方法論記事

組換えRCAS(A)レトロウイルスのニワトリ胚水晶体へのマイクロインジェクション

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DOI：

10.3791/65727

⸱

2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

この記事について

サマリー

このプロトコルペーパーはレンズの開発の間に蛋白質のその 場 機能そして表現を調査するための用具としてRCAS (A)のretrovirusの萌芽期の鶏レンズのmicroinjectionの方法論を記述する。

要約

胚ニワトリ(Gallus domesticus)は、ヒトの水晶体との類似性が高いことから、水晶体の発達と生理学の研究において確立された動物モデルです。RCAS(A)は、分裂細胞に感染する複製能力のあるニワトリレトロウイルスであり、発生初期に水晶体小胞の空腔にマイクロインジェクションすることにより、水晶体発生中の野生型および変異型タンパク質の in situ 発現と機能を研究するための強力なツールとして機能し、その作用を周囲の増殖する水晶体細胞に制限します。トランスジェニックモデルや ex vivo 培養などの他のアプローチと比較して、RCAS(A)複製能力のある鳥レトロウイルスの使用は、ニワトリ胚で外因性タンパク質を発現するための非常に効果的で迅速でカスタマイズ可能なシステムを提供します。具体的には、標的遺伝子導入は、組織特異的プロモーターを必要とせずに増殖性水晶体線維細胞に限定することができます。本稿では、組換えレトロウイルスRCAS(A)の調製に必要なステップを簡単に概説し、マイクロインジェクション手順の詳細かつ包括的な概要を提供し、この技術のサンプル結果を提供します。

概要

このプロトコルの目的は、RCAS(A)(複製有能な鳥肉腫/白血病レトロウイルスA)の萌芽期のニワトリ水晶体マイクロインジェクションの方法論を記述することです。ニワトリ胚の胎内レンズにおける効果的なレトロウイルス送達は、正常な水晶体の生理学、病理学的状態、および発生における水晶体タンパク質の分子メカニズムと構造機能の in vivo 研究のための有望なツールであることが実証されています。さらに、この実験モデルは、治療標的の同定や、ヒトの先天性白内障などの疾患の薬物スクリーニングに使用できます。全体として、このプロトコルは、レンズタンパク質の研究のためのカスタマイズ可能なプラットフォームの開発に必要な手順を説明することを目的としています。

胚のひよこ(Gallus domesticus)は、水晶体の構造と機能がヒトの水晶体と類似しているため、水晶体の発達と生理学の研究のための確立された動物モデルです1,2,3,4。RCAS(A)複製能力のある鳥レトロウイルスの使用は、ニワトリ胚で外因性タンパク質を発現するための非常に効果的で迅速でカスタマイズ可能なシステムと見なされています。特に、空のレンズ内腔の存在により、増殖性レンズ線維細胞内の外因性タンパク質の発現のための制限部位へのin situRCAS(A)マイクロインジェクションを可能にする独自の胚発生時間枠を使用して、組織特異的プロモーターを必要とせずに増殖性レンズファイバー細胞に標的遺伝子伝達を限定する独自の能力を持っています5、6,7,8。

ここで詳細に説明されているニワトリ胚のマイクロインジェクション手順は、もともとFeketeらの研究に部分的に基づいています。al.6 と Jiang et によってさらに開発されました。al.8であり、胚のひよこ1,9,10,11,12,13の水晶体にウイルスと非ウイルスの両方のプラスミドを導入する手段として利用されています。全体として、以前の研究は、この方法論を利用して、水晶体の発達、分化、細胞間コミュニケーション、および疾患の進行を研究し、白内障などの水晶体の病理学的状態の治療標的の発見とテストに利用できる可能性を示しています。

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プロトコル

本研究は、動物福祉法および動物福祉実施規則を遵守し、「実験動物の飼育及び利用に関する手引き」の原則に従って実施された。すべての動物処置は、テキサス大学サンアントニオ校健康科学センターの動物飼育および使用委員会によって承認されました。プロトコルの概要については、 図 1 を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

figure-protocol-1
図1:実験概要1. プロトコルの最初のステップは準の遺伝子シーケンスの特定のターゲット蛋白質、同一証明、およびDNAのフラグメントの生成の決定です。 2 .アダプターベクターへの最初のクローニングによるレトロウイルスベクターへの遺伝子配列のクローニング、 3. その後にウイルスベクター。 4. パッケージング細胞を使用して高力価ウイルス粒子を調製し、回収および濃縮します。 5. 最後のステップであり、このプロトコルの焦点は、RCAS(A)ウイルス粒子をレンズ内腔にマイクロインジェクションすることです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

