マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価

Summary

脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)は、免疫応答を調節する可能性があるため、主に炎症の悪化を止めるための新しい治療アプローチとして広く研究されてきました。MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の低発現に基づく免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存し、同種移植のための細胞ベースの治療の使用において生存できる免疫特権細胞です。これらの細胞はいくつかの組織から単離することができ、最も一般的に使用されるのは骨髄および脂肪組織です。私たちは、マウスの精巣上体脂肪組織からMSCを分離、培養、および特性評価するための簡単なプロトコルを提供します。精巣上体脂肪組織を外科的に切除し、物理的に断片化し、0.15%コラゲナーゼII型溶液で消化します。次に、初代脂肪組織由来幹(ADSC)細胞を in vitroで培養および増殖させ、フローサイトメトリーによって表現型の特性評価を行います。また、ADSCを骨形成細胞、脂肪形成細胞、軟骨形成細胞に分化するための手順と、それに続く各細胞系統の機能的特性評価についても説明します。ここで提供されるプロトコルは、 in vivo および ex vivo 実験に使用でき、代替として、脂肪由来幹細胞を使用してMSC様不死化細胞を生成することができます。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞^1,2などの細胞に分化する成体の多電位細胞です。これらの細胞はいくつかの臓器に存在し、そのため、骨髄、筋肉、脂肪、毛包、歯根、胎盤、真皮、軟骨膜、臍帯、肺、肝臓、脾臓などの成体組織から抽出することができます^3,4。

MSCが生理機能と免疫系に及ぼす影響が報告されています^5,6。これらの細胞は、ヒト医学と獣医学の両方で、いくつかの疾患の治療に有望です。MSCは、細胞間接触、可溶性因子、および小さな細胞外小胞7,8,9,10などのさまざまなメカニズムを通じて、炎症を制御し、血管新生および組織の恒常性を促進することができる。さらに、MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の発現が低く、同種移植の細胞ベースの治療に使用されるため、免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存できる免疫特権細胞です^11,12。低免疫原性と再生能が組み合わさったMSCは、移植片対宿主病(GvHD)¹³、全身性エリテマトーデス(SLE)¹⁴、多発性硬化症¹⁵などの細胞治療に理想的な候補となっています^16,17。

MSCはいくつかの成体組織に存在するという事実にもかかわらず、脂肪組織は、最小限の外科的介入で、収穫のためのアクセシビリティなど、他の供給源よりも優れています。高い拡張率で利用可能な多数のセル。また、特定の機器や低コストの材料を必要とせずに、簡単に実行できるプロトコルを使用して、in vitroでの展開が容易になります18,19,20。抽出された脂肪組織由来幹細胞(ADSC)は、国際細胞療法学会(ISCT)²¹によって確立されたように特徴付けられなければならない。したがって、MSCは、形態が線維芽細胞様で、可塑性培養に付着し、エンドグリン(CD105)、ecto-5'-ヌクレオチダーゼ(CD73)、Thy-1(CD90)などの間葉系マーカーを高い割合(≥95%)で発現し、白血球共通抗原(CD45)、膜貫通リン糖タンパク質(CD34)、糖脂質固定膜糖タンパク質(CD14)、インテグリンα M(CD11b)、B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖(CD79α)などの造血マーカーの割合が低い(≤2%)を示さなければなりません。Bリンパ球表面抗原B4(CD19)およびクラスIIヒト白血球抗原(HLA-II)。さらに、機能的な特性評価が必要であり、細胞は骨芽細胞、軟骨芽細胞、または脂肪芽細胞に分化できるべきである²¹。

ここでは、 in vitro 研究のための機械的解離と酵素消化、およびISCTによって予め設定された形態学的特性評価を使用して、精巣上体脂肪組織からMSCを取得する方法を示します。

Protocol

すべての動物実験は、動物倫理に関する国際的なガイドラインに従って実施され、サンタクルーズ州立大学の機関のケアおよび使用委員会によってプロトコル番号021/22で承認されました。スイスの雄マウス(6〜8週間)は、サンタクルス州立大学動物研究施設(LaBIO-UESC)の動物研究施設から入手し、特定の病原体のない条件で維持され、12時間の明暗サイクルで水と食物を自由に受け取りました。

注:他のマウス系統を使用できます。成体マウス(6-8週)は、脂肪組織や細胞が発達し、増殖活性が高いため、使用をお勧めします。

1. 事前準備

注:先に進む前に、以下に説明する以下の試薬を準備してください。試薬および材料供給業者の情報については、 材料表 を参照してください。マスク、キャップ、白衣、手袋などの個人用保護具は、すべての実用的な手順で着用する必要があります。

