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方法論記事

遺伝子改変マウスモデルにおける悪性末梢神経鞘腫瘍の同定、診断、および悪性度判定

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DOI:

10.3791/65740

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2024年5月17日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

この記事について

サマリー

私たちは、遺伝子改変マウスの神経系新生物がヒトの病理を正確に再現しているかどうかを評価するための方法論を開発しました。本研究では、これらの組織学的手法、定義された病理学的基準、および培養方法論を、P 0-GGFβ3マウスモデルで発生する神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍に適用します。

要約

常染色体優性腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者は、一般的に叢状神経線維腫(PN)を発症し、その後、非常に侵攻性の高い悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化します。PNがMPNSTに変化するプロセスを理解することは、NF1のヒトで見られるPN-MPNSTの進行を正確に再現する遺伝子改変マウス(GEM)モデルの利用可能性によって容易になります。残念ながら、Nf1アブレーションを用いたGEMモデルでは、このプロセスを完全に再現することはできません。そこで、シュワン細胞でシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)を過剰発現させることでPNを発現させ、高頻度でMPNSTに進行するGEMモデルであるP 0-GGFβ3マウスを開発しました。しかし、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成と腫瘍性進行がNF1患者に見られるプロセスを正確にモデル化しているかどうかを判断するには、まず、P0-GGFβ3末梢神経鞘腫瘍の病理がヒトの病理を再現していることを証明する必要がありました。

ここでは、P 0-GGFβ3およびP0-GGFβ3を使用して、GEMモデルで末梢神経系新生物を正確に診断および等級付けするために使用される特殊な方法論について説明します。例としてTrp53+/-マウス。PNおよびMPNSTの診断に使用される組織学的、免疫組織化学的、および組織化学的方法、これらの新生物をそれらの病理学を模倣する他の腫瘍型と区別する方法、およびこれらの新生物を等級付けする方法について説明します。本稿では、GEM MPNSTからの早期継代培養の確立、免疫細胞化学を用いたこれらの培養物の特性評価方法、および同種移植片の確立による腫瘍原性の検証方法について議論する。総じて、これらの技術は、GEMモデルで発生するPNおよびMPNSの病理を特徴付け、これらのマウス腫瘍の病理をヒトの病理学と批判的に比較します。

概要

過去30年間にわたり、多くの研究室が、ヒトのがん関連変異をマウスゲノムに導入したり、ヒトのがんに過剰発現している遺伝子産物を過剰発現させたりすることで、ヒトがんのマウスモデルの作成を試みてきました。得られた遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、新たに導入されたゲノム改変が腫瘍形成を開始することの確立、腫瘍の進行に寄与する他のその後に発生する遺伝的またはエピジェネティックな変化の同定、腫瘍の開始と進行を促進する主要なシグナル伝達経路の定義など、さまざまな目的に使用できます。免疫不全マウスの使用に依存する同所異種移植モデルとは異なり、GEMがんモデルは完全に機能する免疫系を持っているため、候補となる治療薬に対する反応をより正確にモデル化できます。しかし、このような目的でGEMがんモデルを使用する場合、研究者はGEM新生物で行われた観察がヒトの対応物に関連していることを確認することが不可欠です。この検証には、GEM新生物の病理学の徹底的な評価と、GEM新生物の病理学的特徴が対応するヒト腫瘍型の病理学を再現しているかどうかの決定を含める必要があります。

腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)は、人間の神経系に影響を与える最も一般的な遺伝性疾患であり、3,000〜3,500人の出生ごとに約1人で発生します1,2,3。NF1に罹患した個人は、皮膚(皮膚神経線維腫)および大きな神経および神経叢(網状神経線維腫)に神経線維腫として知られる複数の良性末梢神経鞘腫瘍を発症します。皮膚神経線維腫と叢状神経線維腫はどちらも身体的、行動的、および/または社会的障害を引き起こすことにより患者の生活の質を悪化させますが、叢状神経線維腫(PN)は特に危険です4,5。これは、PNが悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化することが多いためであり、これは生存率が非常に低い侵攻性の紡錘細胞腫瘍である1,2。この生存率の低さは、MPNSTの治療に現在使用されている放射線療法および化学療法レジメンが効果がないことが主な原因です。しかし、より効果的な新しい治療法の開発は困難でした。これは、MPNSTがNF1患者にどれほど一般的に発生するかにもかかわらず、MPNSTは依然としてまれな新生物であるためです。その結果、研究のために多数のヒト腫瘍を入手することは非常に困難です。また、臨床試験のために十分な数のMPNST患者を募集することも困難です。これらの限界を克服するために、神経線維腫の病因とPN-MPNSTの進行を促進する異常に関するさらなる洞察を得て、候補となる治療薬の前臨床試験を促進することを目的として、いくつかのGEMモデルが作成されました。

