遺伝子改変マウスモデルにおける悪性末梢神経鞘腫瘍の同定、診断、および悪性度判定

Summary

私たちは、遺伝子改変マウスの神経系新生物がヒトの病理を正確に再現しているかどうかを評価するための方法論を開発しました。本研究では、これらの組織学的手法、定義された病理学的基準、および培養方法論を、P 0-GGFβ3マウスモデルで発生する神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍に適用します。

Abstract

常染色体優性腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者は、一般的に叢状神経線維腫(PN)を発症し、その後、非常に侵攻性の高い悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化します。PNがMPNSTに変化するプロセスを理解することは、NF1のヒトで見られるPN-MPNSTの進行を正確に再現する遺伝子改変マウス(GEM)モデルの利用可能性によって容易になります。残念ながら、Nf1アブレーションを用いたGEMモデルでは、このプロセスを完全に再現することはできません。そこで、シュワン細胞でシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)を過剰発現させることでPNを発現させ、高頻度でMPNSTに進行するGEMモデルであるP 0-GGFβ3マウスを開発しました。しかし、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成と腫瘍性進行がNF1患者に見られるプロセスを正確にモデル化しているかどうかを判断するには、まず、P_0-GGFβ3末梢神経鞘腫瘍の病理がヒトの病理を再現していることを証明する必要がありました。

ここでは、P 0-GGFβ3およびP_0-GGFβ3を使用して、GEMモデルで末梢神経系新生物を正確に診断および等級付けするために使用される特殊な方法論について説明します。例としてTrp53^+/-マウス。PNおよびMPNSTの診断に使用される組織学的、免疫組織化学的、および組織化学的方法、これらの新生物をそれらの病理学を模倣する他の腫瘍型と区別する方法、およびこれらの新生物を等級付けする方法について説明します。本稿では、GEM MPNSTからの早期継代培養の確立、免疫細胞化学を用いたこれらの培養物の特性評価方法、および同種移植片の確立による腫瘍原性の検証方法について議論する。総じて、これらの技術は、GEMモデルで発生するPNおよびMPNSの病理を特徴付け、これらのマウス腫瘍の病理をヒトの病理学と批判的に比較します。

Introduction

過去30年間にわたり、多くの研究室が、ヒトのがん関連変異をマウスゲノムに導入したり、ヒトのがんに過剰発現している遺伝子産物を過剰発現させたりすることで、ヒトがんのマウスモデルの作成を試みてきました。得られた遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、新たに導入されたゲノム改変が腫瘍形成を開始することの確立、腫瘍の進行に寄与する他のその後に発生する遺伝的またはエピジェネティックな変化の同定、腫瘍の開始と進行を促進する主要なシグナル伝達経路の定義など、さまざまな目的に使用できます。免疫不全マウスの使用に依存する同所異種移植モデルとは異なり、GEMがんモデルは完全に機能する免疫系を持っているため、候補となる治療薬に対する反応をより正確にモデル化できます。しかし、このような目的でGEMがんモデルを使用する場合、研究者はGEM新生物で行われた観察がヒトの対応物に関連していることを確認することが不可欠です。この検証には、GEM新生物の病理学の徹底的な評価と、GEM新生物の病理学的特徴が対応するヒト腫瘍型の病理学を再現しているかどうかの決定を含める必要があります。

腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)は、人間の神経系に影響を与える最も一般的な遺伝性疾患であり、3,000〜3,500人の出生ごとに約1人で発生します^1,2,3。NF1に罹患した個人は、皮膚(皮膚神経線維腫)および大きな神経および神経叢(網状神経線維腫)に神経線維腫として知られる複数の良性末梢神経鞘腫瘍を発症します。皮膚神経線維腫と叢状神経線維腫はどちらも身体的、行動的、および/または社会的障害を引き起こすことにより患者の生活の質を悪化させますが、叢状神経線維腫(PN)は特に危険です^4,5。これは、PNが悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化することが多いためであり、これは^{生存率が非常に}低い侵攻性の紡錘細胞腫瘍である^1,2。この生存率の低さは、MPNSTの治療に現在使用されている放射線療法および化学療法レジメンが効果がないことが主な原因です。しかし、より効果的な新しい治療法の開発は困難でした。これは、MPNSTがNF1患者にどれほど一般的に発生するかにもかかわらず、MPNSTは依然としてまれな新生物であるためです。その結果、研究のために多数のヒト腫瘍を入手することは非常に困難です。また、臨床試験のために十分な数のMPNST患者を募集することも困難です。これらの限界を克服するために、神経線維腫の病因とPN-MPNSTの進行を促進する異常に関するさらなる洞察を得て、候補となる治療薬の前臨床試験を促進することを目的として、いくつかのGEMモデルが作成されました。

NF1患者は、NF1遺伝子の1つのコピーに不活性化変異を有する。神経線維腫の病因は、シュワン細胞系統の細胞に残りの機能的NF1遺伝子の不活性化変異が発生したときに引き起こされます。しかし、驚くべきことに、生殖細胞不活性化Nf1変異を持つマウスを作製したところ、神経線維腫は発症しなかった^6,7。その後の実証では、Nf1-nullシュワン細胞と他のすべての細胞型におけるNf1ハプロ不全を有するマウス(Krox20-Cre;Nf1^flox/-マウス)は、神経線維腫の病因には、他の細胞型におけるNf1遺伝子の投与量の減少が必要である^{ことを示唆している8。}それでも、Krox20-Creの叢状神経線維腫;Nf1^flox/-マウスはMPNSTに進化しなかったため、ヒトの生態を部分的に模倣したに過ぎない。MPNSTの病因は、Nf1変異がTrp53⁹やCdkn2a¹⁰などの追加の腫瘍抑制遺伝子の変異と組み合わされたときに起こったが、これらのGEMモデルにおけるMPNSTは、既存の良性叢状神経線維腫からではなく、de novoまたは生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBP)から発症した^11,12(^13,14参照)これらのモデルや、Suz12やPten¹⁵などの遺伝子にMPNST関連の機能喪失変異を追加導入した他のモデルの優れたレビュー。

これらのマウスモデルは、NF1、TP53、CDKN2Aなどの遺伝子がNF1関連末梢神経系新生物の病因に果たす役割を確立し、治療薬候補を試験する前臨床試験に非常に貴重です。しかし、叢状神経線維腫が進行して、生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBPs¹⁶)になり、次にMPNSTになるプロセスについては、まだ完全には理解されていません。最近では、Nf1とArfに欠失したマウスがANNUBPを発達させ、それがMPNSTに進行するという報告があり、このプロセスの理解が進んでいます¹¹。しかし、ヒトに見られる網状神経線維腫-MPNSTの進行過程を完全に再現したNf1変異ベースのマウスモデルはまだ存在しません。さらに、MPNSTの発症につながる複数の異なる経路があるかどうかは明らかではありません。このことを考えると、上記のGEMは、神経線維腫-MPNSTの進行およびMPNSTの病因につながるいくつかの異なる経路のサブセットのみをモデル化している可能性があります。この点は、MPNSTも散発的に発生し、一部の散発的なMPNSTは明らかにNF1変異を有さないという事実によって強調されている^17,18。

この後者の点は、 NF1 変異を欠く少なくともいくつかの散発性MPNSTが黒色腫または別のタイプの肉腫であるというMagollon-Lorenzらの最近の提案によって異議を唱えられてきましたが¹⁹、私たちは最近、散発性MPNSTと、この腫瘍に由来する細胞株(2XSB細胞)が NF1 野生型であることを報告しました²⁰.親腫瘍および2XSB細胞株の特性評価において、散発性悪性末梢神経鞘腫瘍の鑑別診断で日常的に考慮される黒色腫および他の複数の肉腫型を含む代替診断の可能性を系統的に除外した²⁰。さらに、Magollon-Lorenzらは、彼らが研究した3つの散発性MPNST細胞株における彼らの知見は、散発性MPNSTとして同定されたすべての腫瘍がMPNSTではないことを示すために一般化できないことを認めたことに留意する。

