脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。
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この記事について
サマリー
要約
間葉系幹細胞(MSC)は、免疫応答を調節する可能性があるため、主に炎症の悪化を止めるための新しい治療アプローチとして広く研究されてきました。MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の低発現に基づく免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存し、同種移植のための細胞ベースの治療の使用において生存できる免疫特権細胞です。これらの細胞はいくつかの組織から単離することができ、最も一般的に使用されるのは骨髄および脂肪組織です。私たちは、マウスの精巣上体脂肪組織からMSCを分離、培養、および特性評価するための簡単なプロトコルを提供します。精巣上体脂肪組織を外科的に切除し、物理的に断片化し、0.15%コラゲナーゼII型溶液で消化します。次に、初代脂肪組織由来幹(ADSC)細胞を in vitroで培養および増殖させ、フローサイトメトリーによって表現型の特性評価を行います。また、ADSCを骨形成細胞、脂肪形成細胞、軟骨形成細胞に分化するための手順と、それに続く各細胞系統の機能的特性評価についても説明します。ここで提供されるプロトコルは、 in vivo および ex vivo 実験に使用でき、代替として、脂肪由来幹細胞を使用してMSC様不死化細胞を生成することができます。
概要
間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞1,2などの細胞に分化する成体の多電位細胞です。これらの細胞はいくつかの臓器に存在し、そのため、骨髄、筋肉、脂肪、毛包、歯根、胎盤、真皮、軟骨膜、臍帯、肺、肝臓、脾臓などの成体組織から抽出することができます3,4。
MSCが生理機能と免疫系に及ぼす影響が報告されています5,6。これらの細胞は、ヒト医学と獣医学の両方で、いくつかの疾患の治療に有望です。MSCは、細胞間接触、可溶性因子、および小さな細胞外小胞7,8,9,10などのさまざまなメカニズムを通じて、炎症を制御し、血管新生および組織の恒常性を促進することができる。さらに、MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の発現が低く、同種移植の細胞ベースの治療に使用されるため、免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存できる免疫特権細胞です11,12。低免疫原性と再生能が組み合わさったMSCは、移植片対宿主病(GvHD)13、全身性エリテマトーデス(SLE)14、多発性硬化症15などの細胞治療に理想的な候補となっています16,17。
MSCはいくつかの成体組織に存在するという事実にもかかわらず、脂肪組織は、最小限の外科的介入で、収穫のためのアクセシビリティなど、他の供給源よりも優れています。高い拡張率で利用可能な多数のセル。また、特定の機器や低コストの材料を必要とせずに、簡単に実行できるプロトコルを使用して、in vitroでの展開が容易になります18,19,20。抽出された脂肪組織由来幹細胞(ADSC)は、国際細胞療法学会(ISCT)21によって確立されたように特徴付けられなければならない。したがって、MSCは、形態が線維芽細胞様で、可塑性培養に付着し、エンドグリン(CD105)、ecto-5'-ヌクレオチダーゼ(CD73)、Thy-1(CD90)などの間葉系マーカーを高い割合(≥95%)で発現し、白血球共通抗原(CD45)、膜貫通リン糖タンパク質(CD34)、糖脂質固定膜糖タンパク質(CD14)、インテグリンα M(CD11b)、B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖(CD79α)などの造血マーカーの割合が低い(≤2%)を示さなければなりません。Bリンパ球表面抗原B4(CD19)およびクラスIIヒト白血球抗原(HLA-II)。さらに、機能的な特性評価が必要であり、細胞は骨芽細胞、軟骨芽細胞、または脂肪芽細胞に分化できるべきである21。
ここでは、 in vitro 研究のための機械的解離と酵素消化、およびISCTによって予め設定された形態学的特性評価を使用して、精巣上体脂肪組織からMSCを取得する方法を示します。
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プロトコル
すべての動物実験は、動物倫理に関する国際的なガイドラインに従って実施され、サンタクルーズ州立大学の機関のケアおよび使用委員会によってプロトコル番号021/22で承認されました。スイスの雄マウス(6〜8週間)は、サンタクルス州立大学動物研究施設(LaBIO-UESC)の動物研究施設から入手し、特定の病原体のない条件で維持され、12時間の明暗サイクルで水と食物を自由に受け取りました。
注:他のマウス系統を使用できます。成体マウス(6-8週)は、脂肪組織や細胞が発達し、増殖活性が高いため、使用をお勧めします。
1. 事前準備
注:先に進む前に、以下に説明する以下の試薬を準備してください。試薬および材料供給業者の情報については、 材料表 を参照してください。マスク、キャップ、白衣、手袋などの個人用保護具は、すべての実用的な手順で着用する必要があります。
- 精巣上体脂肪組織抽出
- 手術材料を予約します:滅菌ピンセットとハサミ3セット、針5本、70%エタノール200mLを含むビーカー。
- ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を混合して、終末麻酔薬を準備します。
- ADSCの文化
- 基礎培地:10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB、100 U/mLペニシリン、および100 mg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)高グルコース培地を調製します。
- 消化液:0.25 μmフィルターで滅菌したPBS中の0.15%のコラゲナーゼII型を調製します。
注:基礎培地に記載されている4つの抗生物質を使用する必要はありません。これは、これが行われる研究室の細胞培養条件によって異なります。
- ADSCの表現型の特徴付け
- PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します。
- 表1に記載されているように抗マウス抗体を希釈します。
- PBSで2%ホルムアルデヒドを調製します。
- ADSCの骨形成分化
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結果
ここに提示されたプロトコルに従って脂肪組織から抽出された細胞は、ISCTによって提案されたMSCの最小基準に一致する形態を示しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。表現型的には、ADSCは細胞培養の最初の数日間に可塑性および線維芽細胞様形態への付着を示しました(図2A)。さらに、それらは均質に成長し、コロニーを形成しました。さらに、ADSCは、造血マーカーであるCD34(2.12%)とCD45(1.81%)の発現が低く、CD71(42.6%)、CD29(74.2%)、およびCD90(55.1%)の発現が高く、すべての間葉系細胞マーカーを示しました(図2B)。
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ディスカッション