NF1患者は、NF1遺伝子の1つのコピーに不活性化変異を有する。神経線維腫の病因は、シュワン細胞系統の細胞に残りの機能的NF1遺伝子の不活性化変異が発生したときに引き起こされます。しかし、驚くべきことに、生殖細胞不活性化Nf1変異を持つマウスを作製したところ、神経線維腫は発症しなかった6,7。その後の実証では、Nf1-nullシュワン細胞と他のすべての細胞型におけるNf1ハプロ不全を有するマウス(Krox20-Cre;Nf1flox/-マウス)は、神経線維腫の病因には、他の細胞型におけるNf1遺伝子の投与量の減少が必要であることを示唆している8。それでも、Krox20-Creの叢状神経線維腫;Nf1flox/-マウスはMPNSTに進化しなかったため、ヒトの生態を部分的に模倣したに過ぎない。MPNSTの病因は、Nf1変異がTrp539やCdkn2a10などの追加の腫瘍抑制遺伝子の変異と組み合わされたときに起こったが、これらのGEMモデルにおけるMPNSTは、既存の良性叢状神経線維腫からではなく、de novoまたは生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBP)から発症した11,12(13,14参照)これらのモデルや、Suz12やPten15などの遺伝子にMPNST関連の機能喪失変異を追加導入した他のモデルの優れたレビュー。

これらのマウスモデルは、NF1、TP53、CDKN2Aなどの遺伝子がNF1関連末梢神経系新生物の病因に果たす役割を確立し、治療薬候補を試験する前臨床試験に非常に貴重です。しかし、叢状神経線維腫が進行して、生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBPs16)になり、次にMPNSTになるプロセスについては、まだ完全には理解されていません。最近では、Nf1とArfに欠失したマウスがANNUBPを発達させ、それがMPNSTに進行するという報告があり、このプロセスの理解が進んでいます11。しかし、ヒトに見られる網状神経線維腫-MPNSTの進行過程を完全に再現したNf1変異ベースのマウスモデルはまだ存在しません。さらに、MPNSTの発症につながる複数の異なる経路があるかどうかは明らかではありません。このことを考えると、上記のGEMは、神経線維腫-MPNSTの進行およびMPNSTの病因につながるいくつかの異なる経路のサブセットのみをモデル化している可能性があります。この点は、MPNSTも散発的に発生し、一部の散発的なMPNSTは明らかにNF1変異を有さないという事実によって強調されている17,18。

この後者の点は、 NF1 変異を欠く少なくともいくつかの散発性MPNSTが黒色腫または別のタイプの肉腫であるというMagollon-Lorenzらの最近の提案によって異議を唱えられてきましたが19、私たちは最近、散発性MPNSTと、この腫瘍に由来する細胞株(2XSB細胞)が NF1 野生型であることを報告しました20.親腫瘍および2XSB細胞株の特性評価において、散発性悪性末梢神経鞘腫瘍の鑑別診断で日常的に考慮される黒色腫および他の複数の肉腫型を含む代替診断の可能性を系統的に除外した20。さらに、Magollon-Lorenzらは、彼らが研究した3つの散発性MPNST細胞株における彼らの知見は、散発性MPNSTとして同定されたすべての腫瘍がMPNSTではないことを示すために一般化できないことを認めたことに留意する。

神経線維腫とMPNSTの病因が必ずしも特定の腫瘍抑制遺伝子変異に依存しないGEMモデルを構築するために、強力なシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)の過剰発現がシュワン細胞特異的ミエリンタンパク質ゼロ(P0)プロモーター(P 0-GGFβ3マウス)によって駆動されたトランスジェニックマウスを作製した21.我々は以前に、ヒト神経線維腫、MPNST、およびMPNST細胞株が、NRG1シグナル伝達を媒介するerbB受容体チロシンキナーゼ(erbB2、erbB3、およびerbB4)とともにいくつかのNRG1アイソフォームを発現し、これらのerbB受容体が恒常的に活性化されることを示しました22。また、erbBキナーゼの薬理学的阻害剤がMPNSTの増殖22、生存23、遊走24を強力に阻害することも実証した。ヒトでの観察結果と同様に、P 0-GGFβ3マウスは叢状神経線維腫を発症し25、高頻度でMPNSTに進行する21,25。我々は、P 0-GGFβ3 MPNST、ヒトのMPNST、Trp53およびCdkn2aの変異、および腫瘍形成に寄与する可能性のある他の多くのゲノム異常を一般的に発症することを示しました25。P 0-GGFβ3マウスに生じるMPNSTは、不活性化Nf1変異を有しない。しかし、遺伝的相補性を用いて、NRG1は、主にNf1の欠損によって変化したのと同じシグナル伝達カスケードを介して、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成を促進することを示した26。この結論は、Trp53ハプロ不全(P 0-GGFβ3;Trp53+/-マウス)は、シス-Nf1+/-に見られるように、MPNSTがde novoを発症する動物を産生する。Trp53+/-マウス27。

P 0-GGFβ3マウスがNF1のヒトに見られる神経線維腫の病因および神経線維腫-MPNST進行のプロセスを正確にモデル化することを実証するこの情報およびその他の情報を得るために、これらの動物の組織を処理し、それらの腫瘍を正確に診断し、これらのマウスで発生するMPNSTを等級付けし、早期継代P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3を確立して特徴付けるための専門的な方法論を開発しました。Trp53+/- MPNST培養、およびP 0-GGFβ3 PNおよびMPNST、およびP0-GGFβ3の病理学を批判的に比較する。Trp53+/- MPNSTをヒトのMPNSTと比較します。これらの方法論の多くは、神経系腫瘍の他のGEMモデルに一般化可能である。さらに、これらの方法論のいくつかは、新生物が他の臓器部位に発生するGEMモデルにより広く適用できます。したがって、ここではこれらの方法論の詳細な説明を提示します。