神経線維腫とMPNSTの病因が必ずしも特定の腫瘍抑制遺伝子変異に依存しないGEMモデルを構築するために、強力なシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)の過剰発現がシュワン細胞特異的ミエリンタンパク質ゼロ(P₀)プロモーター(P 0-GGFβ3マウス)によって駆動されたトランスジェニックマウスを作製した²¹.我々は以前に、ヒト神経線維腫、MPNST、およびMPNST細胞株が、NRG1シグナル伝達を媒介するerbB受容体チロシンキナーゼ(erbB2、erbB3、およびerbB4)とともにいくつかのNRG1アイソフォームを発現し、これらのerbB受容体が恒常的に活性化されることを示しました²²。また、erbBキナーゼの薬理学的阻害剤がMPNSTの増殖²²、生存²³、遊走²⁴を強力に阻害することも実証した。ヒトでの観察結果と同様に、P 0-GGFβ3マウスは叢状神経線維腫を発症し²⁵、高頻度でMPNSTに進行する^21,25。我々は、P 0-GGFβ3 MPNST、ヒトのMPNST、Trp53およびCdkn2aの変異、および腫瘍形成に寄与する可能性のある他の多くのゲノム異常を一般的に発症することを示しました²⁵。P 0-GGFβ3マウスに生じるMPNSTは、不活性化Nf1変異を有しない。しかし、遺伝的相補性を用いて、NRG1は、主にNf1の欠損によって変化したのと同じシグナル伝達カスケードを介して、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成を促進することを示した²⁶。この結論は、Trp53ハプロ不全(P _0-GGFβ3;Trp53^+/-マウス)は、シス-Nf1^+/-に見られるように、MPNSTがde novoを発症する動物を産生する。Trp53^+/-マウス²⁷。

P 0-GGFβ3マウスがNF1のヒトに見られる神経線維腫の病因および神経線維腫-MPNST進行のプロセスを正確にモデル化することを実証するこの情報およびその他の情報を得るために、これらの動物の組織を処理し、それらの腫瘍を正確に診断し、これらのマウスで発生するMPNSTを等級付けし、早期継代P_0-GGFβ3およびP_0-GGFβ3を確立して特徴付けるための専門的な方法論を開発しました。Trp53^+/- MPNST培養、およびP 0-GGFβ3 PNおよびMPNST、およびP_0-GGFβ3の病理学を批判的に比較する。Trp53^+/- MPNSTをヒトのMPNSTと比較します。これらの方法論の多くは、神経系腫瘍の他のGEMモデルに一般化可能である。さらに、これらの方法論のいくつかは、新生物が他の臓器部位に発生するGEMモデルにより広く適用できます。したがって、ここではこれらの方法論の詳細な説明を提示します。

Protocol

ここで説明する手順は、サウスカロライナ医科大学のIACUCによって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドおよびMUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切な訓練を受けた担当者によって実施されました。

1. P 0-GGFβ3マウスにおける腫瘍の浸透度と生存率の決定、およびさらなる特性評価のためのこれらの動物の腫瘍の同定

1. 腫瘍形成について評価されるマウスのコホートを生成します。必要なマウスの数は、腫瘍表現型の浸透度によって異なります。このような損失を補うには、望ましい最終動物数よりも10〜15%多いコホートから始めます。
   注:我々は、50匹のマウス(うち6匹は腫瘍とは無関係な理由(例えば、闘争)のために失われた)の初期コホートにおいて、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍浸透度を経験的に決定した²⁵。
2. 動物の健康状態を週3回評価し、各検査での体重や行動の変化などの体調スコアを記録します。担がんマウスまたは瀕死のマウス(下記注参照)を二酸化炭素安楽死とそれに続く子宮頸部脱臼で終わらせる。死亡時の年齢を日数で記録します。腫瘍が外部から見える場合は、腫瘍の寸法(長さ、幅、高さ)を記録します。
   注:動物は、IACUCが承認した最大許容腫瘍サイズおよび/または人道的エンドポイントを超えて進行することを許可されないことが不可欠です。
3. 死亡時年齢を使用して、Kaplan-Meier生存曲線を確立し、平均死亡年齢と生存範囲を決定します。
   注:P 0-GGFβ3マウスの平均死亡年齢は261.5日で、範囲は74〜533日でした。コホートの91%が多発性神経線維腫を有し、71%がMPNSTを有していた²¹。
4. 肉眼的に見える腫瘍が存在するかどうかを判断し、存在する場合は、無菌条件下でそれらを解剖して、腫瘍が末梢神経に関連しているかどうかを確認し、腫瘍を切除します。P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3;Trp53^+/-マウスの末梢神経鞘腫瘍は、三叉神経および坐骨神経に最も多くみられる。肉眼的に目に見える腫瘍がこれらの神経に関連して見られない場合でも、以下に説明するようにこれらの神経を固定して包埋し、微小腫瘍の存在を調べることができるようにします。微小腫瘍は通常、これらの神経に関連する神経節内に発生します。
5. 肉眼的に見える腫瘍を3つに切ります(図1A)。ピース1は、組織学(パラフィン切片、免疫組織化学、および組織化学)に使用します。ピース2を使用して、早期継代培養を確立します。将来の実験(イムノブロット、RNAおよびDNA単離など)のためのスナップフリーズピース3(液体窒素を使用)。
6. 4%パラホルムアルデヒドの4%パラホルムアルデヒドを4 ^°Cで一晩固定し、4%パラホルムアルデヒドに4°Cで一晩浸して動物の体の残りの部分を固定します。

2.肉眼的に見える腫瘍のパラフィン包埋と初期診断評価のためのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の調製

1. 肉眼的に見える腫瘍のパラフィン包埋
   1. 腫瘍片1を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、組織の体積の少なくとも10倍の量のPBSに15分間入れて組織をすすぎます。後続のすべてのすすぎに同じ量を使用してください。すすぎごとに新しい量のPBSを使用して、さらに2回の15分間のPBSリンスを繰り返します。
   2. 腫瘍片1を70%エタノールに移します。組織を70%エタノールに浸けて、4°Cで24時間保持します。 必要に応じて、これらの条件下で組織を長期間保存します。
      注: ステップ 2.1.1 から 2.1.7 は、市販の組織処理機にアクセスできない調査員の利益のために提供されています。治験責任医師が組織処理業者にアクセスできる場合、組織は、プログラムされた機器プロトコルに従って段階付けされたエタノールとキシレンを介して処理されます。
   3. 腫瘍片1を80%エタノールに移し、室温で30分間加熱する。80%エタノールの新鮮な容量でさらに30分間インキュベーションを繰り返します。
   4. 腫瘍片1を95%エタノールに移し、室温で75分間加熱する。インキュベーションをさらに2回繰り返し、毎回、95%エタノールの新鮮な容量でさらに75分間行います。
   5. 腫瘍片1を100%エタノールに移し、室温で60分間インキュベートします。60分間のインキュベーションをさらに2回繰り返し、そのたびに新鮮な容量の100%エタノールを使用します。
   6. 腫瘍片1をd-リモネン系溶媒に移し、室温で30〜60分間インキュベートします。腫瘍片1を新しい容量のd-リモネンベースの溶媒に移し、室温でさらに30〜60分間インキュベートします。
   7. 腫瘍片 1 を 1:1 パラフィン/d-リモネン系溶媒に 60 ^°C で 1 時間移し、1:1 パラフィン/d-リモネン系溶媒を廃棄し、腫瘍片 1 を 60 ^°C パラフィンに移し、60 ^{°C で}20 分間インキュベートします。腫瘍片1をパラフィン中で60^°Cで一晩インキュベートします。
   8. パラフィンのベース層を鋼の組織型に注ぎ、固化させます。腫瘍片1を塩基性パラフィンの表面に転写し、位置決め直後に、組織を60 ^°Cパラフィンで覆い、組織カセットを溶融パラフィンの上に置き、溶融パラフィンと接触させる。金型を埋め込みステーションの低温側に移し、10〜15分間固化させます。
   9. 付属のティッシュカセットが入ったパラフィンブロックを型から取り出します。切片作成中に、付属の組織カセットを使用してブロックをミクロトームにクランプします。
      注:パラフィンブロックは、室温で無期限に保存できるようになりました。
2. 肉眼的に見える腫瘍のヘマトキシリンとエオシンで染色された切片を準備します。
   1. ミクロトームを使用して腫瘍組織の4〜5μmの切片を切断し、正電荷を帯びたスライドガラスに取り付けます。
   2. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行うには、スライドをd-リモネンベースの溶媒中で室温で10分間インキュベートして、組織切片を脱パラフィンします。新鮮な量のd-リモネンベースの溶媒中で10分間インキュベーションを繰り返します。
   3. スライドを100%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。スライドを100%エタノールの新鮮な容量に移し、室温でさらに5分間インキュベートします。
   4. スライドを95%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。スライドを新鮮な容量の95%エタノールに移し、室温でさらに5分間インキュベートします。
   5. スライドを70%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。その後、50%エタノールに移し、室温で5分間インキュベートします。
   6. スライドを蒸留水に移し、室温で5分間インキュベートします。
   7. スライドを室温でヘマトキシリンに5分間浸漬して染色します。水道水を流して1〜2分間すすぎます。スライドを0.5%塩酸、70%エタノールに2〜5倍浸漬して区別します。水道水浴で1〜2分間すすぎます。スライドを95%エタノールと0.5%酢酸に10秒間入れます。
   8. スライドをエオシン-Yで室温で30秒間染色した後、スライドを100%エタノールに5分間移します。サンプルをd-リモネンベースの溶媒で5分間透明します。
   9. カバーガラスは、スライドがd-リモネン系溶剤で濡れたまま、キシレン系封入剤を使用して取り付けます。封入剤を一晩固めます。
      注意: 水性の封入剤は使用 しないでください 。
3. 肉眼的に目に見える腫瘍のない組織を調製して、網状神経線維腫および微小MPNSTを同定します。組織をパラフィンに包埋し、組織学的切片を調製し、これらの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色します。
   1. 内臓を切除し、各臓器の代表的な部分をパラフィンに包埋して、腫瘍の顕微鏡的証拠について検査するH&E染色切片を調製します(図1B)。頭部、前肢、後肢、尾部を取り除きます(図1C)。脊髄および神経根を その場で 検査し、神経根腫瘍の証拠を検出するには、0.3 M EDTA/4%パラホルムアルデヒ(pH 8.0)に4 ^°Cで48〜72時間浸漬することにより、脊柱および関連する肋骨および軟部組織を脱灰します。次に、サンプルを1x PBSですすぎます。脱灰の最後に、針で脊柱に穴を開けて、脱灰が完了していることを確認します。針がクランチせずに骨に簡単に浸透する場合、脱灰は成功します。
   2. 脱灰した脊柱と関連する構造を、組織カセットに収まるブロックに切断します。段階2.1.2-2.1.7の説明に従って、段階的に調度したエタノールで脱水し、続いてd-リモネンベースの溶媒で脱水します。パラフィンに埋め込み、ステップ2.1.7-2.2.1の説明に従って4〜5μmの切片を調製します。ステップ2.2.2-2.2.9の説明に従ってH&E染色を行います。封入剤を一晩固めます。