1. 精巣上体脂肪組織抽出
   1. 手術材料を予約します:滅菌ピンセットとハサミ3セット、針5本、70%エタノール200mLを含むビーカー。
   2. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を混合して、終末麻酔薬を準備します。
2. ADSCの文化
   1. 基礎培地:10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB、100 U/mLペニシリン、および100 mg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)高グルコース培地を調製します。
   2. 消化液:0.25 μmフィルターで滅菌したPBS中の0.15%のコラゲナーゼII型を調製します。
      注:基礎培地に記載されている4つの抗生物質を使用する必要はありません。これは、これが行われる研究室の細胞培養条件によって異なります。
3. ADSCの表現型の特徴付け
   1. PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します。
   2. 表1に記載されているように抗マウス抗体を希釈します。
   3. PBSで2%ホルムアルデヒドを調製します。
4. ADSCの骨形成分化

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Results

ここに提示されたプロトコルに従って脂肪組織から抽出された細胞は、ISCTによって提案されたMSCの最小基準に一致する形態を示しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。表現型的には、ADSCは細胞培養の最初の数日間に可塑性および線維芽細胞様形態への付着を示しました(図2A)。さらに、それらは均質に成長し、コロニーを形成しました。さらに、ADSCは、造血マーカーであるCD34(2.12%)とCD45(1.81%)の発現が低く、CD71(42.6%)、CD29(74.2%)、およびCD90(55.1%)の発現が高く、すべての間葉系細胞マーカーを示しました(図2B)。

図2:脂肪組織由来細胞の表現型の特徴付け(A)培養の2日目、4日目、および8日目に丸い細胞から線維芽細胞様に変化するADSCの形態。スケールバー = 22.22 μm. (B) ASCで表されるマーカー(CD71、CD29、CD90)または表されないマーカー(CD34、CD45)のヒストグラム。この図は、Miranda et ^al.24の許可を得て複製されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

機能的には、ADSCは、各系統のコンディショニング培地で14日間または21日間培養すると、骨芽細胞、脂肪芽球、および軟骨芽細胞に分化するための多能性を示しました(図3)。フォンコッサ染色では、骨形成過程の特徴である細胞外マトリックスの石灰化結節が明らかになりました(図3)。Oil-red O染色では、ADSCの細胞質に脂質液胞が認められ、Alcian Blue染色では、細胞外マトリックスにグリコサミノグリカンが存在することが確認されました(図3)。一緒に、表現型と機能的特性により、精巣上体脂肪組織から抽出された細胞の集団がMSCとして確認されています。

図3:脂肪組織由来細胞の機能的特性評価。 ADSCの骨形成性、脂肪形成性、および軟骨形成性の多系統性の可能性 培養14日後および21日後。スケールバー = 50 μm (上部パネル)、100 μm (中央および下部パネル)。この図は、Miranda et ^al.24の許可を得て複製されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

MSCは、さまざまな組織から抽出できます。骨髄はマウスとヒトの両方でMSCの一般的な供給源であるにもかかわらず^25,26、この研究では、MSCが豊富であること、体内での分布、およびアクセスの容易さから、脂肪組織を扱うことを選択しました。代替として、脂肪由来幹細胞を使用して、MSC様の不死化細胞²⁷を生成することができる。

抽出のいくつかのポイントは、ここで共有されているプロトコルの成功のために特別な注意に値します。まず、無菌状態で行わなければならない組織を収集するためのケアを強調します。そのため、手術を開始する前に、マウスが70%アルコールで適切に消毒されていることを確認してください。また、精巣上体脂肪組織を採取するために同じピンセットやハサミを使用しないことで、汚染源を避けることも重要なポイントです。

2つ目の懸念事項は、組織の処理です。コニカルチューブ内のフラグメントは、37°Cで10分間のインキュベーションで適切かつ激しく振とうする必要があります。 翌日、そして2〜3日ごとに媒体を交換することが非常に重要です。毎日培養を観察し、培地の色、細胞の形状、および培養環境への干渉を確認することをお勧めします。

3つ目の懸念事項は、MSCの特性評価に最適な時間/通過点に関するものです。ここでは、細胞の3回目の継代で行うことをお勧めしますが、これは必須ではありません。それは研究の目的によります。3番目の継代では、細胞の約80%がMSCとして特徴付けられており、これはたとえばこの研究の目的には十分です。表現型の特徴付けは、造血マーカー(CD34やCD45など)や間葉系マーカー(CD29、CD73、CD90、CD105など)の発現を解析することで行います。さらに、International Society for Cell and Gene Therapy(ISCT)²¹ は、ADSCが線維芽細胞様の形態を持ち、培養プラットフォームのプラスチックに付着する必要があることを強調しています。形態は、成長中の培養中に顕微鏡で観察することができます。機能特性評価は、ADSCが骨芽細胞、脂肪芽細胞、および軟骨芽細胞に分化する可能性を分析することによって実行されます。表現型の特徴付けでは、間葉系マーカーと造血マーカーの割合は動物種や細胞源によって異なる場合があり、ISCTが推奨する数値を完全には満たしていません。例えば、ISCTは、ヒトMSCに対して、CD105、CD73、CD90の≥95%、およびCD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79aまたはCD19の≤2%、ヒト白血球抗原-DRアイソタイプ(HLA-DR)²¹を推奨しています。さらに、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞系統に分化する細胞の機能特性評価と多能性の確認を行うことが重要です。これらの系統のうち少なくとも2つは、多能性を証明するために推奨されます。