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プロトコル

ここで説明する手順は、サウスカロライナ医科大学のIACUCによって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドおよびMUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切な訓練を受けた担当者によって実施されました。

1. P 0-GGFβ3マウスにおける腫瘍の浸透度と生存率の決定、およびさらなる特性評価のためのこれらの動物の腫瘍の同定

  1. 腫瘍形成について評価されるマウスのコホートを生成します。必要なマウスの数は、腫瘍表現型の浸透度によって異なります。このような損失を補うには、望ましい最終動物数よりも10〜15%多いコホートから始めます。
    注:我々は、50匹のマウス(うち6匹は腫瘍とは無関係な理由(例えば、闘争)のために失われた)の初期コホートにおいて、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍浸透度を経験的に決定した25。
  2. 動物の健康状態を週3回評価し、各検査での体重や行動の変化などの体調スコアを記録します。担がんマウスまたは瀕死のマウス(下記注参照)を二酸化炭素安楽死とそれに続く子宮頸部脱臼で終わらせる。死亡時の年齢を日数で記録します。腫瘍が外部から見える場合は、腫瘍の寸法(長さ、幅、高さ)を記録します。
    注:動物は、IACUCが承認した最大許容腫瘍サイズおよび/または人道的エンドポイントを超えて進行することを許可されないことが不可欠です。
  3. 死亡時年齢を使用して、Kaplan-Meier生存曲線を確立し、平均死亡年齢と生存範囲を決定します。
    注:P 0-GGFβ3マウスの平均死亡年齢は261.5日で、範囲は74〜533日でした。コホートの91%が多発性神経線維腫を有し、71%がMPNSTを有していた21。
  4. 肉眼的に見える腫瘍が存在するかどうかを判断し、存在する場合は、無菌条件下でそれらを解剖して、腫瘍が末梢神経に関連しているかどうかを確認し、腫瘍を切除します。P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3;Trp53+/-マウスの末梢神経鞘腫瘍は、三叉神経および坐骨神経に最も多くみられる。肉眼的に目に見える腫瘍がこれらの神経に関連して見られない場合でも、以下に説明するようにこれらの神経を固定して包埋し、微小腫瘍の存在を調べることができるようにします。微小腫瘍は通常、これらの神経に関連する神経節内に発生します。
  5. 肉眼的に見える腫瘍を3つに切ります(図1A)。ピース1は、組織学(パラフィン切片、免疫組織化学、および組織化学)に使用します。ピース2を使用して、早期継代培養を確立します。将来の実験(イムノブロット、RNAおよびDNA単離など)のためのスナップフリーズピース3(液体窒素を使用)。
  6. 4%パラホルムアルデヒドの4%パラホルムアルデヒドを4 °Cで一晩固定し、4%パラホルムアルデヒドに4°Cで一晩浸して動物の体の残りの部分を固定します。

2.肉眼的に見える腫瘍のパラフィン包埋と初期診断評価のためのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の調製

