方法論記事

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

DOI：

10.3791/65729

⸱

2023年10月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

間葉系間質細胞(MSC)は、再生医療で広く利用されている成体多能性幹細胞です。体細胞組織由来のMSCは、提供が限られていること、品質のばらつきがあること、バイオセーフティーによって制限されているため、過去10年間で、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)からMSCを作製する取り組みが大幅に増加しています。ヒトiPS細胞を間幹細胞に分化させるためのこれまでの取り組みは、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の2つの培養方法が中心でした。このプロトコルでは、iPS細胞からMSCを誘導する際のこれら2つの代表的な方法について説明します。それぞれの方法には、時間、コスト、細胞増殖能、MSCマーカーの発現、 in vitroでの分化能力など、長所と短所があります。このプロトコルは、どちらの方法もiPS細胞から成熟した機能的なMSCを導き出すことができることを示しています。単層法は低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴とし、EB法は時間消費が少ないという特徴があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

間葉系間質細胞(MSC)は、中胚葉由来の成体多能性幹細胞です1。MSCは、ほとんどすべての結合組織に存在します2。MSCが1970年代に初めて発見され、1987年にFriedensteinらによって骨髄からの単離に成功して以来3,4,5、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪組織、造血支持間質などのさまざまなヒト体細胞組織(胎児および成人を含む)がMSCの単離に使用されてきました1,2,6,7.MSCは、多くの体細胞系統に分化するための高い増殖能力と可塑性を示し、損傷組織や炎症組織に移動する可能性があります2,8,9。これらの特性により、MSCは再生医療の候補となる可能性があります10。しかし、体細胞組織由来MSC(st-MSC)は、提供が限られていること、細胞増殖能力が限られていること、品質のばらつき、およびドナーからの病原体の伝播の可能性に対するバイオセーフティー上の懸念によって制限されている11,12。

ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、胚性幹細胞と同様の機能を持つ転写因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)でリプログラミングした成体細胞に由来します13,14。iPS細胞は、ST-MSCと比較して、供給量が無制限で、低コスト、高純度、品質管理の利便性、スケール生産や遺伝子改変が容易であるという利点があります15,16,17。

iPS細胞-MSCのこれらの利点により、iPS細胞からMSCを駆動する方法がいろいろと報告されています。これらの分化法は、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の使用という2つの培養方法論を中心としています11,18,19,20。本明細書では、2つの方法論のそれぞれに対する代表的なアプローチを特徴づけた。さらに、時間、コスト、増殖能、MSCバイオマーカーの発現、およびin vitroでの分化能力に基づく2つの代表的なアプローチの比較もアクセスしました。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. iPS細胞のメンテナンス

  1. iPS細胞の解凍
    1. 液体窒素から細胞を取り出し、37°Cのウォーターバスで細胞を速やかに融解します。融解細胞を、3 mLのiPS細胞維持培地(材料表)で調製した15 mLのチューブに移します。培地を静かに混ぜます。
    2. 300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、10 μM Y-27632を含む1 mLのiPS細胞維持培地に細胞を静かに再懸濁します(細胞を上下に2〜3回ピペットで移動させます)。
    3. 成長因子低減(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレートに細胞懸濁液を移し、10 μM Y-27632をあらかじめ添加したiPS細胞維持培地2 mL(約4 x 104 cells/cm2)に細胞懸濁液を移します。
    4. 細胞を37°C、5%CO2 で5〜6日間(80%〜90%コンフルエント)培養し、iPS細胞維持培地を毎日交換します。
  2. ヒトiPS細胞の通過
    1. iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。iPS細胞をDPBSで一度洗浄します。
    2. 700〜800μLの0.48 mM EDTA溶液を加え、室温(RT)で1分間インキュベートした後、分解溶液を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
    3. 細胞がシート状に消化されたら(細胞を単一細胞に消化しない)、10 μM Y-27632を含むiPS細胞維持培地1 mLを加えて消化を終了します。細胞を慎重に上下に2〜3回ピペットで移動させます。
    4. 細胞懸濁液を、成長因子低減(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)と10 μM Y-27632をあらかじめ添加したiPS細胞維持培地2 mLでコーティングした6ウェル組織培養プレートに移します。
      注:継代比は1:6〜1:20(約4×104 細胞/cm2)の範囲で、平均凝集サイズは約50〜200μmである。
    5. 37°Cで80%〜90%のコンフルエント(5〜6日)まで細胞を培養し、iPS細胞の維持培地を毎日 交換します。