MSCは、さまざまな組織から抽出できます。骨髄はマウスとヒトの両方でMSCの一般的な供給源であるにもかかわらず25,26、この研究では、MSCが豊富であること、体内での分布、およびアクセスの容易さから、脂肪組織を扱うことを選択しました。代替として、脂肪由来幹細胞を使用して、MSC様の不死化細胞27を生成することができる。
抽出のいくつかのポイントは、ここで共有されているプロトコルの成功のために特別な注意に値します。まず、無菌状態で行わなければならない組織を収集するためのケアを強調します。そのため、手術を開始する前に、マウスが70%アルコールで適切に消毒されていることを確認してください。また、精巣上体脂肪組織を採取するために同じピンセットやハサミを使用しないことで、汚染源を避けることも重要なポイントです。
2つ目の懸念事項は、組織の処理です。コニカルチューブ内のフ...
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) と Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) の助成金による研究。この研究は、PROPP UESC(073.6764.2019.0021079-85)によって部分的に資金提供されました。MGAGとURSは、それぞれFundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)とCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES)によって授与された奨学金のおかげです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 140度;C 高熱滅菌 CO2 インキュベーター | RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD | , 中国 C180 | |
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I7018 | |
| 酢酸氷河 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1748 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A9186 | BioReagentは、糖タンパク質の検出に適しています。1% in acetic acid, pH 2.5 |
| Alcohol 70% | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 65350-M | 70% in water |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1662 | |
| 抗体抗マウス抗CD29 FITC (クローン Ha2/5) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 555005 | 細胞内の機能:接着と活性化、胚形成、白血球、DC、血小板、肥満細胞、線維芽細胞、内皮細胞 |
| 抗体抗マウス抗CD34 PE(クローンRAM34) | BD Biosciences、カリフォルニア州サンディエゴ、米国 | 551387 | 細胞内の機能:細胞接着因子。造血幹細胞 |
| 抗体 抗マウス抗CD45 APC (クローン 30-F11) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 559864 | 細胞内の機能: 白血球の活性化をアシスト |
| 抗体 抗マウス抗CD71 FITC (クローン C2) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 553266 | 細胞内の機能: 細胞増殖中の鉄の取り込みを制御します。増殖細胞、網状赤血球および前駆体 |
| 抗体 抗マウス抗CD90 PerCP (クローンOX-7) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 557266 | 細胞内の機能:シグナル伝達、接着。Tリンパ球、NK、単球、HSC、ニューロン、線維芽細胞 |
| アスコルビン酸 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1008 | |
| 自動ピペット | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 4700850N | Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits |
| Beaker | 該当 | 1ユニット | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A7906 | |
| Cell culture plates (6-well) | Merck, Darmstadt, Germany | Z707759 | 07 units sterile.TPP組織培養プレート |
| 細胞培養プレート(96ウェル。丸型またはV底) | メルク、ダルムシュタット、ドイツ | CLS353077 | 01ユニット滅菌済み。ウェルズ、96、組織培養(TC)処理された表面、丸底の透明なウェル、無菌 |
| 軟骨原性培地 | ステムプロ軟骨形成分化–ライフテクノロジー | A1007101 | TGF-β2、TGF-&ベータ;3、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、ITS、ナトリウム-l - アスコルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸-2-リン酸 |
| コラゲナーゼII型 | Life Technologies、カリフォルニア州、米国 | 17101015 | |
| アルミニウムで覆われたコルクまたは発泡スチロールボード | 該当 | 綿1単位 | |
| 該当 | 50 g | ||
| デキサメタゾン | Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国 | D4902 | |
| 解剖用ハサミ | 該当 | 03 ユニット 無菌 | |
| DPX 組織学用マウンタント | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 6522 | |
| Dulbecco'修正されたイーグル」 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | D5523 | 1000 mg/L グルコースと L-グルタミン、重炭酸ナトリウムなし、粉末、細胞培養に適しています |
| Eosin B | Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国 | 861006 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国 | F4135 | |
| ホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国 | 47608 | |
| ホルマリン | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス | HT501128 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス | G1397 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス | H3136 | |