  1. 肉眼的に見える腫瘍のパラフィン包埋
    1. 腫瘍片1を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、組織の体積の少なくとも10倍の量のPBSに15分間入れて組織をすすぎます。後続のすべてのすすぎに同じ量を使用してください。すすぎごとに新しい量のPBSを使用して、さらに2回の15分間のPBSリンスを繰り返します。
    2. 腫瘍片1を70%エタノールに移します。組織を70%エタノールに浸けて、4°Cで24時間保持します。 必要に応じて、これらの条件下で組織を長期間保存します。
      注: ステップ 2.1.1 から 2.1.7 は、市販の組織処理機にアクセスできない調査員の利益のために提供されています。治験責任医師が組織処理業者にアクセスできる場合、組織は、プログラムされた機器プロトコルに従って段階付けされたエタノールとキシレンを介して処理されます。
    3. 腫瘍片1を80%エタノールに移し、室温で30分間加熱する。80%エタノールの新鮮な容量でさらに30分間インキュベーションを繰り返します。
    4. 腫瘍片1を95%エタノールに移し、室温で75分間加熱する。インキュベーションをさらに2回繰り返し、毎回、95%エタノールの新鮮な容量でさらに75分間行います。
    5. 腫瘍片1を100%エタノールに移し、室温で60分間インキュベートします。60分間のインキュベーションをさらに2回繰り返し、そのたびに新鮮な容量の100%エタノールを使用します。
    6. 腫瘍片1をd-リモネン系溶媒に移し、室温で30〜60分間インキュベートします。腫瘍片1を新しい容量のd-リモネンベースの溶媒に移し、室温でさらに30〜60分間インキュベートします。
    7. 腫瘍片 1 を 1:1 パラフィン/d-リモネン系溶媒に 60 °C で 1 時間移し、1:1 パラフィン/d-リモネン系溶媒を廃棄し、腫瘍片 1 を 60 °C パラフィンに移し、60 °C で20 分間インキュベートします。腫瘍片1をパラフィン中で60°Cで一晩インキュベートします。
    8. パラフィンのベース層を鋼の組織型に注ぎ、固化させます。腫瘍片1を塩基性パラフィンの表面に転写し、位置決め直後に、組織を60 °Cパラフィンで覆い、組織カセットを溶融パラフィンの上に置き、溶融パラフィンと接触させる。金型を埋め込みステーションの低温側に移し、10〜15分間固化させます。
    9. 付属のティッシュカセットが入ったパラフィンブロックを型から取り出します。切片作成中に、付属の組織カセットを使用してブロックをミクロトームにクランプします。
      注:パラフィンブロックは、室温で無期限に保存できるようになりました。
  2. 肉眼的に見える腫瘍のヘマトキシリンとエオシンで染色された切片を準備します。
    1. ミクロトームを使用して腫瘍組織の4〜5μmの切片を切断し、正電荷を帯びたスライドガラスに取り付けます。
    2. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行うには、スライドをd-リモネンベースの溶媒中で室温で10分間インキュベートして、組織切片を脱パラフィンします。新鮮な量のd-リモネンベースの溶媒中で10分間インキュベーションを繰り返します。
    3. スライドを100%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。スライドを100%エタノールの新鮮な容量に移し、室温でさらに5分間インキュベートします。
    4. スライドを95%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。スライドを新鮮な容量の95%エタノールに移し、室温でさらに5分間インキュベートします。
    5. スライドを70%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。その後、50%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。
    6. スライドを蒸留水に移し、室温で5分間インキュベートします。
    7. スライドを室温でヘマトキシリンに5分間浸漬して染色します。水道水を流して1〜2分間すすぎます。スライドを0.5%塩酸、70%エタノールに2〜5倍浸漬して区別します。水道水浴で1〜2分間すすぎます。スライドを95%エタノールと0.5%酢酸に10秒間入れます。
    8. スライドをエオシン-Yで室温で30秒間染色した後、スライドを100%エタノールに5分間移します。サンプルをd-リモネンベースの溶媒で5分間透明します。
    9. カバーガラスは、スライドがd-リモネン系溶剤で濡れたまま、キシレン系封入剤を使用して取り付けます。封入剤を一晩固めます。
      注意: 水性の封入剤は使用 しないでください 。
  3. 肉眼的に目に見える腫瘍のない組織を調製して、網状神経線維腫および微小MPNSTを同定します。組織をパラフィンに包埋し、組織学的切片を調製し、これらの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色します。
    1. 内臓を切除し、各臓器の代表的な部分をパラフィンに包埋して、腫瘍の顕微鏡的証拠について検査するH&E染色切片を調製します(図1B)。頭部、前肢、後肢、尾部を取り除きます(図1C)。脊髄および神経根を その場で 検査し、神経根腫瘍の証拠を検出するには、0.3 M EDTA/4%パラホルムアルデヒ(pH 8.0)に4 °Cで48〜72時間浸漬することにより、脊柱および関連する肋骨および軟部組織を脱灰します。次に、サンプルを1x PBSですすぎます。脱灰の最後に、針で脊柱に穴を開けて、脱灰が完了していることを確認します。針がクランチせずに骨に簡単に浸透する場合、脱灰は成功します。
    2. 脱灰した脊柱と関連する構造を、組織カセットに収まるブロックに切断します。段階2.1.2-2.1.7の説明に従って、段階的に調度したエタノールで脱水し、続いてd-リモネンベースの溶媒で脱水します。パラフィンに埋め込み、ステップ2.1.7-2.2.1の説明に従って4〜5μmの切片を調製します。ステップ2.2.2-2.2.9の説明に従ってH&E染色を行います。封入剤を一晩固めます。