3.潜在的な網状神経線維腫を特定し、診断を確定するために特別な染色を行います

注:H&EおよびGEM腫瘍切片の特殊染色の評価には、経験豊富なヒトまたは獣医の病理学者を含めることを強くお勧めします。

1. 明視野顕微鏡を用いて上記のように調製したH&E染色スライドを検査し、潜在的な末梢神経鞘腫瘍を同定する。神経線維腫およびMPNSTは末梢神経内に発生するため、顕微鏡的腫瘍が末梢神経と関連しているかどうかを判断することが重要です。末梢神経鞘腫瘍の可能性があるブロックを特定し、免疫染色やその他の特殊な染色を行って診断を確認または反論できるようにします。
2. H&E染色切片の明視野検査中に見られる組織学的特徴に基づいて、潜在的なPNをMPNST /他の高悪性度腫瘍と区別します。ヒトPNは軽度の高細胞性新生物であり、主に細長く、しばしば波状の核を有する細胞で構成される。多くの領域では、細胞は緩く詰められており、粘液様細胞外物質によって分離されている可能性があります。P 0-GGFβ3マウスのPNは、同様の外観を有する。有糸分裂は通常存在しません。腫瘍が中等度から高度の高細胞性である場合、腫瘍はMPNSTまたは別のタイプの高悪性度新生物である(下記参照)。
3. PNは、腫瘍性シュワン細胞と肥満細胞などの他の非腫瘍細胞型の混合物で構成されています。PNの同一性を確認するには、H&E検査で同定された潜在的なPNを含むブロックの切片で、Schwann細胞マーカーS100βおよびSox10および肥満細胞マーカーCD117(c-Kit)の免疫染色を行います(代替肥満細胞マーカー染色オプションについてはセクション3.4を参照)。Ki67免疫染色を行い、増殖率が低いことを確認します。
   注: 表1 は、GEM網状神経線維腫(S100β、Sox10、CD117、Ki67)のルーチン同定、MPNSTの診断、および神経線維腫に存在する他の細胞タイプの完全な評価に使用される抗原マーカーを示しています。これらの後者の抗原は、新しいGEMモデルを最初に記述するときにのみ染色します。推奨条件については、抗体メーカーのデータシートを参照してください。抗体メーカーのインサートが抗原賦活化を推奨しているかどうかに注意してください。すべての抗原が賦活化を必要とするわけではありません。
   1. 選択したパラフィンブロックから4〜5μmの切片を調製し、正に帯電したスライドに取り付けます。手順2.2.2-2.2.6の説明に従ってセクションのパラフィンを解除します。
   2. 1x PBSで切片を3〜5分間すすぎます。
   3. 抗体メーカーが抗原賦活化を推奨している場合は、クエン酸緩衝液を調製してください。9 mLのクエン酸溶液(500 mLの蒸留水に10.5 gのクエン酸)と41 mLのクエン酸ナトリウム溶液(500 mLの蒸留水に14.7 gのクエン酸ナトリウム)を混ぜ合わせます。
   4. 加熱炊飯器でクエン酸緩衝液にスライドを20分間入れて抗原賦活化を行います。
   5. スライドを3%過酸化水素/1x PBSに10分間移し、組織内のペルオキシダーゼ活性を排除します。
      注意: この溶液は毎回新鮮にし、3〜4か月以上経過している場合は過酸化水素の原液を使用しないでください。
   6. 切片を1x PBSですすぎます。
   7. ブロッキングバッファー(2% BSA、0.1% Triton X-100 in 1x PBS)を使用して切片を1時間ブロックします。スライドを1x PBSで短時間すすぎます。
   8. 組織切片に一次抗体を添加します。希釈したブロッキングバッファーで一次抗体を調製します。スライドを37 ^°Cで2時間、または4 ^°Cで一晩インキュベートします。
   9. スライドを1x PBSで5分間洗浄し、3回繰り返します。
   10. ビオチン化二次抗体で組織を1〜2時間インキュベートします。
   11. メーカーのプロトコルに基づいてジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製し、スライドを溶液に2〜10分間浸します。スライドを水で5分間洗浄します。
   12. 切片をヘマトキシリンに10〜15分間浸漬して対比染色します。透明になるまで流水にさらします。スライドをアルコールにすばやく浸し、スライドを水ですすいでください。
   13. スライドを70%エタノール、95%エタノール、100%エタノールに溶液あたり4〜5倍すばやく浸すことにより、段階的なエタノールでスライドを脱水します。スライドをd-リモネンベースの溶媒中で2分間インキュベートします。スライドを d-リモネンベースの溶媒の 2 番目のバッチで 2 分間インキュベートします。
   14. スライドをキシレンベースの封入剤で取り付けます。
   15. 明視野顕微鏡でスライドを調べます。
   16. 免疫蛍光法の場合は、手順3.3.10-3.3.15を省略します。代わりに、ブロッキングバッファーで希釈した種特異的な二次抗体で組織を1〜2時間インキュベートします。
   17. スライドを1x PBSで5分間すすぎ、3回繰り返します。
   18. 1x PBS/グリセロールを使用してスライドを取り付けます。
   19. 蛍光顕微鏡でスライドを検査します。
4. 肥満細胞を染色するための代替法:トルイジンブルー染色
   1. 1 gのトルイジンブルーOを100 mLの70%エタノールに溶解して、トルイジンブルーストック溶液を調製します。
   2. 0.5gのNaClを50mLの蒸留水に溶解して、1%塩化ナトリウム(NaCl)溶液を調製します。混ぜて溶かします。HClを使用してpHを約2.0〜2.5に調整します。
      注:このNaCl溶液は、染色を行うたびに新鮮にする必要があります。
   3. 1% NaCl溶液45 mLに5 mLのトルイジン青原液を加えて、トルイジン青色ワーキング溶液を調製します。よく混ぜて、pHが約2.3になるようにします。
      注:pHが2.5を超えると、メタクロミアが少なく染色されます。染色を行うたびにこの溶液を新鮮にしてください。
   4. ステップ2.2.2-2.2.6で説明されているように、正に帯電したスライドに取り付けられた4〜5μmの切片を脱パラフィンします。脱パラフィンした切片を流水で2分間洗浄します。
   5. トルイジンブルーの作業溶液で切片を2〜3分間染色します。蒸留水で2分間洗います。
   6. 95%エタノールに10倍浸漬して切片を脱水します。スライドを100%エタノールに10回浸します。スライドを新鮮な100%エタノールにさらに10回浸します。
   7. スライドをd-リモネンベースの溶媒中で2分間インキュベートします。スライドを d-リモネンベースの溶媒の 2 番目のバッチで 2 分間インキュベートします。
   8. カバーガラスは、スライドがd-リモネン系溶剤で濡れたまま、キシレンベースの封入剤を使用して取り付けます。
      注意: 水性の封入剤は使用 しないでください 。
   9. 明視野顕微鏡でスライドを調べます。肥満細胞は、細胞質内の濃い紫色の顆粒の存在によって識別されます。他の種類の細胞は水色に染色されています。