2. EB形成による間葉系幹細胞とiPS細胞の分化

注:この方法は、以前の文献21、22、23、24から導出されたものである。この方法の概要を 図1に示します。この方法の特徴を 表1にまとめた。

  1. 培地の調製
    1. α-MEMに1%(v/v)のGlutaMAX、10%(v/v)のFBS、10 ng/mLのFGF2、および5 ng/mLのTGFβを添加して、MSC分化培地を調製します。
    2. α-MEMに1%(v/v)のGlutMAX、10%(v/v)のFBS、および1 ng/mLのFGF2を添加して、MSC維持培地を調製します。
  2. iPS細胞の作製
    1. 成長因子還元(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレート上のiPS細胞維持培地中で、37°C、5%CO2 で80%〜90%のコンフルエントになるまで培養hiPS細胞ライン(融解後少なくとも2〜3回継代)。
  3. 0日目:EB形成
    1. iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。iPS細胞をDPBSで一度洗浄します。
    2. 700〜800 μLの0.48 mM EDTA溶液を加え、室温で1分間インキュベートした後、消化溶液を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
    3. 細胞がシート状に消化されたら(細胞を単一細胞に消化しないでください)、iPS細胞維持培地(10 μMのRock阻害剤と1:100のGFR-細胞外マトリックスゲルを含む)2 mLを添加して消化を終了します。
    4. 細胞を6ウェル低接着プレートに移します。組織培養プレートの2ウェルと低接着プレートのウェル1ウェルの比率で細胞を播種します。細胞をシェーカー(60 rpm/min)で37°C、5% CO2 で24時間インキュベートし、球状のEBを形成します。
  4. 1日目-7日目:EBの分化
    1. EBをパスツールピペットで遠心分離管に移し(EBを破壊せずに)、室温でEBを5〜10分間自然に沈殿させます。次に、上澄み液を取り除きます。
    2. EB を 2 mL の MSC 分化培地を含む 6 ウェル低アタッチメントプレートに移します。EBをシェーカーで37°C、5%CO2 で7日間培養し、培地を1回交換します。
  5. 8日目-17日目:EB接種
    1. EBをパスツールピペットで遠心チューブに移し(EBを破壊せずに)、EBを5〜10分間自然に沈殿させます。次に、上澄み液を取り除きます。
    2. EBを、2 mLのMSC維持培地を含むGFR細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移します。細胞接着後、定期的な培地交換で90%のコンフルエント(~10日)まで培養します。
  6. 18日目-27日目:MSCの成熟と拡大
    1. EB由来の培養物を37°Cの解離溶液で5〜10分間処理します(消化時間は細胞の種類によって異なります)。
    2. 細胞の一部が単一細胞に消化されたら、MSC維持培地2 mLを添加して消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。残った未消化細胞をDPBSで一旦洗浄し、再度消化します。すべての細胞が単一の細胞に消化されるまで、数回繰り返します。細胞懸濁液を250 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
    3. ゼラチンでコーティングした培養プレート(約2×105 細胞/cm2)に細胞を播種します。培地を定期的に交換するMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養します。この時点で、この世代のセルを継代0(P0)として指定します。
    4. MSCを純粋で成熟させるために、約6日間で1:3の分割比で細胞を2回継代し続けます。ほとんどの細胞は線維芽細胞様の形態(紡錘形)を示します。