3.潜在的な網状神経線維腫を特定し、診断を確定するために特別な染色を行います

注:H&EおよびGEM腫瘍切片の特殊染色の評価には、経験豊富なヒトまたは獣医の病理学者を含めることを強くお勧めします。

  1. 明視野顕微鏡を用いて上記のように調製したH&E染色スライドを検査し、潜在的な末梢神経鞘腫瘍を同定する。神経線維腫およびMPNSTは末梢神経内に発生するため、顕微鏡的腫瘍が末梢神経と関連しているかどうかを判断することが重要です。末梢神経鞘腫瘍の可能性があるブロックを特定し、免疫染色やその他の特殊な染色を行って診断を確認または反論できるようにします。
  2. H&E染色切片の明視野検査中に見られる組織学的特徴に基づいて、潜在的なPNをMPNST /他の高悪性度腫瘍と区別します。ヒトPNは軽度の高細胞性新生物であり、主に細長く、しばしば波状の核を有する細胞で構成される。多くの領域では、細胞は緩く詰められており、粘液様細胞外物質によって分離されている可能性があります。P 0-GGFβ3マウスのPNは、同様の外観を有する。有糸分裂は通常存在しません。腫瘍が中等度から高度の高細胞性である場合、腫瘍はMPNSTまたは別のタイプの高悪性度新生物である(下記参照)。
  3. PNは、腫瘍性シュワン細胞と肥満細胞などの他の非腫瘍細胞型の混合物で構成されています。PNの同一性を確認するには、H&E検査で同定された潜在的なPNを含むブロックの切片で、Schwann細胞マーカーS100βおよびSox10および肥満細胞マーカーCD117(c-Kit)の免疫染色を行います(代替肥満細胞マーカー染色オプションについてはセクション3.4を参照)。Ki67免疫染色を行い、増殖率が低いことを確認します。
    注: 表1 は、GEM網状神経線維腫(S100β、Sox10、CD117、Ki67)のルーチン同定、MPNSTの診断、および神経線維腫に存在する他の細胞タイプの完全な評価に使用される抗原マーカーを示しています。これらの後者の抗原は、新しいGEMモデルを最初に記述するときにのみ染色します。推奨条件については、抗体メーカーのデータシートを参照してください。抗体メーカーのインサートが抗原賦活化を推奨しているかどうかに注意してください。すべての抗原が賦活化を必要とするわけではありません。
    1. 選択したパラフィンブロックから4〜5μmの切片を調製し、正に帯電したスライドに取り付けます。手順2.2.2-2.2.6の説明に従ってセクションのパラフィンを解除します。
    2. 1x PBSで切片を3〜5分間すすぎます。
    3. 抗体メーカーが抗原賦活化を推奨している場合は、クエン酸緩衝液を調製してください。9 mLのクエン酸溶液(500 mLの蒸留水に10.5 gのクエン酸)と41 mLのクエン酸ナトリウム溶液(500 mLの蒸留水に14.7 gのクエン酸ナトリウム)を混ぜ合わせます。
    4. 加熱炊飯器でクエン酸緩衝液にスライドを20分間入れて抗原賦活化を行います。
    5. スライドを3%過酸化水素/1x PBSに10分間移し、組織内のペルオキシダーゼ活性を排除します。
      注意: この溶液は毎回新鮮にし、3〜4か月以上経過している場合は過酸化水素の原液を使用しないでください。
    6. 切片を1x PBSですすぎます。
    7. ブロッキングバッファー(2% BSA、0.1% Triton X-100 in 1x PBS)を使用して切片を1時間ブロックします。スライドを1x PBSで短時間すすぎます。
    8. 組織切片に一次抗体を添加します。希釈したブロッキングバッファーで一次抗体を調製します。スライドを37 °Cで2時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。
    9. スライドを1x PBSで5分間洗浄し、3回繰り返します。
    10. ビオチン化二次抗体で組織を1〜2時間インキュベートします。
    11. メーカーのプロトコルに基づいてジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製し、スライドを溶液に2〜10分間浸します。スライドを水で5分間洗浄します。
    12. 切片をヘマトキシリンに10〜15分間浸漬して対比染色します。透明になるまで流水にさらします。スライドをアルコールにすばやく浸し、スライドを水ですすいでください。
    13. スライドを70%エタノール、95%エタノール、100%エタノールに溶液あたり4〜5倍すばやく浸すことにより、段階的なエタノールでスライドを脱水します。スライドをd-リモネンベースの溶媒中で2分間インキュベートします。スライドを d-リモネンベースの溶媒の 2 番目のバッチで 2 分間インキュベートします。
    14. スライドをキシレンベースの封入剤で取り付けます。
    15. 明視野顕微鏡でスライドを調べます。
    16. 免疫蛍光法の場合は、手順3.3.10-3.3.15を省略します。代わりに、ブロッキングバッファーで希釈した種特異的な二次抗体で組織を1〜2時間インキュベートします。
    17. スライドを1x PBSで5分間すすぎ、3回繰り返します。
    18. 1x PBS/グリセロールを使用してスライドを取り付けます。
    19. 蛍光顕微鏡でスライドを検査します。
  4. 肥満細胞を染色するための代替法:トルイジンブルー染色
    1. 1 gのトルイジンブルーOを100 mLの70%エタノールに溶解して、トルイジンブルーストック溶液を調製します。
    2. 0.5gのNaClを50mLの蒸留水に溶解して、1%塩化ナトリウム(NaCl)溶液を調製します。混ぜて溶かします。HClを使用してpHを約2.0〜2.5に調整します。
      注:このNaCl溶液は、染色を行うたびに新鮮にする必要があります。
    3. 1% NaCl溶液45 mLに5 mLのトルイジン青原液を加えて、トルイジン青色ワーキング溶液を調製します。よく混ぜて、pHが約2.3になるようにします。
      注:pHが2.5を超えると、メタクロミアが少なく染色されます。染色を行うたびにこの溶液を新鮮にしてください。
    4. ステップ2.2.2-2.2.6で説明されているように、正に帯電したスライドに取り付けられた4〜5μmの切片を脱パラフィンします。脱パラフィンした切片を流水で2分間洗浄します。
    5. トルイジンブルーの作業溶液で切片を2〜3分間染色します。蒸留水で2分間洗います。
    6. 95%エタノールに10倍浸漬して切片を脱水します。スライドを100%エタノールに10回浸します。スライドを新鮮な100%エタノールにさらに10回浸します。
    7. スライドをd-リモネンベースの溶媒中で2分間インキュベートします。スライドを d-リモネンベースの溶媒の 2 番目のバッチで 2 分間インキュベートします。
    8. カバーガラスは、スライドがd-リモネン系溶剤で濡れたまま、キシレンベースの封入剤を使用して取り付けます。
      注意: 水性の封入剤は使用 しないでください 。
    9. 明視野顕微鏡でスライドを調べます。肥満細胞は、細胞質内の濃い紫色の顆粒の存在によって識別されます。他の種類の細胞は水色に染色されています。