4.MPNSTを診断し、代替診断を除外するための特別な染色

1. ヒトMPNSTの組織学的外観は非常に多様であり、いくつかの異なる腫瘍型がMPNSTの外観に類似している²⁸。MPNSTはシュワン細胞系に由来するため、H&E染色切片の肉眼検査または明視野顕微鏡検査により、腫瘍が末梢神経から発生するか、既存の良性PN内に発生するかを判断します。MPNSTは末梢神経またはPNと関連していない場合にみられるが(通常、解剖中の神経からの不注意な分離、MPNSTの異常増殖による既存のPNの破壊、または病変が転移性であるため)、腫瘍が神経またはPNと関連していない場合は診断の可能性が低いため、腫瘍と神経またはPNとの関連を探す。
2. 潜在的なMPNSTを含むパラフィンブロックから4〜5μmの切片を調製し、ステップ2.2.1の説明に従って正に帯電したスライドに取り付けます。手順2.2.2-2.2.6の説明に従ってセクションのパラフィンを解除します。
3. ステップ3.3.1-3.3.15に記載の表 2 に示した抗体のパネルを用いて免疫組織化学を行う。
4. 明視野顕微鏡で免疫染色を調べます。MPNSTはシュワニアン分化を示すため、S100β、ネスチン、およびSox10の均一または斑状の免疫反応性を探します。腫瘍がこれら3つのマーカーに対して陽性でない場合は、 表2 を参照して診断を確定する。
   注:ヒトとマウスのMPNSTは、異なる分化を示すことができます。例えば、一部のヒトMPNSTは限局性横紋筋芽細胞性分化を示す(これらの多様体は悪性トリトン腫瘍として知られている)。これらの新生物はシュワニアンマーカーのために染色されますが、デスミン、MyoD1、ミオゲニンなどの筋肉マーカーも発現します。これらの後者のマーカーに対する免疫反応性は、研究者が腫瘍をMPNSTとして診断することを思いとどまらせるべきではない。滑膜肉腫の病因をモデル化するために、SS18-SSX融合遺伝子を条件付きで発現する複数のマウスモデルが確立されているが²⁹、我々の知る限り、同等の融合転写産物を自発的に生成する滑膜肉腫モデルは知られていない。したがって、GEM腫瘍におけるSS18-SSX融合転写産物は探さず、代わりに免疫組織化学的プロファイルに依存しています。

5. MPNSTのグレーディング

1. WHOグレードIVのMPNSTの特徴である腫瘍壊死が存在するかどうかを判断します。グレード IV の MPNST では、顕著な細胞過細胞性、活発な有糸分裂活性 (10 個の高出力 (40 倍) フィールドあたり ≥4 個の有糸分裂)、および細胞学的異型を探します。
   1. 壊死が認められない場合は、腫瘍を評価して、細胞性亢進、活発な有糸分裂活性、および細胞学的異型が存在するかどうかを判断します。壊死がない状態でこれらの特徴がすべて存在する場合は、腫瘍をWHO悪性度IIIのMPNSTとしてグレード付けします。
   2. WHO悪性度IIの腫瘍は細胞性が増加していることを特徴とするが、WHO悪性度IIIおよびIVのMPNSTよりも程度は低い。WHOグレードIIのMPNSTにおける腫瘍細胞の核は、サイズの増加(神経線維腫における腫瘍細胞核のサイズの3倍以上)および色素過多症を示す。有糸分裂活性の増加(10高出力フィールドあたり<4個の有糸分裂)は、WHO悪性度IIの腫瘍と関連しているが、必要条件ではない。
      注:高悪性度腫瘍は通常、低悪性度から進行するため、低悪性度領域と高悪性度領域が同じMPNSTに存在する可能性があります。この状況では、腫瘍の悪性度は存在する最高悪性度領域によって決定されます。
      注:上記のWHOの等級付けシステムが患者の転帰を予測できるかどうかについては、人間の病理学者の間で論争があり、これらの病理学者の中には、MPNSTを単に低悪性度または高悪性度に分類することを好む人もいます。このスキームでは、高悪性度MPNSTは、顕著な細胞学的異型、活発な有糸分裂活性(10高出力フィールドあたり>5有糸分裂)、および壊死の有無にかかわらず顕著な細胞過細胞性を示します。低悪性度MPNSTは壊死を欠くが、有糸分裂活性、細胞学的異型、および高悪性度MPNSTと生物学的可能性が不明な非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBP)の中間の細胞性を示す。ANNUBPと低グレードのMPNSTを区別することは、これらのエンティティの経験が長くない調査員にとって難しい場合があるため、上記のシステムを好みます。

6. 早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の培養液の調製

1. 新鮮な腫瘍片2から早期継代P0-GGFβ3腫瘍細胞を培養する(ステップ1.5、図1A)。この時点から無菌状態を維持します。
   1. 腫瘍を小片(2〜4 mm)に切断し、100 mmの組織培養皿に10%のウシ胎児血清、2 μmol/Lのフォルスコリン、および10 nmol/Lのニューレグリン1β(NRG1β)を含むDMEM10(ダルベッコの最小限の必須培地)でミンチすることにより、腫瘍を解離します。
   2. ミンチにした組織断片から、プレートがコンフルエントになるまで、5%_CO2中37^°Cで細胞を増殖させます。3〜4日ごとにメディアを交換してください。
   3. 細胞培養を分割します。100 mmディッシュから培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄します。みじん切りにしたティッシュを取り除き、廃棄します。PBSを除去し、0.25%トリプシン1 mLを室温で2〜5分間添加します。細胞の剥離を促進するには、プレートを軽くたたき、光学顕微鏡を使用して剥離を確認します。必要に応じてトリプシンのインキュベーションを延長します。
   4. 2 mLのDMEM10を添加してトリプシンを中和します。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、細胞を500× g で5分間ペレット化します。培地を取り除き、5 mLの新鮮なDMEM10をペレットに加えます。
   5. 細胞懸濁液をDMEM10を含む2〜4枚の100 mmディッシュに分配します。細胞を5継代以上(ステップ6.1.3および6.1.4)分割せず、フォルスコリンおよびNRG1βを含まないDMEMで維持します。将来の使用のために、継代2で細胞を凍結することを忘れないでください。

7. 免疫細胞化学による早期継代MPNST細胞の同一性の検証

1. 滅菌済みの 18 mm #1.5 丸いガラスカバーガラスを 6 ウェル滅菌組織培養皿のウェルに入れます。
   1. ポリ-L-リジン/ラミニン溶液を、カバーガラスを覆うのに十分な量でウェルに入れます。蒸発を最小限に抑えるために、プレートをラップで密封します。4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、カバーガラスを滅菌PBSで3回洗います。
      注:早期継代のMPNST細胞をコーティングされていないカバーガラスに播種することを試みましたが、ポリ-L-リジン/ラミニンコーティングがない場合、細胞がうまく接着しないことがわかりました。
   2. 10,000個の細胞をカバーガラスに播種し、増殖培地に2 mLの細胞懸濁液をカバーガラスを含む各ウェルに静かに添加します。プレートを組織培養インキュベーターで5%_CO2 と37°Cで一晩インキュベートします。
   3. 翌朝、カバーガラスをPBSで2 x 5分間すすぎます。
   4. PBS中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を室温で18分間固定します。
   5. カバーガラスをPBSで3 x 5分すすぎます。必要に応じて、プラスチックフィルムを使用してプレートを密封し、この時点で4°Cで保管します。
   6. PBSで新鮮な50 mM NH₄Clを作ります。カバーガラスをPBS中の50 mM NH₄Clで室温で10分間インキュベートしてアルデヒドをクエンチします。
   7. カバーガラスを 0.3% Triton X-100 in PBS 溶液中で室温で 15 分間インキュベートし、細胞を透過処理します。カバーガラスをPBSで3 x 5分間洗浄します。
   8. カバーガラスをブロッキングバッファー(1%ウシ血清アルブミン、0.2%脱脂粉乳、0.3%Triton X-100を含むPBS1x)中で室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックします。
   9. ブロッキングバッファーを除去し、ブロッキングバッファー中で所定の最適希薄度に希釈した親腫瘍(典型的にはS100β、Nestin、およびSox10)に存在するMPNSTマーカーを認識する一次抗体を添加する。プレートをプラスチックフィルムで包み、加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
   10. PBSで3 x 5分間洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。ブロッキングバッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。 光から保護します。
   11. PBSで3 x 5分間洗浄します。カバーガラスを1〜5μgのヘキスト色素で10分間インキュベートします。
   12. カバーガラスをPBSで5分間洗浄します。1:1 1x PBS/グリセロールを使用してスライドをマウントします。蛍光顕微鏡で撮影した画像。

