します。細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
  5. メンブレンマトリックスでコーティングした24ウェルまたは6ウェルプレートにさまざまな細胞密度を播種し、10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSRで培養します( 材料表を参照)。37°CのCO2 インキュベーターで一晩培養します。
    注:PSを誘導するには、最適なCHIR99021濃度と適切な細胞密度がiPS細胞株によって異なります。密度の範囲(例:0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 * 10 1平方センチメートルあたり3 つの単一細胞)と7 μM〜12 μMのCHIR99021濃度の範囲を播種します。 各密度と各CHIRの分化を同じ日に開始します。24ウェルプレートで最適なCHIR99021濃度と適切な細胞密度を見つけ、6ウェルプレートで培養を拡大します。ここでは、6ウェルプレートに基づくプロトコルを提供します。
  6. 翌日、mTeSRを吸引し、2 mLのDPBSで細胞を洗浄します。
  7. 2 mLのステージI培地(8〜12μMのCHIR99021を含む幹細胞分化培地)(表1)を追加し、0日目を参照します。
  8. 37°Cのインキュベーターで4日間培養し、2日ごとにステージI培地をリフレッシュします。

2.腎形成中間中胚葉(IM)の誘導

  1. 4日目に、ステージI培地を除去し、2 mLのDPBSで洗浄します。
  2. II期の培地2 mLを細胞に加えます(200 ng/mLのFGF9、1 μg/mLのヘパリン、および1 μMのCHIR99021を含む幹細胞分化培地)(表1)。
  3. 37°Cのインキュベーターで培養し、7日目まで2日ごとに培地をリフレッシュします。

3. 浮遊培養における腎臓オルガノイドの生成

注:0日目から7日目までの観察期間中、細胞の状態は危機的です。細胞が正常に増殖し、大きな細胞破片なしで堆積した場合、中間中胚葉(IM)の導出が成功したことを示し、次の段階に進む準備ができていることを示します。ただし、細胞が最初のアポトーシスの兆候を示し、その後壊死または破損が続く場合は、CHIR99021または細胞密度の不適切な濃度を示している可能性があります。

  1. 7日目に、II期培地を除去し、2 mLのDPBSで細胞を洗浄します。
  2. 各ウェルに細胞剥離溶液1 mLを添加し、細胞が位相差下で屈折するまで37°Cで5分間インキュベートします。
  3. ステージII培地1 mLを細胞にピペットで移し、混合し、細胞が表面から浮き上がることを確認します。
  4. 細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、室温で400 x g で3分間遠心分離します。
  5. 上清を除去し、細胞ペレットをステージIII培地2 mL(200 ng/mL FGF9、1 μg/mLヘパリン、および1 μM CHIR99021含有0.1%メチルセルロース(MC)、0.1%ポリビニルアルコール(PVA)を含む幹細胞分化培地)に再懸濁し、10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加します( 資料表を参照)。やさしく混ぜます。
  6. 細胞懸濁液とシード液を1:3の比率で6ウェル低接着プレートに混合します。プレートをオービタルシェーカー(CO2耐性、60rpmで回転)のインキュベーターで37°C、5%CO2で置きます。
  7. 24時間後、Rhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を除去し、ステージIII培地(200 ng/mL FGF9、1 μg/mLヘパリン、1 μM CHIR99021、0.1% MC、0.1% PVAを含む幹細胞分化培地サプリメント)を添加します。2日間培養します。浮遊培養液中の培地は、以下の手順に従って交換します。
    1. 1 mLピペットの先端を無菌ハサミで切断します。
    2. 6ウェルプレートを静かに振って、オルガノイドをプレートの中央に配置します。
    3. 調製したピペットでオルガノイドを15 mLチューブに吸引し、5分間放置します。
    4. 上清を吸引し、オルガノイドをチューブの底に残します。
    5. 新鮮な培地を加えてオルガノイドを再懸濁し、6ウェル低接着性プレートに再播種します。
  8. インキュベーター内で低接着プレートを60rpmで振とうし続けます。12日目まで2日ごとにステージIII培地を交換してください。
  9. 12日目に、培地をステージIV培地(0.1%MCおよび0.1%PVAを含む幹細胞分化培地)に変更します。
  10. 25日目まで2日ごとに培地を交換してください。オルガノイドは、12日目から25日目にかけて徐々に成熟したネフロン構造に発達する可能性があります。