4.MPNSTを診断し、代替診断を除外するための特別な染色

  1. ヒトMPNSTの組織学的外観は非常に多様であり、いくつかの異なる腫瘍型がMPNSTの外観に類似している28。MPNSTはシュワン細胞系に由来するため、H&E染色切片の肉眼検査または明視野顕微鏡検査により、腫瘍が末梢神経から発生するか、既存の良性PN内に発生するかを判断します。MPNSTは末梢神経またはPNと関連していない場合にみられるが(通常、解剖中の神経からの不注意な分離、MPNSTの異常増殖による既存のPNの破壊、または病変が転移性であるため)、腫瘍が神経またはPNと関連していない場合は診断の可能性が低いため、腫瘍と神経またはPNとの関連を探す。
  2. 潜在的なMPNSTを含むパラフィンブロックから4〜5μmの切片を調製し、ステップ2.2.1の説明に従って正に帯電したスライドに取り付けます。手順2.2.2-2.2.6の説明に従ってセクションのパラフィンを解除します。
  3. ステップ3.3.1-3.3.15に記載の表 2 に示した抗体のパネルを用いて免疫組織化学を行う。
  4. 明視野顕微鏡で免疫染色を調べます。MPNSTはシュワニアン分化を示すため、S100β、ネスチン、およびSox10の均一または斑状の免疫反応性を探します。腫瘍がこれら3つのマーカーに対して陽性でない場合は、 表2 を参照して診断を確定する。
    注:ヒトとマウスのMPNSTは、異なる分化を示すことができます。例えば、一部のヒトMPNSTは限局性横紋筋芽細胞性分化を示す(これらの多様体は悪性トリトン腫瘍として知られている)。これらの新生物はシュワニアンマーカーのために染色されますが、デスミン、MyoD1、ミオゲニンなどの筋肉マーカーも発現します。これらの後者のマーカーに対する免疫反応性は、研究者が腫瘍をMPNSTとして診断することを思いとどまらせるべきではない。滑膜肉腫の病因をモデル化するために、SS18-SSX融合遺伝子を条件付きで発現する複数のマウスモデルが確立されているが29、我々の知る限り、同等の融合転写産物を自発的に生成する滑膜肉腫モデルは知られていない。したがって、GEM腫瘍におけるSS18-SSX融合転写産物は探さず、代わりに免疫組織化学的プロファイルに依存しています。

5. MPNSTのグレーディング

  1. WHOグレードIVのMPNSTの特徴である腫瘍壊死が存在するかどうかを判断します。グレード IV の MPNST では、顕著な細胞過細胞性、活発な有糸分裂活性 (10 個の高出力 (40 倍) フィールドあたり ≥4 個の有糸分裂)、および細胞学的異型を探します。
    1. 壊死が認められない場合は、腫瘍を評価して、細胞性亢進、活発な有糸分裂活性、および細胞学的異型が存在するかどうかを判断します。壊死がない状態でこれらの特徴がすべて存在する場合は、腫瘍をWHO悪性度IIIのMPNSTとしてグレード付けします。
    2. WHO悪性度IIの腫瘍は細胞性が増加していることを特徴とするが、WHO悪性度IIIおよびIVのMPNSTよりも程度は低い。WHOグレードIIのMPNSTにおける腫瘍細胞の核は、サイズの増加(神経線維腫における腫瘍細胞核のサイズの3倍以上)および色素過多症を示す。有糸分裂活性の増加(10高出力フィールドあたり<4個の有糸分裂)は、WHO悪性度IIの腫瘍と関連しているが、必要条件ではない。
      注:高悪性度腫瘍は通常、低悪性度から進行するため、低悪性度領域と高悪性度領域が同じMPNSTに存在する可能性があります。この状況では、腫瘍の悪性度は存在する最高悪性度領域によって決定されます。
      注:上記のWHOの等級付けシステムが患者の転帰を予測できるかどうかについては、人間の病理学者の間で論争があり、これらの病理学者の中には、MPNSTを単に低悪性度または高悪性度に分類することを好む人もいます。このスキームでは、高悪性度MPNSTは、顕著な細胞学的異型、活発な有糸分裂活性(10高出力フィールドあたり>5有糸分裂)、および壊死の有無にかかわらず顕著な細胞過細胞性を示します。低悪性度MPNSTは壊死を欠くが、有糸分裂活性、細胞学的異型、および高悪性度MPNSTと生物学的可能性が不明な非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBP)の中間の細胞性を示す。ANNUBPと低グレードのMPNSTを区別することは、これらのエンティティの経験が長くない調査員にとって難しい場合があるため、上記のシステムを好みます。

6. 早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の培養液の調製

  1. 新鮮な腫瘍片2から早期継代P0-GGFβ3腫瘍細胞を培養する(ステップ1.5、図1A)。この時点から無菌状態を維持します。
    1. 腫瘍を小片(2〜4 mm)に切断し、100 mmの組織培養皿に10%のウシ胎児血清、2 μmol/Lのフォルスコリン、および10 nmol/Lのニューレグリン1β(NRG1β)を含むDMEM10(ダルベッコの最小限の必須培地)でミンチすることにより、腫瘍を解離します。
    2. ミンチにした組織断片から、プレートがコンフルエントになるまで、5%CO2中37°Cで細胞を増殖させます。3〜4日ごとにメディアを交換してください。
    3. 細胞培養を分割します。100 mmディッシュから培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄します。みじん切りにしたティッシュを取り除き、廃棄します。PBSを除去し、0.25%トリプシン1 mLを室温で2〜5分間添加します。細胞の剥離を促進するには、プレートを軽くたたき、光学顕微鏡を使用して剥離を確認します。必要に応じてトリプシンのインキュベーションを延長します。
    4. 2 mLのDMEM10を添加してトリプシンを中和します。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、細胞を500× g で5分間ペレット化します。培地を取り除き、5 mLの新鮮なDMEM10をペレットに加えます。
    5. 細胞懸濁液をDMEM10を含む2〜4枚の100 mmディッシュに分配します。細胞を5継代以上(ステップ6.1.3および6.1.4)分割せず、フォルスコリンおよびNRG1βを含まないDMEMで維持します。将来の使用のために、継代2で細胞を凍結することを忘れないでください。