8.腫瘍原性を示すための早期継代腫瘍細胞の同種移植片

1. DMEM10中の早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。細胞を室温のハンクス平衡塩溶液(HBSS)で一度すすぎます。細胞を非酵素的細胞解離溶液で30秒〜1分間処理し、基質から除去します。非酵素的細胞解離試薬1 mLあたり5 mLのDMEM10を添加します。
   注:細胞の解離には、最大10〜20分と、はるかに長い時間がかかる場合があります。メーカーのプロトコルを参照してください。
   注:細胞をコンフルエントまで増殖させると、移植の有効性が低下するため、行わないでください。
   1. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞を5 × g で5分間スピンダウンし、DMEM10 100 μLあたり1〜2×10⁶ 細胞の濃度で再懸濁します。注入の準備が整うまで細胞を氷上に保管します。
   2. NOD-SCIDγ(NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ)マウスをイソフルラン気化器の誘導チャンバーで麻酔する。動物を胃の上に置き、注射部位を70%エタノールで殺菌します。注入する前に、部位を風乾させます。.注入前に、細胞を室温に戻します。
   3. 右脇腹に1-2 x 10⁶ 細胞を皮下注射します。寝具のないケージにマウスを一人で入れ、回復させます。低体温症を防ぐために、ケージの一部のみが加熱パッド上にあることを確認してください。これにより、マウスが過熱した場合に移動できるゾーンが提供されます。
      注:一部の移植片では採取できない可能性があるため、早期継代培養ごとに最低3匹のマウスを移植します。
   4. 移植片を15〜60日間成長させます。動物の健康状態を週に3回評価し、体重や行動の変化などの体調スコアを各検査で記録します。最大許容移植片サイズに達したマウスまたは瀕死のマウスを二酸化炭素安楽死とそれに続く子宮頸部脱臼を使用して終了します。死亡時の年齢を日数で記録します。腫瘍が外部から見えるようになったら、腫瘍の寸法(長さ、幅、高さ)を記録します。
      注:私たちの経験では、早期継代MPNST培養物が異なれば、さまざまな効率で移植片になり、移植片の成長に必要な時間も異なります。動物は、IACUCが承認した最大許容腫瘍サイズおよび/または人道的エンドポイントを超えて進行することを許可してはなりません。
2. 腫瘍を採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、セクション2.1-2.2.9の説明に従ってH&E染色を行い、同種移植片が反応性組織ではなく腫瘍であることを確認します。必要に応じて、親腫瘍に存在していたマーカーについて移植片を免疫染色します。

Results

図2は、P 0-GGFβ3マウスに生じる肉眼的に明らかな新生物の例を示す。肉眼で容易に識別できる腫瘍は、図2A(矢印)に示すように、腫瘤が体の領域を拡張させているように見えることがあります。新生物が末梢神経鞘腫瘍である可能性があるかどうかを判断する際には、腫瘍が末梢神経と関連していることを立証することが不可欠である。この場合、MRIスキャン(図2B)により、腫瘍が坐骨神経(矢印)と関連していることが実証されます。この関連は、マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖した後に確認された。大きなサイズは必ずしも腫瘍が悪性であることを示すものではないことに注意すべきです。この場合、腫瘍の組織学的検査(図2C)により、腫瘍が神経線維腫であることが実証された。しかしながら、最も一般的には、肉眼的に明らかな腫瘍は、マウスの剖検を行うまで同定されない。図2Dは、この動物の腕神経叢内に生じた大きな肉質のMPNSTを示しています。

図3は、プロトコルセクション1に概説されている手順に従って調製されたP 0-GGFβ3マウス由来のMPNSTおよび神経線維腫の代表例を示す。図3A-Jは、_P0-GGFβ3マウスコロニーから独立して発生したMPNSTの10例を示しています。MPNSTの組織学的外観は、同じ動物で独立して発生するMPNST間でも、大きく変動する可能性があることに注意してください。この組織学的変動性は、免疫組織化学的染色でP 0-GGFβ3 MPNSTSの診断を日常的に確認する理由を示しています。また、明らかに無関係な他の腫瘍型が、一部の近交系マウス系統で低頻度で散発的に発生することを指摘し(例えば、C57BL/6Jバックグラウンドで導入遺伝子を持つP 0-GGFβ3マウスでリンパ腫に数回遭遇した)、腫瘍の診断を確認するために免疫組織化学を使用することの重要性をさらに強調する。組織学的外観のばらつきにもかかわらず、図3A-Jに示した10個の腫瘍はすべて、S100βおよびネスチンに対して免疫反応性であり、他の腫瘍型のマーカーに対しては陰性であった。図3Kは、適切に脱灰された脊柱および関連組織の代表的な画像を示す。脊髄、神経根、椎体、骨格筋はすべて、互いに適切な解剖学的関係を維持していることに注意してください。図3Lは、椎体とその上にある脊髄の高倍率画像です。この組織は適切に脱灰されているため、骨は細断されたり折りたたまれたりすることなく簡単に切断でき、骨髄は骨髄腔内で容易に識別できます。組織が適切に脱灰されていなかった場合、ミクロトームの刃に引っかかって切片から引き裂かれ、隣接する組織(脊髄、脊髄神経根、骨格筋)に大きな損傷を与えていたでしょう。図3Mは、P 0-GGFβ3マウスの背側神経根内に発生する神経線維腫の代表的な画像を示す。この腫瘍は、図3A-Jに示したMPNSTよりも細胞性が低いことに留意されたい。神経線維腫の重要な診断は、神経に浸潤して軸索をばらばらに広げる神経周囲様要素、マクロファージ、線維芽細胞、および神経周囲様要素の複雑な混合物で構成されていることです。

図4は、網状神経線維腫の初期同定、および網状神経線維腫とMPNSTの鑑別に最も有用な染色の例を示しています。図4Aは、P 0-GGFβ3叢状神経線維腫におけるS100β免疫反応性を示す。S100β免疫反応性は細胞の亜集団においてのみ明らかであり、これは神経線維腫が腫瘍性シュワン細胞と他の非腫瘍性要素(線維芽細胞、肥満細胞、マクロファージ、神経周囲様細胞、定義が不十分なCD34免疫反応性細胞集団、および血管系)の混合物で構成されるという事実と一致していることに留意されたい。残念ながら、斑点状のS100β染色では、MPNSTではS100β染色が斑状になる可能性があるため、網状神経線維腫とMPNSTを区別できません(ただし、MPNSTは通常、網状神経線維腫よりも細胞性が高いため、H&E染色はこの目的に有用です[図3を参照])。腫瘍性シュワン細胞は、図4Bに示したP 0-GGFβ3 MPNSTで実証されているように、中間フィラメントネスチンに対しても免疫反応性を示します。また、腫瘍性シュワン細胞は、図4CのMPNSTに示されているように、転写因子Sox10に対して核免疫反応性を示すことが多い。網状神経線維腫とMPNSTの鑑別に有用な特徴は、肥満細胞の存在とKi67増殖マーカーに対する顕著な免疫反応性である。図4Dは、P 0-GGFβ3網状神経線維腫に対して実施されたウンナ染色を示しており、肥満細胞の存在を強調しており、肥満細胞は、細胞質顆粒の顕著な異染色性紫色染色によって容易に識別できる。肥満細胞はMPNSTには存在しません。対照的に、Ki67免疫反応性は、図4Eに示すP 0-GGFβ3腫瘍に見られるように、叢状神経線維腫では事実上存在しない。核Ki67標識は、P 0-GGFβ3マウスの三叉神経節に生じる顕微鏡的MPNSTに見られるように、腫瘍細胞の非常に高い割合に典型的に存在します(図4F)。

図5 は、新たに開発されたGEMモデルにおいて、神経線維腫の細胞組成を完全に特徴付けるために行う染色の例を示しています。この図に示されている染色はヒトの皮膚神経線維腫で得られたものですが、外観はGEM腫瘍で見られたものと同じです。CD117(c-Kit)の免疫反応性は、神経線維腫内の肥満細胞に存在するため、ウンナ染色で見られる分布と非常によく似た分布をしています(図3Aを参照)。マクロファージは、汎マクロファージマーカーIba1( 図5Dを参照)に見られるように、神経線維腫全体に散在して存在します。これには、CD163およびCD86に対して免疫反応性を示すマクロファージのサブクラスが含まれます(それぞれ 図5B および 図5Cを参照)。神経線維腫におけるシュワニアン元素の一部も、Sox10の核免疫反応性を示しています。線維芽細胞は、TCF4に対する免疫反応性によって強調することができます。 図5Gでは、CD31は神経線維腫内の血管要素を標識しているが、 図5Hで示されているCD34は、常在組織マクロファージの亜集団³⁰ 、またはシュワン細胞でも線維芽細胞でもない神経鞘細胞の新規集団³¹のいずれかであることが示唆されている細胞の謎めいた樹状突起集団を標識している。