これらのハイライトされたポイントに加えて、ここで提案されているいくつかのアッセイ、例えば、Von Kossa染色の代わりにAlizarin Red S、Alcian Blueの代わりに過ヨウ素酸Shiff、フローサイトメトリーの代わりにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を代替することができます。

ヒトに記載されている3種類の脂肪組織(白、茶色、ベージュ)の中で、白色脂肪組織はMSCの供給源が最も多い²⁸。この組織は、ここで報告されている精巣上体の上の脂肪など、皮下、腹部、および鼠径部の領域から取得できます。ここで共有されているプロトコルで使用されるコラゲナーゼによる物理的断片化と酵素消化は、処理中に枯渇する脂肪細胞を除いて、多くの細胞タイプで構成される間質血管画分(SVF)を導き出します。

結論として、脂肪組織をMSCの供給源として使用する主な利点には、その豊富さと細胞単離方法の容易さが含まれ、抗炎症および再生特性としてのMSCの治療可能性に関連しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140度;C 高熱滅菌 CO2 インキュベーター	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD	, 中国 C180
3-イソブチル-1-メチルキサンチン	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
酢酸氷河	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagentは、糖タンパク質の検出に適しています。1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
抗体抗マウス抗CD29 FITC (クローン Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	細胞内の機能:接着と活性化、胚形成、白血球、DC、血小板、肥満細胞、線維芽細胞、内皮細胞
抗体抗マウス抗CD34 PE(クローンRAM34)	BD Biosciences、カリフォルニア州サンディエゴ、米国	551387	細胞内の機能:細胞接着因子。造血幹細胞
抗体 抗マウス抗CD45 APC (クローン 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	細胞内の機能: 白血球の活性化をアシスト
抗体 抗マウス抗CD71 FITC (クローン C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	細胞内の機能: 細胞増殖中の鉄の取り込みを制御します。増殖細胞、網状赤血球および前駆体
抗体 抗マウス抗CD90 PerCP (クローンOX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	細胞内の機能:シグナル伝達、接着。Tリンパ球、NK、単球、HSC、ニューロン、線維芽細胞
アスコルビン酸	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
自動ピペット	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	該当		1ユニット
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile.TPP組織培養プレート
細胞培養プレート(96ウェル。丸型またはV底)	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	CLS353077	01ユニット滅菌済み。ウェルズ、96、組織培養(TC)処理された表面、丸底の透明なウェル、無菌
軟骨原性培地	ステムプロ軟骨形成分化–ライフテクノロジー	A1007101	TGF-β2、TGF-&ベータ;3、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、ITS、ナトリウム-l - アスコルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸-2-リン酸
コラゲナーゼII型	Life Technologies、カリフォルニア州、米国	17101015
アルミニウムで覆われたコルクまたは発泡スチロールボード	該当		綿1単位
	該当		50 g
デキサメタゾン	Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国	D4902
解剖用ハサミ	該当		03 ユニット 無菌
DPX 組織学用マウンタント	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco'修正されたイーグル」	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	1000 mg/L グルコースと L-グルタミン、重炭酸ナトリウムなし、粉末、細胞培養に適しています
Eosin B	Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国	861006
ウシ胎児血清 (FBS)	Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国	F4135
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国	47608
ホルマリン	Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス	H3136
皮下注射針 (0.3mm x 13mm)	該当		5 単位
インドメタシン	Sigma-Aldrich、サンルイス、米国ミズーリ	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
ノイバウアーチャンバー	シグマ・アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国	BR718620	ブランド計数チャンバー ブラウブランド ノイバウアーパターン。クリップ付き、ダブルルール
の日竿ピペットチップ(0.1–10 μL)	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	Z645540	ボリューム範囲 0.1–10 μL、細長い、バルクパック。滅菌
日稜ピペットチップ(1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	容量範囲 1–10 mL、ユニバーサル、バルクパック。滅菌
日稜ピペットチップ(200 μL)	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	Z645516	最大容量 200 μL、卒業、ミニスタック。滅菌
オイルレッドO溶液	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48、ブロック形態の
ペニシリン/ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国	P4333	溶液安定化、10,000ユニットのペニシリンと10mgのストレプトマイシン/ mL、0.1 μmろ過、BioReagent、細胞培養に適した
リン酸緩衝生理食塩水1x(PBS)。	Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス	P3813	粉末、pH 7.4、1 L溶液の調製用。バランスのとれた滅菌
ポリプロピレン円錐管(15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	滅菌
ポリプロピレン円錐管(50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2ユニット
メス(オプション)	該当		1ユニット
硝酸銀	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
チオ硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
外科用ピンセット (15 cm)	該当		3 ユニット 滅菌済み
スイスの雄マウス (6–8週間)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	該当		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
キシラジン	シグマ-アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国	PHR3263
ベータ;-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物	シグマ-アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国	G9422	BioUltra、細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99%(滴定)