7. 免疫細胞化学による早期継代MPNST細胞の同一性の検証

  1. 滅菌済みの 18 mm #1.5 丸いガラスカバーガラスを 6 ウェル滅菌組織培養皿のウェルに入れます。
    1. ポリ-L-リジン/ラミニン溶液を、カバーガラスを覆うのに十分な量でウェルに入れます。蒸発を最小限に抑えるために、プレートをラップで密封します。4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、カバーガラスを滅菌PBSで3回洗います。
      注:早期継代のMPNST細胞をコーティングされていないカバーガラスに播種することを試みましたが、ポリ-L-リジン/ラミニンコーティングがない場合、細胞がうまく接着しないことがわかりました。
    2. 10,000個の細胞をカバーガラスに播種し、増殖培地に2 mLの細胞懸濁液をカバーガラスを含む各ウェルに静かに添加します。プレートを組織培養インキュベーターで5%CO2 と37°Cで一晩インキュベートします。
    3. 翌朝、カバーガラスをPBSで2 x 5分間すすぎます。
    4. PBS中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を室温で18分間固定します。
    5. カバーガラスをPBSで3 x 5分すすぎます。必要に応じて、プラスチックフィルムを使用してプレートを密封し、この時点で4°Cで保管します。
    6. PBSで新鮮な50 mM NH4Clを作ります。カバーガラスをPBS中の50 mM NH4Clで室温で10分間インキュベートしてアルデヒドをクエンチします。
    7. カバーガラスを 0.3% Triton X-100 in PBS 溶液中で室温で 15 分間インキュベートし、細胞を透過処理します。カバーガラスをPBSで3 x 5分間洗浄します。
    8. カバーガラスをブロッキングバッファー(1%ウシ血清アルブミン、0.2%脱脂粉乳、0.3%Triton X-100を含むPBS1x)中で室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックします。
    9. ブロッキングバッファーを除去し、ブロッキングバッファー中で所定の最適希薄度に希釈した親腫瘍(典型的にはS100β、Nestin、およびSox10)に存在するMPNSTマーカーを認識する一次抗体を添加する。プレートをプラスチックフィルムで包み、加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
    10. PBSで3 x 5分間洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。ブロッキングバッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。 光から保護します。
    11. PBSで3 x 5分間洗浄します。カバーガラスを1〜5μgのヘキスト色素で10分間インキュベートします。
    12. カバーガラスをPBSで5分間洗浄します。1:1 1x PBS/グリセロールを使用してスライドをマウントします。蛍光顕微鏡で撮影した画像。

8.腫瘍原性を示すための早期継代腫瘍細胞の同種移植片

  1. DMEM10中の早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。細胞を室温のハンクス平衡塩溶液(HBSS)で一度すすぎます。細胞を非酵素的細胞解離溶液で30秒〜1分間処理し、基質から除去します。非酵素的細胞解離試薬1 mLあたり5 mLのDMEM10を添加します。
    注:細胞の解離には、最大10〜20分と、はるかに長い時間がかかる場合があります。メーカーのプロトコルを参照してください。
    注:細胞をコンフルエントまで増殖させると、移植の有効性が低下するため、行わないでください。
    1. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞を5 × g で5分間スピンダウンし、DMEM10 100 μLあたり1〜2×106 細胞の濃度で再懸濁します。注入の準備が整うまで細胞を氷上に保管します。
    2. NOD-SCIDγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ)マウスをイソフルラン気化器の誘導チャンバーで麻酔する。動物を胃の上に置き、注射部位を70%エタノールで殺菌します。注入する前に、部位を風乾させます。.注入前に、細胞を室温に戻します。
    3. 右脇腹に1-2 x 106 細胞を皮下注射します。寝具のないケージにマウスを一人で入れ、回復させます。低体温症を防ぐために、ケージの一部のみが加熱パッド上にあることを確認してください。これにより、マウスが過熱した場合に移動できるゾーンが提供されます。
      注:一部の移植片では採取できない可能性があるため、早期継代培養ごとに最低3匹のマウスを移植します。
    4. 移植片を15〜60日間成長させます。動物の健康状態を週に3回評価し、体重や行動の変化などの体調スコアを各検査で記録します。最大許容移植片サイズに達したマウスまたは瀕死のマウスを二酸化炭素安楽死とそれに続く子宮頸部脱臼を使用して終了します。死亡時の年齢を日数で記録します。腫瘍が外部から見えるようになったら、腫瘍の寸法(長さ、幅、高さ)を記録します。
      注:私たちの経験では、早期継代MPNST培養物が異なれば、さまざまな効率で移植片になり、移植片の成長に必要な時間も異なります。動物は、IACUCが承認した最大許容腫瘍サイズおよび/または人道的エンドポイントを超えて進行することを許可してはなりません。
  2. 腫瘍を採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、セクション2.1-2.2.9の説明に従ってH&E染色を行い、同種移植片が反応性組織ではなく腫瘍であることを確認します。必要に応じて、親腫瘍に存在していたマーカーについて移植片を免疫染色します。