図6は、ヒト網状神経線維腫およびMPNSTとP 0-GGFβ3マウスにみられる腫瘍との比較を可能とし、MPNSTと混同される可能性のあるヒト腫瘍型の代表例を示すために含まれる。 図6Aは、NF1患者の腕神経叢に発生した叢状神経線維腫を示し、 図6Bは、この同じ網状神経線維腫内で発生したWHOグレードIVのMPNSTを示しています。図6Bは、著しい細胞過細胞性および細胞異型、活発な有糸分裂活性、および腫瘍壊死を含む、WHOグレードIVのMPNSTの特徴的な特徴のいくつかを示している。比較のために、図6Cは、著しい細胞異型を有するが、グレードIVのMPNSTよりも細胞過多が少なく、有糸分裂が存在するが、有糸分裂活性が低いWHOグレードIIのMPNSTを示している。図6Dは、腫瘍細胞の鞘が織り交ぜられた特徴的な「ヘリンボーン」パターンを有する線維肉腫を示している。ただし、一部のMPNSTは同様のパターンを持つため、このパターンは必ずしも線維肉腫とMPNSTSを区別するものではありません。さらに、図6Eに示した高倍率の図は、図6Bに示したWHOグレードIVのMPNSTに見られるものと類似した細胞形態を示しています。図6Fは平滑筋肉腫を示す。ほとんどのMPNSTとは異なり、平滑筋肉腫は平滑筋アクチンやデスミンなどの筋マーカーに対して免疫反応性である。ただし、平滑筋アクチンの免疫反応性は腫瘍ごとに異なり、一部の腫瘍は強い均一な免疫反応性を示し(図6G)、他の腫瘍は腫瘍内の細胞変動を示す免疫反応性を示します(図6H)。デスミンの免疫反応性は、平滑筋肉腫でも斑状になることがあります(図6I)。黒色腫の形態は大きく異なり、多角形細胞(図6J)で構成される腫瘍もあれば、MPNST細胞の形態を模倣できる紡錘細胞で構成される腫瘍もあります。黒色腫は、MART1などのメラノソームマーカーに対する免疫反応性によってMPNSTと区別できます(図6K)。しかし、MPNSTと同様に、黒色腫はS100βおよびSox10陽性であることが多い(図6L)。

図7は、P0-GGFβ3マウスから単離されたWHOグレードII、III、およびIVのMPNST(MPNST)の病理学的特徴を示しています。図8は、低出力(図7A)および高出力(図7B)での早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の代表的な画像を示しています。これらの細胞の腫瘍原性は、軟寒天培地に懸濁した場合にコロニーを形成する能力(図7C)と、免疫不全マウスで皮下同種移植した場合に移植片を形成する能力(図7D)の両方によって実証されています。

図1:P 0-GGFβ3マウスの腫瘍およびその他の組織を処理するために使用されるワークフロー。 (A)肉眼的に見える腫瘍を採取し、1)4%パラホルムアルデヒドでの固定とそれに続く免疫組織化学および組織化学、2)早期継代腫瘍細胞培養および/またはゲノム解析の確立、および3)タンパク質、DNA、またはRNAの分離のための液体窒素を使用した急速凍結のために、3つの部分に分割されます。(B)腫瘍の切除後、マウスの体を4%パラホルムアルデヒドで固定し、内臓を切除する。これらの臓器は、新生物およびその他の病理学的プロセスの顕微鏡的証拠を特定するために実行される組織学的検査のためにサンプリングされます。(C)内臓の摘出後、四肢(頭、手足、尾)と皮膚を死骸から取り除く。脊柱、隣接する肋骨、および隣接する骨格筋は、0.3 M EDTA/4% パラホルムアルデヒド(pH 8.0)を使用して脱灰されます。次に、脱灰組織をパラフィン包埋し、免疫組織化学的および組織化学的検査のために組織切片を調製します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:P 0-GGFβ3マウスにおける肉眼的に明らかな神経線維腫およびMPNSTSの代表的な画像。 (A)右脇腹に大きな肉眼的腫瘍を有するP_0-GGFβ3マウス(矢印)。(B)このマウスのMRIスキャンは、腫瘍が坐骨神経(矢印)に接続されており、その上にある筋膜を通って皮下(矢印、バルク腫瘍塊)内で拡大していることを示しています。(C)この腫瘍の顕微鏡検査は、その大きさにもかかわらず、腫瘍が神経線維腫であることを示しています。(D)P 0-GGFβ3マウスの上腕神経叢に発生した大きな肉質MPNST。スケールバー = 100 μm. (C).略語:MPNSTs = 悪性末梢神経鞘腫瘍;MRI = 磁気共鳴画像法。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:プロトコルセクション1に記載されているように調製されたMPNST、脱灰脊柱、神経線維腫の代表的な画像。(A-J) 切除およびH&E染色されたP 0-GGFβ3 MPNSTは、組織学的変動を示す。すべてのイメージは独立して発生する MPNST です。この組織学的変動にもかかわらず、これらの腫瘍はすべて、表1に示したMPNSTマーカーに対して適切な標識を示した。スケールバー = 200 μm。 (K)脱灰脊柱のH&E染色断面の代表画像。この画像では、次の構造が簡単に視覚化されます。脊椎骨;背側脊髄神経根の背根神経節。傍脊椎骨格筋。倍率4倍(L)Kに示す脊髄と椎骨の高倍率画像は、この方法論で脱灰した後の骨の適切な外観を示しています。倍率10倍(M) P 0-GGFβ3マウスにおける背側神経根神経線維腫の代表画像。倍率40倍スケールバー = 100 μm。略語:MPNSTs = 悪性末梢神経鞘腫瘍;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:網状神経線維腫の初期同定とMPNSTとの鑑別に用いられた診断染色剤。 (A)P 0-GGFβ3網状神経線維腫におけるS100βの免疫染色。この抗原の強い褐色染色は、この腫瘍の細胞のサブセットにのみ存在し、神経線維腫が腫瘍性シュワン細胞および他の複数の非腫瘍性細胞型から構成されるという事実と一致していることに留意されたい。(B)中間フィラメントネスチン(赤)を染色し、ビスベンズイミドで対比染色したP 0-GGFβ3 MPNSTの免疫蛍光画像(青、核染色)。(C)転写因子Sox10を染色したMPNST。強い免疫反応性(褐色)は、腫瘍細胞のサブセットの核で明らかです。(D)ウンナ染色後のP 0-GGFβ3網状神経線維腫の高倍率図。この染色は、肥満細胞の顆粒の異染色(紫色)染色を生成します。叢状神経線維腫は、MPNSTには肥満細胞がないため、MPNSTと区別できます。(E、F)(E)A P 0-GGFβ3 叢状神経線維腫および(F)A P_0-GGFβ3 MPNSTにおけるKi67免疫組織化学。両方の切片はヘマトキシリン(青色の核染色)で対比染色されており、これらのイムノペルオキシダーゼ染色ではKi67の免疫反応性が褐色の核染色として明らかです。叢状神経線維腫では褐色の核染色は認められないが、MPNSTでは腫瘍細胞核のほとんどが陽性である。スケールバー = 100 μm。略語:MPNST = 悪性末梢神経鞘腫瘍。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:神経線維腫を構成する細胞の亜集団を同定するために使用される免疫染色の代表的な画像。 ヒト皮膚神経線維腫由来のこれらの免疫蛍光画像は、(A)CD117(c-Kit;肥満細胞のマーカー)、(B)CD163(M2マクロファージ)、(C)CD86(M1マクロファージ)、(D)Iba1(汎マクロファージマーカー)、(E)Sox10(シュワン細胞マーカー)、(F)TCF4(線維芽細胞マーカー)、(G)CD31(血管系マーカー)、および(H)CD34(神経線維腫における細胞の明確でよく理解されていない亜集団を示す)。倍率60倍、スケールバー=200μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:叢状神経線維腫、MPNST、およびMPNSTの鑑別診断で考慮されるその他のヒト腫瘍タイプの代表的な画像。 (A)NF1患者の腕神経叢に発生する叢状神経線維腫で、この新生物の全体的な細胞性の低下と良性の外観を示しています。H&E染色切片では容易に可視化できませんが、細胞の種類が複雑に混ざり合っています。有糸分裂は見られません。倍率:40倍。 (B) Aに示した叢状神経線維腫から発生したWHOグレードIVのMPNST。細胞性がはるかに高いことに注目してください。矢印は有糸分裂像を示し、アスタリスクはこの顕微鏡野の右上部分の腫瘍壊死の領域を示す。倍率:40倍(C)WHOグレードII.MPNST。この腫瘍は、 Bに示したWHO悪性度IVのMPNSTよりも細胞性の程度が低い。しかし、 Aに示した網状神経線維腫で明らかなよりも多くの核異型および色素過多症がある。矢印は、この新生物で遭遇した時折の有糸分裂像の1つを示しています。倍率:63倍。 (D)成人型線維肉腫の低倍率図で、この腫瘍型に典型的に見られる「ヘリンボーン」パターン(腫瘍細胞の織り交ぜられた鞘)を示す図。残念なことに、ヘリンボーン構造は一部のヒトMPNSTでも見られるため、線維肉腫とMPNSTの鑑別には使用できない。 倍率:20倍。 (E) Dに示した線維肉腫の高倍率図。この線維肉腫の細胞形態と、 Bに示したWHO悪性度IVのMPNSTで明らかな細胞形態との類似性に留意されたい。倍率:40倍 (F)平滑筋肉腫の高倍率画像で、MPNSTで見られる変動範囲内の細胞形態を示しています。 倍率:40倍。 (G)平滑筋肉腫における平滑筋アクチンの免疫染色( F)腫瘍細胞は、この抗原に対して均一な強い免疫反応性を示すことに注意してください。倍率:40倍。 (H)別の平滑筋肉肉腫における平滑筋アクチンの免疫染色。この腫瘍では、免疫反応性の程度に大きなばらつきがあり、一部の細胞は他の細胞よりも強く染色されます。同じ抗原が1つの腫瘍に均一に存在し、異なる新生物の腫瘍細胞のサブセットにのみ存在する免疫反応性は珍しくありません。倍率:40倍。 (I)第3平滑筋肉腫におけるデスミンの免疫染色。この腫瘍では、腫瘍細胞のサブセットのみがこの抗原に対して強く免疫反応性を示します。(J)転移性黒色腫。黒色腫は、立方体から紡錘形までの範囲で非常に多様な形態を持つことで有名です。後者の形態を有する腫瘍は、特に黒色腫とMPNSTの両方がS100βおよびSox10免疫反応性を示す可能性があることを考えると、MPNSTと混同される可能性が最も高い。倍率:40倍。 (K) Jに示した腫瘍における黒色腫マーカーMART1の免疫反応性。倍率:40倍。 (L)黒色腫における転写因子Sox10の核免疫反応性を J.倍率:40倍、スケールバー=100μm。略語:MPNST = 悪性末梢神経鞘腫瘍。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:WHOグレードII-IV P 0-GGFβ3 MPNSTの代表画像。 (A)WHOグレードIIのMPNSTの低倍率および(B)高倍率顕微鏡写真。細胞性は、パネルCに示されたWHO悪性度IIIのMPNSTよりも低く、Dの腫瘍細胞の核は、パネルBに見られるものよりも高色性(暗色)であることに留意されたい。(C)WHOグレードIIIのMPNSTの低倍率および(D)高倍率顕微鏡写真。この腫瘍は、10の高出力電界あたり>4個の有糸分裂像を示し、細胞はより密集し、より高色で非定型核であった。(E)WHOグレードIVのMPNSTの低倍率および(F)高倍率ビュー。パネルFの下部中央部分の壊死の焦点に注目してください。低消費電力 = 20倍、高出力 = 40倍、スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の代表的な画像と、軟寒天での増殖と同種移植片としての増殖能力によって実証された腫瘍原性。 (A)早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の低倍率および(B)高倍率位相コントラスト画像。(c)軟寒天培地で増殖し、スーダンブラックで染色したP 0-GGFβ3 MPNST細胞。コロニーは寒天の黒い点状として明白です。(D)P 0-GGFβ3 MPNST細胞を免疫不全マウスに皮下移植した後に形成された腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色画像。(E)Celigo Image Cytometerによって決定された5日間にわたる早期継代P 0-GGFβ3 MPNST細胞の増殖。低電力 = 10x、高電力 = 40x;スケールバー = 100 μm (すべてのパネル) この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