| 皮下注射針 (0.3mm x 13mm) | 該当 | 5 単位 | |
| インドメタシン | Sigma-Aldrich、サンルイス、米国ミズーリ | I0200000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I3536 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 563935 | 70% in H2O |
| Ketamine-D4 hydrochloride solution | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | K-006 | 1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant® |
| ノイバウアーチャンバー | シグマ・アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国 | BR718620 | ブランド計数チャンバー ブラウブランド ノイバウアーパターン。クリップ付き、ダブルルール |
| の日竿ピペットチップ(0.1–10 μL) | メルク、ダルムシュタット、ドイツ | Z645540 | ボリューム範囲 0.1–10 μL、細長い、バルクパック。滅菌 |
| 日稜ピペットチップ(1–10 mL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z717401 | 容量範囲 1–10 mL、ユニバーサル、バルクパック。滅菌 |
| 日稜ピペットチップ(200 μL) | メルク、ダルムシュタット、ドイツ | Z645516 | 最大容量 200 μL、卒業、ミニスタック。滅菌 |
| オイルレッドO溶液 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | O1391 | 0.5% in isopropanol |
| Paraffin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 107.151 | 46–48、ブロック形態の |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich、サンルイス、ミズーリ州、米国 | P4333 | 溶液安定化、10,000ユニットのペニシリンと10mgのストレプトマイシン/ mL、0.1 μmろ過、BioReagent、細胞培養に適した |
| リン酸緩衝生理食塩水1x(PBS)。 | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州サンルイス | P3813 | 粉末、pH 7.4、1 L溶液の調製用。バランスのとれた滅菌 |
| ポリプロピレン円錐管(15 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-959-53A | 滅菌 |
| ポリプロピレン円錐管(50 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-432-22 | 2ユニット |
| メス(オプション) | 該当 | 1ユニット | |
| 硝酸銀 | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 85228 | |
| チオ硫酸ナトリウム | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 72049 | |
| 外科用ピンセット (15 cm) | 該当 | 3 ユニット 滅菌済み | |
| スイスの雄マウス (6–8週間) | Bioterium, Santa Cruz State University | 021/22 | |
| syringe (1 mL) | 該当 | 1 unit | |
| Trypan Blue Dye | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T3924 | |
| キシラジン | シグマ-アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国 | PHR3263 | |
| ベータ;-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物 | シグマ-アルドリッチ、サンルイス、ミズーリ州、米国 | G9422 | BioUltra、細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99%(滴定) |
参考文献
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
- Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
- Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
- Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
- Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
- Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
- Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
- Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
- Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
- Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
- Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
- Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
- Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
- Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
- Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
- Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
- Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
- Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
- Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
- Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
- Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
- Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).
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