1. 高力価組換えレトロウイルスの調製

  1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的タンパク質DNA断片の作製
    注:このセクションは、標的レンズタンパク質に対応するDNA配列を増幅することを目的としています。詳細については、7、8を参照してください。
    1. FLAGエピトープ配列(5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3')、終止コドン、およびCLa12NCOのポリリンカー領域内に存在する制限酵素部位(すなわち、EcoRI)の有無にかかわらず、カルボキシル末端を有するDNA断片をフレーム内で作るために、関心のあるタンパク質に対応するPCR用プライマーを設計し、以前に公開されたプロトコルに記載されている仕様に従って、適切な制限酵素1の配列で、 7,8,10,11。
    2. PCR反応10を行う。設計したプライマーの100 pmolのセンスおよびアンチセンスを、0.5 μgのコネキシンcDNA(Cx50、Cx43、またはキメラCx50*43Lの組み合わせなど)と組み合わせて、選択したPCR反応バッファーにします。94°Cで1分間、58°Cで1分間、72°Cで1分間、それぞれ30サイクルを実行し、その後、72°Cで10分間の最終的な延長を行います。
    3. ゲル精製キットでPCR産物を単離・精製します。
    4. 精製されたPCR産物は、メーカーの指示に従って、選択した制限酵素を使用して消化します。
  2. アダプタープラスミドへのDNAインサートのクローニング
    注:アダプターベクターにDNA断片を挿入すると、RCAS(A)ベクターの安定性を高めるためのヘルパー細胞/ウイルスが不要になります14。詳細については、7、8を参照してください。
    1. 粘着末端ライゲーション反応を用いて、DNA断片をアダプタープラスミドCla12NCOにサブクローンします。PCRフラグメントを制限酵素およびCla12NCOと2〜5:1の比率で混合します。コンピテントセルを用いたライゲーションとDNA形質転換を行います。
    2. DNA単離キットを使用してDNAを単離します。
    3. DNAの配列を決定し、正確性を確保します。
  3. RCAS(A)ウイルスベクターへのクローニング
    注:DNA断片は、発生中のニワトリ胚の細胞への遺伝子の安定した形質導入のためにビヒクル(RCAS(A)レトロウイルス)に挿入されます14,15。詳細については、7,8,15を参照してください。
    1. 目的含有ベクターのCla12NCO-DNA断片をClaI(DNA1 μgあたり1ユニット)で消化し、フラグメントをゲル単離します。
    2. DNA断片をClaI直鎖化RCAS(A)プラスミドにサブクローニングします。制限酵素SalIを使用して、RCAS(A)プラスミド上のClaI部位を区別します。
    3. ClaIおよびSalI制限酵素による消化により、コンストラクト上の挿入されたフラグメントの正しい配向を確認します。
    4. DNA単離キットを使用してDNAを単離します。
    5. DNA濃度を決定します。
  4. ニワトリ胚性線維芽細胞(CEF)細胞のトランスフェクションとRCAS(A)採取
    注:ウイルスパッケージング細胞(CEF)は、ウイルス粒子を含む細胞培養培地を入手/回収するために使用されます15,16。詳細については、7,8,15を参照してください。
    1. CEF細胞に組換えレトロウイルスDNAコンストラクトをトランスフェクションし、トランスフェクション剤を使用して、メーカーの指示に従ってトランスフェクションします。
    2. トランスフェクションした細胞のウェスタンブロッティングを行い、目的のタンパク質の発現を調べます。
    3. トランスフェクションした細胞がコンフルエントに達したら、上清培地の回収を開始し、適切に処理/ろ過し(0.22 μmフィルターを使用して細胞の破片を除去するため)、濃縮の準備が整うまで-80°Cで保存します。
  5. ウイルスストックの濃度と力価
    注:ウイルス粒子を含む細胞に由来するペレットおよび大量の培地は、ろ過する必要があります。さらに、宿主細胞に対するウイルスの強度を確立するために、ウイルス力価アッセイを実施する必要があります。詳細については、6,7,8,15を参照してください。
    1. ビリオンを含む培地を融解します。
    2. 培地を72,000 × g で4°Cで2時間スピンします。
    3. 上清をデカントし、ウイルスペレットを残留培地(~50 μL)と再懸濁し、~10 μLのウイルスストックで使用まで-80°Cで保存します。
    4. 力価測定には、QT-6細胞またはCEF細胞のいずれかを使用して、ウイルスストックの段階希釈で細胞をトランスフェクションします。
    5. コンフルエント後、4%ホルムアルデヒドを使用して細胞を固定します。
    6. ウイルスギャグタンパク質の免疫染色、またはアルカリホスファターゼの組織化学的プロセスにより、(コロニー形成単位)CFU/ミリリットル(CFU/mL)として定義される力価を得ます。