3. 単層培養による間葉系幹細胞とiPS細胞の分化

注:この方法は、以前の文献25、26、27、28から導出されたものである。この方法の概要を 図1に示します。この方法の特徴を 表1にまとめた。

  1. 培地の調製
    1. α-MEMに1%(v/v)のGlutMAX、10%(v/v)のFBS、および1 ng/mLのFGF2を添加して、MSC維持培地を調製します。
  2. iPS細胞の作製
    1. 成長因子還元(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレート上のiPS細胞維持培地中で、50%〜60%のコンフルエントになるまで50%〜60%の濃度になるまで培養 hiPS細胞ライン(融解後少なくとも2〜3回継代)。
  3. 0日目-13日目:直接単層培養による分化
    1. iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。
    2. MSC維持培地2 mLを直接添加し、培地を毎日交換しながら、37°C、5%CO2 で14日間培養します。
  4. 14日目-35日目:反復継代によるMSCの成熟
    1. 単層培養物を37°Cの解離溶液で5〜10分間処理します(消化時間は細胞の種類によって異なります)。
    2. 細胞が単一細胞に消化されたら、2 mLのMSC維持培地を添加して消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。残った未消化細胞をDPBSで一旦洗浄し、再度消化します。すべての細胞が単一の細胞に消化されるまで、数回繰り返します。細胞懸濁液を250 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
    3. ゼラチンでコーティングした培養皿(約2 x 105 cells/cm2)に細胞を播種します。培地とMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養し、定期的に交換します。この時点で、この世代のセルを継代0(P0)として指定します。
    4. MSCを純粋で成熟させるために、約18日間に1:3の分割比で細胞を6回継代し続けます。ほとんどの細胞は線維芽細胞様の形態(紡錘形)を示します。

4. フローサイトメトリーによるヒト-PS細胞増殖幹細胞の表面抗原解析

注:骨髄由来MSCの表面抗原と同様に、iPS細胞を駆動するMSCはCD105、CD73、CD90を発現するが、CD45、CD34は発現しない29。また、ヒトiPS細胞はネガティブコントロール細胞としても利用することができます。フローサイトメトリーによるヒトiPS細胞駆動型幹細胞およびiPS細胞の表面抗原解析を 図2に示します。

  1. iPS細胞駆動型MSCを解離液で37°Cで2〜3分間処理します。ヒトiPS細胞を0.48 mM EDTA解離試薬で処理し、室温で1分間インキュベートした後、解離試薬を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
  2. 細胞が単一細胞に消化されたら、培地(MSCにはMSC維持培地、iPS細胞にはiPS細胞維持培地)を加えて消化を終了します。
  3. 細胞懸濁液を350 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  4. 細胞を冷たいDPBSで一度洗浄し、350 x g で5分間遠心分離した後、上清を除去します。
  5. 細胞をカウントし、10 x 106 cells/mL の冷たい 10% FBS-DPBS (v/v) 溶液に再懸濁し、100 μL/チューブの細胞懸濁液 (1 x 106 cells/tube) を 1.5 mL 遠心チューブに分配します。
  6. 100 μLの細胞懸濁液に5 μLのヒトFc受容体遮断溶液を加えます。室温で5〜10分間インキュベートして、非特異的ブロッキングを実行します。
  7. 350 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液で2回洗浄します。
  8. 細胞を100μLの2%FBS-DPBS(v/v)溶液に再懸濁します。
  9. 100 μLの細胞に5 μL(1試験)の抗CD34-FITCおよび5 μL(1試験)の抗CD45-APCを加えます
    停止。抗CD73-APC5 μL(1試験)、抗CD90-FITC5 μL(1試験)、抗CD105-PE5 μL(1試験)を別の100 μL細胞懸濁チューブに加えます。5 μL のヒト IgG1 アイソタイプコントロール FITC、ヒト IgG1 アイソタイプコントロール PE、およびヒト IgG1 アイソタイプコントロール APC を 3 本目の 100 μL 細胞懸濁チューブに加えます。暗闇の中で氷の上で15〜20分間インキュベートします。その間に、単一染色ビーズを準備します。
  10. 細胞を冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液で2回洗浄します。
  11. 300 μLの冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液を加えて細胞を再懸濁し、200メッシュスクリーンフィルターでろ過します。
  12. フローサイトメトリーを用いてサンプルを解析します。アイソタイプコントロール抗体で染色した細胞懸濁液を分析し、ゲートを設定します。次に、標的抗体で染色した細胞懸濁液を分析します。

5. ヒトリヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞の骨形成分化

注:ヒトiPS細胞を駆動するMSCは、骨形成分化能を有する(図3A、B)。骨形成分化のプロトコルは以下に示されています。

  1. α-MEMに10%FBS、100 nMデキサメタゾン、10 mMベータ-グリセロリン酸、および100 μMアスコルビン酸を添加して、骨形成誘導培地を調製します。
  2. 1 x 105 MSCをゼラチンでコーティングした48ウェルプレートに播種し、60%〜70%のコンフルエントになるまで培養します。
  3. 培地を除去し、0.3 mLの骨形成誘導培地を添加します。細胞を骨形成誘導培地中で37°C、5%CO 2で14日間培養し、 培地を3日ごとに交換します。
  4. 培地を取り出し、一度DPBSで洗浄してください。
  5. 0.3 mL の 4% PFA を加え、室温で 30 分間インキュベートします。
  6. PFA を除去します。細胞を0.3 mLのDPBSで10分間室温で洗浄し、3回繰り返します。
  7. DPBSを除去し、0.2 mLのアリザリンレッド染色溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。
  8. 染色液を除去し、0.3 mL DPBSで細胞を室温で10分間リンスし、3回繰り返します。
  9. カルシウム沈着の染色を光学顕微鏡で観察します。

6. ヒトiPS細胞駆動型幹細胞の脂肪分化

注:ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞は、脂肪分化能を持っています(図3C、D)。脂肪形成の微分のためのプロトコルは次与えられる。

  1. α-MEMに10%FBS、1 μMデキサメタゾン、1μMのIBMX、10 μg/mLのインスリン、および100 μMのインドメタシンを添加して、脂肪誘発培地を調製します。α-MEMに10%FBSおよび10μg/mLのインスリンを添加することにより、脂肪形成維持培地を調製します。
  2. 1 x 105 MSCをゼラチンでコーティングした48ウェルプレートに播種し、細胞密度が90%に達するまで培養します。
  3. 培地を取り除き、0.3 mLの脂肪誘発培地を加えます。細胞を脂肪誘導培地中で37°C、5%CO2で4日間培養し続けます。
  4. 培地を除去し、0.3 mLの脂肪形成維持培地を添加します。細胞を脂肪形成維持培地中で37°C、5%CO2で3日間培養し続けます。
  5. 脂肪細胞の分化と成熟まで、手順6.3と6.4を2〜3回繰り返します。
  6. 培地を取り出し、一度DPBSで洗浄してください。
  7. 0.3 mL の 4% PFA を加え、室温で 10 分間インキュベートします。PFAを除去し、DPBSで2回すすぎます。
  8. メーカーの指示に従ってOli Red O染色剤を塗布し、光学顕微鏡で脂質滴を観察します。

7. ヒトiPS細胞を駆動する間葉細胞の軟骨分化

注:ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞は、軟骨形成分化能を有する(図3E、F)。軟骨形成分化のプロトコールは以下に示す。