名前	使い	種の反応性/クラス
CD117の	希釈済み	ウサギモノクローナル
CD163の	1:200	マウスモノクロン
CD31の	1:50	ウサギポリクローナル
CD34の	1:2000	ウサギモノクローナル
CD86の	1:1000	ウサギモノクローナル
サイトケラチン	1 μg/mL	マウスモノクローナル
デスミン	1:50	マウスモノクローナル
伊場1	1:500	ポリクローナルウサギ
キ-67	1:50	ウサギモノクローナル
マート1	1 μg/mL	マウスモノクローナル
ネスティン	1:1,000	マウスモノクローナル
PMELの	1:100	ラボットモノクローナル
S100B型	1:200	ウサギポリクローナル
SMAの	1:100	マウスモノクローナル
ソックス10	1:10	マウスモノクローナル
TCF4/TCFL2	1:100	ウサギモノクローナル

表1:網状神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍の診断に使用される抗体。 GEM網状神経線維腫(S100β、Sox10、CD117、Ki67)のルーチン同定、MPNSTの診断、および神経線維腫に存在する他の細胞タイプの完全な評価に使用される抗体。略語:MPNST = 悪性末梢神経鞘腫瘍。

		S100β	ネスティン	ソックス10	マート1	PMELの	デスミン	平滑筋アクチン	サイトケラチン	SS18-SSXフュージョン
MPNSTの		50-90%、通常は焦点	ポジティブ1	~30%	－	－	－	－	－	－
線維肉腫		－	－	－	－	－	－	－	－	－
平滑筋肉腫		珍	－	－	－	－	50-100%	＋	~40%	－
上皮性肉腫		－	－	－	－	－	－	－	＋	－
黒色腫		＋	＋	85%	＋	＋	－	－	－	－
単相性滑膜肉腫		~30%	－	－	－	－	－	－	＋	＋

表2:ヒトにおける腫瘍の同一性を確立するために使用されるマーカー。 これらの免疫組織化学的マーカーおよび組織化学的マーカーは、腫瘍の顕微鏡的形態の評価とともに、MPNSTをそれらを模倣する他の新生物と区別するために使用される。ヒトMPNSTで一般的に考慮される鑑別診断には、成人型線維肉腫、上皮性肉腫、平滑筋肉腫、単相性滑膜肉腫、および黒色腫が含まれる。成人型線維肉腫では、顕微鏡的にヘリンボーンパターンがあり、ビメンチンを染色するが、S100βは認められない。平滑筋肉腫はMPNSTではなく、デスミンに対して免疫反応性である。平滑筋肉腫には、末端が著しく鈍い形態の核もあります。上皮性肉腫はMPNSTではなく、サイトケラチンに対して免疫反応性である。黒色腫は、MPNSTと同様にS100β陽性である可能性があるが、MART-1およびPMELに対しても免疫反応性である。略語:MPNST = 悪性末梢神経鞘腫瘍。 ¹S100βとネスチンの組み合わせは、MPNSTを高度に予測します。

Discussion

ここで紹介する組織学的および生化学的方法は、神経線維腫およびMPNSTの病因のGEMモデルを診断および特徴付けるためのフレームワークを提供します。何年にもわたって、これらの方法論は、GEMモデルで発生する末梢神経鞘腫瘍の病理を評価するのに非常に有用であることがわかりました^21、25、26。しかしながら、ここで概説するプロトコルは、GEMモデルにおける腫瘍がヒトの腫瘍の病理をどの程度正確に再現しているかを判断するのに有用であるが、これらの戦略にはいくつかの限界があり、それを評価すべきである。まず、P 0-GGFβ3マウスは腫瘍表現型のほぼ完全な浸透度を示すため、ゲノム研究やゲノムスケールのshRNAスクリーニングに使用できる神経線維腫およびMPNST21,25,26のマウスを比較的容易に大量に入手することができます。また、このモデルにおける表現型の浸透度が高いため、P 0-GGFβ3マウスは前臨床試験に非常に有用です。ただし、これはすべてのGEMがんモデルに当てはまるわけではないことを認識する必要があります。そのため、腫瘍の発生が予測できる動物の割合を決定することの重要性を強調してきました。腫瘍の発生頻度が低い動物モデルを扱う場合、磁気共鳴画像法や陽電子放射断層撮影法などの画像診断法を使用して、前臨床試験やその他の研究に参加できる腫瘍を持つ動物を明確に同定することが有利であることがわかりました。ただし、このアプローチは、スキャンを繰り返す必要がある場合は、コストがかかりすぎる可能性があります。このため、関心のあるGEMモデルの平均生存期間を確立することの重要性も強調しました²⁶ 動物が腫瘍を発症することが予想される時期を理解することで、目的の表現型を持つ動物を特定するために必要なスキャンの数と関連コストが削減されます。