figure-protocol-2
図2:ひよこレンズマイクロインジェクション用の機器とセットアップ 。 (A)P-30手動縦型マイクロ電極マイクロピペットプーラー。(1)ガラス製マイクロピペットが引き抜かれている様子を示す挿入図。(B)(2)卵インキュベーター。鶏卵を37°Cのインキュベーターで65~68時間インキュベートし、ステージ18(密閉された空の中央内腔)に到達し、レトロウイルスを注射します。(C)マイクロインジェクションのセットアップ。(3)照明器具、(4)ピコインジェクター、(5)解剖顕微鏡、(6)ドラモンドマイクロマニピュレーター、(7)可視化用コンピュータ/カメラ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

2.ひよこレンズマイクロインジェクション

  1. 物資の準備
    1. マイクロインジェクション用ガラスマイクロピペットの調製17
      注:ガラスキャピラリーは、マイクロインジェクション用のチップポイントと外径(OD)~11 μmのガラス製マイクロピペットの製造に使用されます。セットアップを 図2Aに示します。
      1. ホウケイ酸ガラスキャピラリーを手動垂直マイクロピペットプーラーのゴム製クッション付きクリップに取り付けます。
      2. 加熱温度(HEAT1)を950°Cに設定し、予備引っ張りを行うことで、より薄く柔らかいガラスキャピラリーが得られます。
      3. 加熱温度(HEAT 2)を790°Cに設定し、2次プルを実行して最終的なマイクロピペットを製造します。
      4. マイクロピペットグラインダーを使用して、チップ開口部を外径~11 μmに鋭利にします。
      5. 今後の実験のために、ガラス製マイクロピペットをガラス瓶内のスポンジクランプパッドに入れて保管してください。
    2. 発育段階18までの受精卵の孵化
      注:水晶体の発育中、胚発生の65~68時間で、水晶体は外胚葉から分離し、中央の内腔を持つ密封された小胞を形成します。この空のレンズ内腔への注入は、増殖性水晶体細胞への発現を制限するためのプライミング7,8,18。
      1. 受精した鶏卵を37°Cの加湿ロッキングインキュベーターで65~68時間孵化させます(図2B)。
  2. 鶏卵の開封
    注:このステップでは、マイクロインジェクションのための胚の同定と曝露について説明します。詳細については、7、8を参照してください。
    1. 作業エリアを70%エタノールで完全に拭き取ります。
    2. インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールを大量にスプレーし、風乾させます。
    3. 卵の大きい方の端を上に向けて、卵ホルダーに卵を置きます。
    4. 一対の鋭い歯の鉗子を使用して、卵殻を慎重に軽くたたき、卵殻の破片を取り除くことにより、卵の大きい方の端に直径~2cmの穴を開けます(図3A)。
    5. 解剖顕微鏡を使用して、胚の位置を特定します。
    6. 胚とひよこ水晶体の位置が決まったら、解剖顕微鏡と微細な解剖鉗子とハサミを使用して、胚の上部を覆っている羊膜を切除します(図3B)。
      注:あまり広くカットしないでください(胚~0.5 cm x 0.5 cmを露出させるのに十分な量のみ)、そうしないと、胚が卵黄の塊に沈む可能性があります。また、可能であれば血管に触れないようにしてください。
    7. 次のステップに備えて、卵の開口部を60mmのシャーレで覆います。
  3. 濃縮ウイルスストックのマイクロインジェクション
    注:形質導入のための標的タンパク質DNA断片を含むウイルス粒子は、水晶体内腔内の細胞に挿入されます。セットアップを 図2Cに示します。詳細については、6、7、8を参照してください。
    1. 氷の上でウイルスストックを解凍します。
    2. 注入中のウイルスストックを可視化するには、10x Fast Green 1 μL を 10 μL のウイルスストックが入ったバイアル 1 本に希釈します。
    3. ガラス製マイクロピペットを詰まらせる可能性のある未溶解物質の大きな塊がないように、溶液を4°C、10,000 × g で10秒間遠心分離し、「大きな塊」をペレット化し、上清を新しいチューブに移し、溶液を氷上に保持します。