4. 腎臓オルガノイドの免疫蛍光染色

  1. 腎臓オルガノイドを15 mLチューブに集め、2 mLのPBSで洗浄します。
  2. 5〜10分間セットした後、新たに調製した2%PFAに腎臓オルガノイドを4°Cで20分間固定します。
  3. PFA を除去し、0.3% Triton X-100 (0.3% PBST) を含む 1 mL PBS でオルガノイドを洗浄し、シェーカー(回転速度が 60 rpm を超えない)で 8 分間均一に振とうし、5 分間静置してから上清を除去します。これを3回繰り返します。
    注:オルガノイドは、0.3%PBSTで4°Cで2〜4週間保存できます。
  4. 固定オルガノイドをPBST(ブロッキングバッファー)( 材料表参照)中の10%ロバ血清とともに4°Cで一晩インキュベートします。
  5. 一次抗体( 材料表に記載)をブロッキングバッファー中で1:300の比率で希釈します。
  6. オルガノイドと一次抗体を撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
    注:糸球体と尿細管が1つのオルガノイドで同時に染色できることを確認してください。
  7. オルガノイドを1 mLの0.3% PBSTで洗浄し、シェーカー(回転速度60rpmを超えない)で8分間均一に振とうし、5分間静置してから上清を除去します。これを3回繰り返します。
  8. オルガノイドを二次抗体( 材料表に記載)およびDAPIとともに、撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。次に、手順4.7を繰り返します。
    注:二次抗体とDAPIはどちらも、ブロッキング溶液、二次抗体(1:400)およびDAPI(1:1000)で希釈されています。
  9. 染色後、オルガノイドをメタノール(25%、50%、75%、100%それぞれ5分間)で脱水し、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル(BABB、1:2の比率)( 材料表参照)で5分間浸透させます。
  10. 透明化したオルガノイドをガラス底のディッシュ( 材料表を参照)に置き、共焦点顕微鏡で調べます。
    注:イメージングするときは、ガラス皿の底にあるペトリ皿を選択し、浸透するときは、BABBをペトリ皿に直接入れて、皿の底を湿らせておきます。

5. in vitro デキストラン取り込みアッセイ

  1. 25日目に、オルガノイドを100 μg/mLの蛍光標識デキストラン( 材料表を参照)とともに、37°C、5%CO2のインキュベーターで4時間インキュベートします。
  2. 4時間後、新しい培地に切り替え、広視野蛍光顕微鏡を使用して生細胞培養画像を撮影します。

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結果

IMの産生は、GSK3阻害剤CHIR99021を用いて標準的なWNTシグナル伝達を活性化し、続いてFGF9/ヘパリンを活性化することによって達成されます。0日目から4日目にかけて、iPS細胞は急速に拡大し、菱形や三角形の形をします。合流点は90%〜100%に達し、7日目まで均等に蓄積します。浮遊培養では、凝集体は7日目に解離した後、自発的にネフロン構造を形成します。浮遊培養で作製された腎臓オルガノイドは管状の構造を示し、凝集から18日後に明視野画像で容易に観察できます(図2 および 図3)。

典型的には、iPS細胞の24ウェルプレートのウェルから開始した1回のアッセイで、200〜300個のオルガノイドが得られます。このうち、80%〜90%がネフロン様構造を含んでいます(図2)。iPS細胞-B1 iPS細胞株の場合、腎臓オルガノイドの作製に最適な条件は、8 μMのCHIR99021で24ウェルプレートのウェ...