  1. α-MEMに10%FBS、100 nMデキサメタゾン、1%インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、10 μMアスコルビン酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 μg/mLプロリン、0.02 nMトランスフォーミング成長因子β3(TGFβ3)、および0.5 μg/mL骨形成タンパク質6(BMP-6)を添加して軟骨芽細胞誘導培地を調製します。
  2. 2.5 x 105 iPS細胞駆動型MSCを採取し、150 x g で5分間遠心分離した後、上清を除去します。細胞を1 mLのα-MEMに懸濁し、150 x g で5分間遠心分離します。
  3. 上清を除去し、細胞を0.5 mLの軟骨形成誘導培地に懸濁します。細胞を150 x g で5分間遠心分離します。
  4. 蓋を直接緩め、軟骨誘発培地を3日ごとに37°C、5%CO2で21日間培養します。遠心分離管を静かにはじいて、軟骨分化中は毎日軟骨形成ペレットを(軟骨形成ペレットを破壊することなく)懸濁させます。
  5. 上清を取り除き、0.5 mLのPBSで2回洗浄します。
  6. 0.3 mL の 4% PFA を加え、24 時間固定します。
  7. パラフィンは軟骨形成ペレットを包埋し、それらを切片化します(3 μm)。切片をトルイジンブルー(1%)で30分間染色します。
  8. 細胞外軟骨細胞マトリックスを光学顕微鏡で観察します。

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結果

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プロトコール(図1A)に従い、iPS細胞をEB形成法および単層培養法でMSCに分化させました。分化中、細胞は異なる代表的な形態を示しました(図1B、C)。

図1Bに示すように、iPS細胞コロニーは、分化前は典型的なコンパクトな形態を示し、細胞が密集した明確な境界を示しています。iPS細胞が解離し、シェーカー上で24時間培養した後、均一な球状のEBが形成されました。MSC分化培地での培養1日目から7日目にかけて、EBの滑らかなエッジが粗くなり、EBの体積が大きくなりました。8日目から17日目にかけて、EBをGFR細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移した後、EBは徐々にプレートに付着し、多くの接着単層細胞がEBの周囲に広がりました。18日目に細胞のコンフルエント度が90%に達したら、細胞を消化し、ゼラチンでコーティングした培養プレートに播種しました。1...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ヒトiPS細胞をMSCに鑑別する2つの代表的な方法を検討しました20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。どちらの方法も、iPS細胞からMSCを誘導することができました。ヒトiPS細胞由来のMSCは、細胞形態(図1)、表面抗原(図2<...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去と現在のMao and Hu Labのすべてのメンバーに、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献に心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 Lidan Hu へ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アリザリンレッド染色キットBeyotime バイオテクノロジーC0148S
反ヒト-CD105 (PE)バイオレジェンド323206
抗ヒト-CD34 (FITC)バイオレジェンド343503
反ヒト-CD45 (APC)バイオレジェンド304011
反ヒト-CD73 (APC)バイオレジェンド344006
反ヒト-CD90 (FITC)バイオレジェンド328108
アスコルビン酸SolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
二酸化炭素レベルシェーカークリスタルCO-06UC6
補償ビーズBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL技術07959
デキサメタゾンBeyotime バイオテクノロジーST1254
DMEM/F12  中ServicebioG4610
ウシ胎児血清博多HS-FBS-500
FGF2幹細胞78003.1
ゼラチンSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
ヒト IgG1 アイソタイプコントロール APCBioLegend403505
ヒト IgG1 アイソタイプコントロール FITCBioLegend403507
ヒト IgG1 アイソタイプコントロール PEBioLegend403503
ヒト TGF-&β;1Stemcell78067
Human TruStain FcX バイオレジェンド422301
IBMXBeyotime バイオテクノロジーST1398
インドメタシンSolarbioSI9020
インスリンBeyotime バイオテクノロジーP3376
iPSC メンテナンス培地STEMCELL Technology85850
ITS 培地サプリメントBeyotime バイオテクノロジーC0341-10mL
マトリゲル、成長因子低減BD Corning354230
Oli Red O 染色キットBeyotime バイオテクノロジーC0158S
プロリンSolarbioP0011
ビン酸ナトリウムサーモフィッシャー11360-070
TGFβ3NovoproteinCJ44
トルイジンブルー染色キットSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
超低アタッチメント 6 ウェルプレートCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
&-MEMHycloneSH30265
&-glycerophosphateSolarbioG8100
ピル

参考文献

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