    4. 35 mm x 10 mmの培養皿に、延伸した実験用パラフィルムを置き、フィルムの上に1 μLの滅菌生理食塩水(PBS)を加えます(非滅菌で、蓋をした面は「清潔」と見なされます)。
    5. 準備したガラス製マイクロピペットを自動ピコインジェクターに接続します。
    6. 充填モードを押して滅菌生理食塩水(PBS)をガラス製マイクロピペットに 充填 し、 注入モード を使用して割り当てられた1 μLの液体をテストします。
    7. 新しい35 mm × 10 mmの細胞培養皿の表面に2つ目の延伸したラボ用パラフィルムを置き、フィルムの上に1 μLのFast-green染色ウイルスストックを加えます。
    8. マイクロピペットの先端をウイルスストックに下ろし、 フィルモデル を押して、ガラス製マイクロピペットに~1 μLのウイルスストックを充填します。
      注意:乾燥を防ぐため、手順が一時停止するたびに、充填したマイクロピペットの先端を滅菌生理食塩水(PBS)に入れてください。
    9. 自動注射器に接続された充填されたガラス製マイクロピペットを、解剖顕微鏡の助けを借りて胚レンズ内腔の標的領域に下げます。
    10. 光源を調整して、レンズ小胞の輪郭を明確に視覚化します。
      注:右レンズ(上向き)の内腔は通常、注射に使用され、左レンズ(下向き)は反対側のコントロールとしてそのまま維持されます。
    11. マイクロピペットの配置がレンズ内腔内の正しい位置にあることを確認したら、5〜40 nLのウイルスストックを注入します(図3C)。
      注:最適な注射配置には練習が必要です。
    12. ~45秒待ってから、ガラス製マイクロピペットを静かに取り外します。
    13. 解剖顕微鏡を使用して、レンズの空の内腔に漏れなく留まるはずのファストグリーン色素を調べることにより、水晶体内腔へのマイクロインジェクションが成功したことを確認します。
    14. 注入手順の後、卵殻の開口部をセロハンテープで密封します。
    15. 水晶体解剖に必要な胚年齢に達するまで、胚を回転運動なしで37°Cの加湿インキュベーターに戻します。

figure-protocol-3
図3:マイクロインジェクションのニワトリの準備と概略図。 (A)鶏卵の開封。(B)羊膜の切断。(C)ニワトリレンズ内腔マイクロインジェクションの概略図。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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結果

特定の標的タンパク質を決定し、関連する遺伝子配列を同定した後、全体的な実験アプローチでは、アダプターベクターへの最初のクローニング、続いてウイルスベクターへのクローニングにより、遺伝子配列をレトロウイルスRCAS(A)ベクターにクローニングします。次に、パッケージングセルを使用して高力価のウイルス粒子を調製し、ビリオンを回収して濃縮します。これらの最初の2つの主要なステップは、主に説明されており、代表的な結果は他の場所で提示されています6,7,8,14,16。

このプロトコルでは、マイクロインジェクションのステップに重点が置かれています。目的のタンパク質標的のDNA断片を含むRCAS(A)ウイルス粒子の in situ マイクロインジェクショ...

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ディスカッション

この実験モデルは、インタクトレンズに目的のタンパク質を発現させる機会を提供し、レンズの構造と機能におけるこれらのタンパク質の機能的関連性の研究につながります。胚性ニワトリマイクロインジェクションモデルは、Feketeらの研究に部分的に基づいています。al.6 と Jiang et によってさらに開発されました。また、ウイルスプラスミドと、アゴニスト、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチドなどの薬剤をニワトリの水晶体に挿入する手段として利用されています1,9,10,11,12,13。このプラットフォームは、先天性白内障などの水晶体病理学的状態の潜在的な...