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ディスカッション

iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルが記載されており、基礎培地、初期細胞密度、およびCHIR99021濃度にわずかな変更を加えます。さまざまな実験において、腎臓オルガノイドの作製を成功させるための重要な要素は、中間中胚葉(IM)の初期分化と7日目の細胞状態であることがわかりました。さらに、iPS細胞株が異なれば、細胞増殖能や分化能にもばらつきがあり、その結果、最適な細胞密度やCHIR99021濃度にばらつきが見られました5,13,14。したがって、患者特異的なiPS細胞からかなりの数の腎臓オルガノイドを作製するためには、各iPS細胞株の理想的な状態を決定することが不可欠です。

最適な条件を特定するには、24ウェルプレートを使用して予備実験を行い、その後、培養を6ウェルプレートにスケールアップして大規模生産を行うことをお勧めします。このステップにより、研究者は細胞の形態と量...

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開示事項

著者らは、利益相反の可能性はないと報告した。

謝辞

過去と現在のMaoとHu Labのメンバーの皆さんには、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献をしていただき、心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 to Lidan Hu)、江蘇省自然科学基金会(助成金番号。BK20210150 Gang Wang)に。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェル細胞培養プレート、平底NESTCat #701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #07920
抗体
ベンジルアルコールSigma-Aldrich猫 #100-51-6
安息香酸ベンジルSigma-Aldrich猫 #120-51-4
生物学的安全キャビネットハイアールキャット #HR40 figure-materials-1 A2
ビオチン抗ヒトLTL (1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
血液単核球 hiPS-B1 (iPSc, 女性)該当なし
濃度シェーカーハマニーCat #C0-06UC6
化学物質、ペプチド、および組換えタンパク質
CHIR99021 (Wnt経路活性化剤)STEMCELLTechnologiesCat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture PlateCorningCat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCorningCat #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
DAPI stain SolutionCoolaberCat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647ThermoSCIENTIFICCat #D22914
DMEM/F-12 HEPESフリーServicebioCat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)アブカムキャット #ab150179
ロバ セラム ストステメイルンバイオキャット #MB4516-1
D-PBS (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし)ソーラーバイオ ライフサイエンスキャット #D1040
ドライバス インキュベーター上海 景新キャット #JX-10
ダイライト 488-ヤギ 抗マウス IgG (1:400)アーソックスキャット #E032210
ダイライト488-ヤギ抗ウサギIgG(1:400)アーソックスキャット #E032220
ダイライト549-ヤギ抗マウスIgG(1:400)アーソックスキャット #E032310
ダイライト549-ヤギ抗ウサギIgG(1:400)アーソックスキャット #E032320
ダイライト649-ヤギ抗ウサギIgG(1:400)アーソックスキャット #E032620
実験モデル:細胞株
Forma Steri-Cycle CO2 インキュベーターThermo SCIENTIFICCat #370
Geltre LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
Glass Bottom Culture DishesNESTCat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
Heparin Solution (細胞培養サプリメント)STEMCELL TechnologiesCat #07980
Human Recombinant FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
倒立顕微鏡OLYMPUSCat #CKX53
レーザー走査型共焦点顕微鏡OLYMPUSCat #FV3000
メチルセルローSigma-AldrichCat #M7027
Micro CentrifugeHENGNUOCat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)BD BiosciencesCat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)BD BiosciencesCat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo SCIENTIFICCat #39795
Mowiol 4-88 (ポリビニルアルコール 4-88)Sigma-AldrichCat #81381
mTeSR1 5X SupplementSTEMCELL TechnologiesCat #85852
mTeSR1 Basal MediumSTEMCELL TechnologiesCat #85851
Nunc CryoTube VialsThermo SCIENTIFICCat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)Cell Signaling TechnologyCat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)AbcamCat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)AbcamCat #ab89901
Rabbit anti-human PDGFR (1:300)アブカムCat #ab32570
組換えヒト血清アルブミン (rHSA)イイーセンネコ #20901ES03
ヒツジ抗ヒトNPHS1 (1:300)R&D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat #15040066
Y-27632 (二塩酸塩)STEMCELL TechnologiesCat #72304
二酸化炭素ス

参考文献

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