このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。
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この記事について
サマリー
要約
間葉系間質細胞(MSC)は、再生医療で広く利用されている成体多能性幹細胞です。体細胞組織由来のMSCは、提供が限られていること、品質のばらつきがあること、バイオセーフティーによって制限されているため、過去10年間で、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)からMSCを作製する取り組みが大幅に増加しています。ヒトiPS細胞を間幹細胞に分化させるためのこれまでの取り組みは、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の2つの培養方法が中心でした。このプロトコルでは、iPS細胞からMSCを誘導する際のこれら2つの代表的な方法について説明します。それぞれの方法には、時間、コスト、細胞増殖能、MSCマーカーの発現、 in vitroでの分化能力など、長所と短所があります。このプロトコルは、どちらの方法もiPS細胞から成熟した機能的なMSCを導き出すことができることを示しています。単層法は低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴とし、EB法は時間消費が少ないという特徴があります。
概要
間葉系間質細胞(MSC)は、中胚葉由来の成体多能性幹細胞です1。MSCは、ほとんどすべての結合組織に存在します2。MSCが1970年代に初めて発見され、1987年にFriedensteinらによって骨髄からの単離に成功して以来3,4,5、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪組織、造血支持間質などのさまざまなヒト体細胞組織(胎児および成人を含む)がMSCの単離に使用されてきました1,2,6,7.MSCは、多くの体細胞系統に分化するための高い増殖能力と可塑性を示し、損傷組織や炎症組織に移動する可能性があります2,8,9。これらの特性により、MSCは再生医療の候補となる可能性があります10
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プロトコル
1. iPS細胞のメンテナンス
- iPS細胞の解凍
- 液体窒素から細胞を取り出し、37°Cのウォーターバスで細胞を速やかに融解します。融解細胞を、3 mLのiPS細胞維持培地(材料表)で調製した15 mLのチューブに移します。培地を静かに混ぜます。
- 300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、10 μM Y-27632を含む1 mLのiPS細胞維持培地に細胞を静かに再懸濁します(細胞を上下に2〜3回ピペットで移動させます)。
- 成長因子低減(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレートに細胞懸濁液を移し、10 μM Y-27632をあらかじめ添加したiPS細胞維持培地2 mL(約4 x 104 cells/cm2)に細胞懸濁液を移します。
- 細胞を37°C、5%CO2 で5〜6日間(80%〜90%コンフルエント)培養し、iPS細胞維持培地を毎日交換します。
- ヒトiPS細胞の通過
- iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。iPS細胞をDPBSで一度洗浄します。
- 700〜800μLの0.48 mM EDTA溶液を加え、室温(RT)で1分間インキュベート....
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結果
プロトコール(図1A)に従い、iPS細胞をEB形成法および単層培養法でMSCに分化させました。分化中、細胞は異なる代表的な形態を示しました(図1B、C)。
図1Bに示すように、iPS細胞コロニーは、分化前は典型的なコンパクトな形態を示し、細胞が密集した明確な境界を示しています。iPS細胞が解離し、シェーカー上で24時間培養した後、均一な球状のEBが形成されました。MSC分化培地での培養1日目から7日目にかけて、EBの滑らかなエッジが粗くなり、EBの体積が大きくなりました。8日目から17日目にかけて、EBをGFR細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移した後、EBは徐々にプレートに付着し、多くの接着単層細胞がEBの周囲に広がりました。18日目に細胞のコンフルエント度が90%に達したら、細胞を消化し、ゼラチンでコーティングした培養プレートに播種しました。1.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞をMSCに鑑別する2つの代表的な方法を検討しました20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。どちらの方法も、iPS細胞からMSCを誘導することができました。ヒトiPS細胞由来のMSCは、細胞形態(図1)、表面抗原(図2<.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
過去と現在のMao and Hu Labのすべてのメンバーに、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献に心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 Lidan Hu へ)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アリザリンレッド染色キット | Beyotime バイオテクノロジー | C0148S | |
| 反ヒト-CD105 (PE) | バイオレジェンド | 323206 | |
| 抗ヒト-CD34 (FITC) | バイオレジェンド | 343503 | |
| 反ヒト-CD45 (APC) | バイオレジェンド | 304011 | |
| 反ヒト-CD73 (APC) | バイオレジェンド | 344006 | |
| 反ヒト-CD90 (FITC) | バイオレジェンド | 328108 | |
| アスコルビン酸 | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| 二酸化炭素レベルシェーカー | クリスタル | CO-06UC6 | |
| 補償ビーズ | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL技術 | 07959 | |
| デキサメタゾン | Beyotime バイオテクノロジー | ST1254 | |
| DMEM/F12 中 | Servicebio | G4610 | |
| ウシ胎児血清 | 博多 | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | 幹細胞 | 78003.1 | |
| ゼラチン | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| ヒト IgG1 アイソタイプコントロール APC | BioLegend | 403505 | |
| ヒト IgG1 アイソタイプコントロール FITC | BioLegend | 403507 | |
| ヒト IgG1 アイソタイプコントロール PE | BioLegend | 403503 | |
| ヒト TGF-&β;1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | バイオレジェンド | 422301 | |
| IBMX | Beyotime | バイオテクノロジーST1398 | |
| インドメタシン | Solarbio | SI9020 | |
| インスリン | Beyotime バイオテクノロジー | P3376 | |
| iPSC メンテナンス培地 | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS 培地サプリメント | Beyotime バイオテクノロジー | C0341-10mL | |
| マトリゲル、成長因子低減 | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O 染色キット | Beyotime | バイオテクノロジーC0158S | |
| プロリン | Solarbio | P0011 | |
| ビン酸ナトリウム | サーモフィ | ッシャー11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| トルイジンブルー染色キット | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| 超低アタッチメント 6 ウェルプレート | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| &-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| &-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
参考文献
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....
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