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開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金:RO1 EY012085(J.X.J.)およびF32DK134051(F.M.A.)、およびウェルチ財団の助成金:AQ-1507(J.X.J.)の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。フィギュアの一部は Biorender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上m フィルターコーニング431118培地から細胞の破片を除去するため
35 mm x 10 mm 培養皿FisherScientific50-202-030マイクロインジェクション中の使用用
遠心分離機Fisherbrand13-100-676スピンダウン溶液
GENEWIZ-コンストラクトの生成用
解剖顕微鏡AmScopeSM-4TZ-144Aマイクロインジェクション
DNA用レンズPCR プライマーの統合DNA技術-プライマーの生成:

細胞内ループ(IL)-欠失 Cx50 (残基 1–97と149–400)およびCla12NCOベクターは、次のプライマーのペアで得られました:sense、CTCCTGAGAACCTACATCCT;アンチセンス、CACCGCATGCCCAAAGTACAC

Cx43 の IL (残基 98–150)およびCx46(残留物98–166)は 次のプライマーのペアで取得:センス、TACGTGATGAGGAAAGAG;アンチセンス、TCCTCCACGCATCTTTACCTTG;感覚、CACATTGTACGCATGGAAGAG;antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 コンストラクトテンプレートは、次の一対のプライマーで得られました: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC;アンチセンス、GAACAC GTGCGCCAGGTAC

Cx50 の IL (残基 98–148)またはCx46(残基98–166)は、Cla12NCO-Cx50およびCla12NCO-Cx46コンストラクトをテンプレートとして使用し、次のプライマーのペアを使用してクローニングしました。アンチセンス、GGTCCCC TC CAGGCGAAAC;感覚、CACATTGTACGCATGGAAGAG;アンチセンス、AGCACCTCCCATACGGATTC、それぞれ
ドラモンドナノジェクトII自動ナノリットルインジェクタードラモンドサイエンティフィック3-000-204マイクロインジェクションピペット
デュアルグースネックライト顕微鏡イルミネーターAmScopeLED-50WY視覚化のための
照明ダルベッコ'Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenFor cell culture
Egg Holder--Homemade styrofoam rings with 2 inch diameter, and one-half-inch
Egg IncubatorGQF Manufacturing Company Inc.1502受精卵の孵化用
ファストグリーンフィッシャー科学F99-10ウイルスストック注射の視覚化用
受精ホワイトレッグホーンチキン卵テキサスA&M大学N/A動物モデル選択 マイクロインジェクション (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone Laboratories細胞培養
用 フルオレセイン標識抗マウスIgG JacksonImmunoResearch115-095-003抗FLAG用  1:500
鉗子FisherScientific22-327379物を動かすためアイソレーション
ガラスキャピラリーSutter InstrumentsB100-75-10マイクロインジェクション用ガラスマイクロピペット(外径1.0mm、内径0.75mm、長さ10cm)
リポフェクタミンInvitrogenL3000001トランスフェクション用
手動垂直マイクロピペットプーラーSutter InstrumentsP-30正しいサイズのガラスマイクロピペットを入手するには
マイクロ遠心チューブフィッシャーサイエンティフィック02-682-004溶解液
顕微鏡キーエンスBZ-X710パラフィルム染色イメージング用
フィッシャーサイエンティフィック03-448-254溶液を置く
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogen細胞培養用
ピコインジェクターハーバード装置PLI-100デジタル的に設定された時間、ウサギ
の抗ひよこAQP0自己生成-江JX、ホワイトTW、グッドイナフDA、ポールDLの制御圧力を適用することにより、マイクロピペットを介して小さな液体量を正確に供給するために。ひよこレンズファイバーコネキシンの分子クローニングと機能特性評価45.6。Molバイオル細胞。1994年3月;5(3):363-73.土井:10.1091 / mbc.5.3.363。
ウサギ抗FLAG抗体Rockland Immunichemicals600-401-383FLAG
ローダミン標識抗ウサギIgG ジャクソン免疫研究111-295-003抗AQP0  1:500
スポンジクランプパッドサッターインスツルメンツBX10ガラスマイクロピペットの保管用
の可視化 height (英語)

参考文献

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