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結果

図2は、P 0-GGFβ3マウスに生じる肉眼的に明らかな新生物の例を示す。肉眼で容易に識別できる腫瘍は、図2A(矢印)に示すように、腫瘤が体の領域を拡張させているように見えることがあります。新生物が末梢神経鞘腫瘍である可能性があるかどうかを判断する際には、腫瘍が末梢神経と関連していることを立証することが不可欠である。この場合、MRIスキャン(図2B)により、腫瘍が坐骨神経(矢印)と関連していることが実証されます。この関連は、マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖した後に確認された。大きなサイズは必ずしも腫瘍が悪性であることを示すものではないことに注意すべきです。この場合、腫瘍の組織学的検査(図2C)により、腫瘍が神経線維腫であることが実証された。しかしながら、最も一般的には、肉眼的に明らかな腫瘍は、マウスの剖検を行うまで同定されない。図2D

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ディスカッション

ここで紹介する組織学的および生化学的方法は、神経線維腫およびMPNSTの病因のGEMモデルを診断および特徴付けるためのフレームワークを提供します。何年にもわたって、これらの方法論は、GEMモデルで発生する末梢神経鞘腫瘍の病理を評価するのに非常に有用であることがわかりました21、25、26。しかしながら、ここで概説するプロトコルは、GEMモデルにおける腫瘍がヒトの腫瘍の病理をどの程度正確に再現しているかを判断するのに有用であるが、これらの戦略にはいくつかの限界があり、それを評価すべきである。まず、P 0-GGFβ3マウスは腫瘍表現型のほぼ完全な浸透度を示すため、ゲノム研究やゲノムスケールのshRNAスクリーニングに使用できる神経線維腫およびMPNST21,25,26のマウスを

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353およびR01 NS109655 to S.L.C.;R01 NS109655-03S1 から D.P.J.)、国立がん研究所 (R01 CA122804 から S.L.C.)、および国防総省 (X81XWH-09-1-0086 および W81XWH-12-1-0164 から S.L.C. へ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 mm 組織培養プレートCorning Falcon353003
3, 3'- ジアミノベンシジン (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
AceticAcid Fisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (ヤギ抗マウス)InvitrogenA21043 または A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
塩化アンモニウム (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
ウシ血清アルブミンフィッシャーサイエンティフィックBP1600-100
カルデスモンABCAM E89、ab32330
CD117セルマーク117R-18-ASR
CD163カNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
セルスクレーパーSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
サイトケラチンABCAM C-11, ab7753
デスミン・アジレント・ダコ クローン D33 (M0760)
ジアミノベンシジン (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
グリセロールSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric Acid FisherScientificA144-212
過酸化水素Fisher Scientific327-500
Iba1和光ケミカルズ019-19741
ImmPRESS HRP(ペルオキシダーゼ)ポリマーキット、マウスオンマウスベクターラボラトリーズMP-2400
ImmPRESS HRP(ペルオキシダーゼ)ポリマーキット、ウマ抗ウサギベクターラボラトリーズMP-7401
インキュベーターThermo ScientificHeracell 240i CO2 インキュベーター
イソフルランピラマルNDC 66794-017-25
イソプロパノールフィッシャーサイエンティフィックA415
Ki-67細胞シグナル 12202
ラミニンサーモフィッシャーサイエンティフィック23017015
液体窒素
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
ミクロトーム
ネスティンミリポア ヒト:MAD5236(10C2)、ヒト:MAB353(Rat-401)
ニューレグリン1ベータ社内S.L.C.製(R&から396-HB-050 / CFとしても入手可能)Dシステム)
ニューロフィブロミン・サンタクルーズ・バイオテクノロジー sc-67
うなずく。CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ マウスジャクソン研究所5557
脱脂粉乳ウォルマートグレートバリュー ブランド
P0-GGFβ3マウス社内
フィンワックスライカパラプラスト 39601006
パラフィルム MSigma-AldrichPM-999
パラホルムアルデヒド (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
パーマウント (キシレン封入用剤)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSevenエクセレンス、8603
リン酸緩衝生理食塩水(ダルベッコ)コーニング20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2)、ab137078
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩シグマ-アルドリッチP5899-5MG
ポータブルアイソフルランスマシンVetEquip吸入麻酔システム
PVA-DABCO(水性マウントメディウム)ミリポアシグマ10981100ML
炊飯器ブナハミルトン
S100Bアジレントダコ Z0311 (現 GA504)
SMAベンタナメディカルシステムズ クローン1A4
塩化ナトリウムッシャーサイエンティフィS640
エン酸ナトリウム(二水和物)フィッシャーサイエンティフィックBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
鋼組織学金型
スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-15
TCF4 / TCFL2 細胞シグナル伝達 (CH48H11) #2569
ティッシュカセット
トルイジンブルーACROS Organics 348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31
ライパラフィックク

参考文献

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