また、マウスの大きな腫瘍は、実際にはまだかなり少量の組織であることを認識することも重要です。このプロトコルでは、腫瘍組織を3分の1に分割し、組織学/免疫組織化学、早期通過細胞培養の確立、および関心のある生体分子(タンパク質、RNA、DNA)の単離に充てるプロセスを推奨します。ただし、腫瘍の大きさはさまざまであり、腫瘍が非常に小さい場合は、この方法で分割するのに十分な組織を持つことを妨げる可能性があります。その場合、研究者は、腫瘍の診断または腫瘍組織の別の使用が優先されるかどうかを決定する必要があります³²。このような状況下では、他の実験に着手する前に、自分が何に取り組んでいるのかを理解するために適切な診断を受けなければならないというバイアスがかかっています。腫瘍の診断は、通常、新生物の3分の1未満で容易に確立できることがわかった。小さな腫瘍を扱う場合、代わりに、通常、腫瘍組織の小さな断片を除去し、組織学組織で包み、組織カセットに入れて、処理中に組織が失われないようにします。このアプローチの欠点は、WHOの等級付けが必要な場合、研究者が新生物を過小評価する可能性があることです。これは、がんには一般的に低悪性度領域と高悪性度領域が共存しており、非常に少量のサンプルを採取した場合、得られる悪性度は腫瘍サンプルがどこから採取されたかによって異なるためです。

末梢神経鞘腫瘍の同一性を確立するために我々が記述するプロトコルは、免疫組織化学に大きく依存している。一部の細胞型に使用できる代替アプローチ(例えば、肥満細胞を同定するためのUnna染色の実施)は時折ありますが、それは神経線維腫およびMPNSTに存在するほとんどの細胞型に一様に当てはまるわけではありません。したがって、使用される免疫組織化学的手順が適切に最適化されていることを確認するために細心の注意を払う必要があります。私たちの経験では、いくつかの問題が診断免疫組織化学を損なう可能性があります。治験責任医師は、これまで使用したことのない一次抗体で希釈シリーズを実行することが非常に重要です。さらに、以前に最適化された抗体の新しいバッチを使用する場合、希釈系列を実行する必要があります³³。また、新しい試薬のバッチが手元にあることを確認するためにも注意を払う必要があります。私たちの経験では、過酸化水素とDABが老化すると、特に適切に機能しなくなる傾向があり、研究者がそれらの汚れが陰性であると不適切に判断する可能性があります。

網状神経線維腫、MPNST、およびMPNSTの鑑別診断で考慮されるさまざまなタイプの新生物について説明する免疫組織化学的プロファイルは、私たちが最も一般的に遭遇したものです^{21、25、26、34}。ただし、MPNSTやその他の悪性腫瘍では異なる分化は珍しくないため、研究者はここで説明するものとは多少異なる染色プロファイルに遭遇する可能性があります。これらの微妙な違いは、腫瘍形成の新しいGEMモデルを特徴付けるチームには、経験豊富な人間または獣医の病理学者を含めることを強くお勧めする理由です。このプロトコルでは、GEMおよびヒトMPNSTにWHOグレーディングを適用しました。グレーディング基準が比較的明確に定義されており、ヒトとマウスのMPNSTを簡単に比較できるため、このグレーディングシステムを好む^2,28。ただし、WHOの等級付け基準は病理学者によって一様に受け入れられているわけではないことに注意してください。これは、MPNSTに適用される3つのWHOグレードが患者の臨床転帰を予測できるかどうかが明確ではないためです。そのため、多くの病理医はMPNSTを単に低悪性度または高悪性度の悪性腫瘍として分類することを好みます。このアプローチを使用すると、MPNSTの約85%は、活発な有糸分裂活性、著しい細胞異型、および腫瘍壊死を伴う可能性のある色素過色症を特徴とする高悪性度悪性度腫瘍と見なされます。低悪性度のMPNSTは、細胞性、色素過多、および有糸分裂活性が低いことを示します。

我々は、早期継代MPNST細胞を同種移植することが、これらの培養物の腫瘍原性を検証する簡単な手段であることを発見しました。しかしながら、細胞が同種移植片³²を確立しない場合には、いくつかの問題を考慮する必要がある。私たちの経験では、早期継代のMPNST細胞の圧倒的多数は同種移植片を確立しますが、そうでない早期継代培養物に遭遇することもあります。この失敗にもかかわらず、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)および全エクソームシーケンシングにより、これらの早期継代培養物には、腫瘍細胞と一致する複数のゲノム異常があることが実証されました^25,26。また、通常、接ぎ木のために収穫する前に培養物が合流することを許されたため、健全ではない早期継代培養も見つかりました。乱暴な取り扱い(例えば、非酵素的細胞解離溶液を過度に何度もピペットで上下にピペットでインキュベートした状態)によって損傷した細胞も、移植時の性能が低下します。また、移植片の確立に示した時間は、私たちの経験に基づく推定値であることに注意します。時折、同種移植片の確立に成功するが、それには長い時間がかかる早期継代培養に遭遇しました。

上記で概説したアプローチは、末梢神経系腫瘍の新しく開発されたGEMモデルの重要な側面を特徴付け、これらの動物が発症する神経線維腫およびMPNSTを適切に診断するための包括的な手段を提供します。早期継代MPNST培養を確立し、これらの培養物を同種移植に使用するために概説する方法も、GEMモデルで同定された新生物の腫瘍原性に関する明確な証拠を提供します。ここで強調しておきたいのは、初期の継代培養を確立する際に、個々のクローンの選択を行っていないことです。腫瘍細胞を培養物に入れる場合、ある程度の選択は避けられないと認識しているが、これらの初期知見は、早期継代GEM MPNST培養で同定された変異が、親腫瘍に存在する変異と非常に類似していることを示唆している。しかし、aCGHを用いて、これらの初期の継代培養をより長い継代のために運び続けると、これらの腫瘍細胞の初期の継代で見られるものから分岐し始めるゲノム変化が生じることもわかりました。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm 組織培養プレート	Corning Falcon	353003
3, 3'- ジアミノベンシジン (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic	Acid Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (ヤギ抗マウス)	Invitrogen	A21043 または A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
塩化アンモニウム (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
ウシ血清アルブミン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1600-100
カルデスモン	ABCAM	E89、ab32330
CD117	セルマーク	117R-18-ASR
CD163	カ	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
セルスクレーパー	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
サイトケラチン	ABCAM	C-11, ab7753
デスミン	・アジレント・ダコ	クローン D33 (M0760)
ジアミノベンシジン (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
グリセロール	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid Fisher	Scientific	A144-212
過酸化水素	Fisher Scientific	327-500
Iba1	和光ケミカルズ	019-19741
ImmPRESS HRP(ペルオキシダーゼ)ポリマーキット、マウスオンマウス	ベクターラボラトリーズ	MP-2400
ImmPRESS HRP(ペルオキシダーゼ)ポリマーキット、ウマ抗ウサギ	ベクターラボラトリーズ	MP-7401
インキュベーター	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 インキュベーター
イソフルラン	ピラマル	NDC 66794-017-25
イソプロパノール	フィッシャーサイエンティフィック	A415
Ki-67	細胞シグナル	12202
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017015
液体窒素
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
ミクロトーム
ネスティン	ミリポア	ヒト:MAD5236(10C2)、ヒト:MAB353(Rat-401)
ニューレグリン1ベータ	社内	S.L.C.製(R&から396-HB-050 / CFとしても入手可能)Dシステム)
ニューロフィブロミン	・サンタクルーズ・バイオテクノロジー	sc-67
うなずく。CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ マウス	ジャクソン研究所	5557
脱脂粉乳	ウォルマート	グレートバリュー ブランド
P0-GGFβ3マウス	社内
フィンワックス	ライカ	パラプラスト 39601006
パラフィルム M	Sigma-Aldrich	PM-999
パラホルムアルデヒド (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
パーマウント (キシレン封入用剤)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Sevenエクセレンス、8603
リン酸緩衝生理食塩水(ダルベッコ)	コーニング	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2)、ab137078
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩	シグマ-アルドリッチ	P5899-5MG
ポータブルアイソフルランスマシン	VetEquip吸入麻酔システム
PVA-DABCO(水性マウントメディウム)	ミリポアシグマ	10981100ML
炊飯器	ブナハミルトン
S100B	アジレントダコ	Z0311 (現 GA504)
SMA	ベンタナメディカルシステムズ	クローン1A4
塩化ナトリウム	ッシャーサイエンティフィ	S640
エン酸ナトリウム(二水和物)	フィッシャーサイエンティフィック	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
鋼組織学金型
スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ	ッシャーサイエンティフィック	12-550-15
TCF4 / TCFL2	細胞シグナル伝達	(CH48H11) #2569
ティッシュカセット
トルイジンブルー	ACROS Organics 348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31