フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

Summary

ここでは、マイクロRNAパッケージングと細胞外小胞(EV)への輸出のダイナミクスを研究するために、蛍光標識されたマイクロRNAの存在量の in vitro 評価を可能にする簡単なプロトコルについて説明します。

Abstract

細胞外小胞(EV)は、さまざまな細胞から分泌される細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。これらのEVは、タンパク質、脂質、核酸(DNA、mRNA、マイクロRNA、その他のノンコーディングRNA)などの生理活性分子をある細胞から別の細胞にシャトルし、レシピエント細胞に表現型の結果をもたらします。さまざまなEVカーゴの中でも、マイクロRNA(miRNA)は、EVに明らかな調節不全と存在量があるため、微小環境の形成やレシピエント細胞の教育に果たす役割で大きな注目を集めています。追加のデータは、多くのmiRNAがEVに能動的にロードされていることを示しています。このような明確な証拠があるにもかかわらず、miRNAの輸送動態や選別機構に関する研究は限られています。ここでは、EV-miRNAローディングの動態を理解し、miRNAの輸送に関与するメカニズムを特定するために使用できる、EV-miRNAのフローサイトメトリー解析を用いたプロトコルを提供します。このプロトコルでは、EVで濃縮され、ドナー細胞から枯渇するようにあらかじめ決められたmiRNAは、蛍光色素に結合し、ドナー細胞にトランスフェクトされます。次に、蛍光標識されたmiRNAを、qRT-PCRを用いてEVへのロードと細胞からの枯渇について検証します。トランスフェクションコントロールおよびトランスフェクションされた細胞集団をゲーティングするためのツールの両方として、蛍光標識された細胞RNA(細胞保持およびEV枯渇)が含まれています。EV-miRNA と cell-retained-miRNA の両方をトランスフェクションした細胞は、72 時間にわたって蛍光シグナルについて評価されます。EV-miRNAに特異的な蛍光シグナル強度は、細胞保持miRNAと比較して急速に減少します。この簡単なプロトコルを使用することで、miRNAローディングのダイナミクスを評価し、miRNAをEVにロードするさまざまな要因を特定することができます。

Introduction

マイクロRNA(miRNA)は、転写後遺伝子制御における重要な役割で知られる低分子ノンコーディングRNAのサブセットの中でも、最もよく特徴付けられているものの1つです。ほとんどのmiRNAの発現と生合成は、核内の一次miRNA(pri-miRNA)の転写から始まる一連のイベントが調整されています。マイクロプロセッサ複合体による前駆体miRNA(pre-miRNA)への核プロセシングに続いて、pre-miRNAは細胞質に輸送され、RNase IIIエンドヌクレアーゼによってさらにプロセシングされ、21〜23ヌクレオチド成熟miRNA二本鎖にダイサー^{されます1。}プロセシングされた成熟miRNAの鎖の1本が標的メッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、標的の分解または翻訳抑制を引き起こします²。複数の多様な標的mRNAを同時に制御するmiRNAの多面的役割に基づけば、miRNAの発現が厳密に制御されていることは驚くべきことではありません³。実際、不適切な発現は、特に癌において、さまざまな病態の一因となります。miRNAの異常な発現は、疾患特異的な特徴を表すだけでなく、予後および治療の可能性の標的としても浮上しています^4,5,6。miRNAは、細胞内での役割に加えて、非自律的な役割も担っています。例えば、miRNAはドナー細胞によって選択的にEVにパッケージ化され、レシピエント部位に輸送され、正常生理学および疾患生理学において多様な表現型応答を誘発することができる^7,8,9。

EV関連miRNAが機能的な生体分子であるという明確な証拠があるにもかかわらず、miRNAの特定のサブセットが癌などの疾患状態でどのように調節不全になっているか、また細胞機構がどのようにmiRNAを選択してEvに分類するかは完全には解明されていません^10,11。微小環境の調節におけるEV-miRNAの潜在的な役割を考えると、細胞間コミュニケーションと疾患の病因におけるEVの役割を完全に解明するためには、特定のmiRNAの輸送に関与するメカニズムを特定することが重要です。EVへのmiRNA放出のプロセスを理解することは、miRNA輸出の重要なメディエーターを明らかにするだけでなく、潜在的な治療法への洞察も提供することができます。このレベルの知識を得るには、これらの新しい実験的問題に忠実に取り組むようにツールを適応させる必要があります。実際、EVを評価する研究は、新しい技術や制御の導入により、指数関数的に増加しています^12,13。EVに輸出されるmiRNAの豊富さを評価するには、次世代シーケンシングと定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)が現在の標準的なツールとなっています。これらのツールは、EV中のmiRNAの存在量を評価するのに有用ですが、感度や特異性には限界があり、これらの静的なアプローチで動態を評価するには不十分です。EVへのmiRNAの輸送動態を解明するには、特殊なツールを組み合わせる必要があります。ここでは、ドナー細胞からのmiRNAの放出とEVへの取り込みの動態を解析するために、蛍光標識miRNAを用いた包括的なプロトコールを紹介します。また、この方法の利点と制限についても説明し、最適な使用のための推奨事項を提供します。この論文で紹介する汎用性の高い方法は、EVへのmiRNA放出と、細胞のコミュニケーションと疾患における潜在的な役割の研究に関心のある研究者にとって有用です。

Protocol

注:この手法を使用するための前提条件として、選択的にエクスポートされた miRNA の同定と検証が必要です。細胞株は、EVにソートされたmiRNAカーゴによって異なるため、使用前に目的の細胞株および関連するEVのmiRNAを評価することをお勧めします。さらに、リポフェクタミンベースのトランスフェクションは、プロトコルの重要なステップの1つです。実験を設定する前に、トランスフェクション効率を事前に決定することをお勧めします。

1. 培養細胞の増殖と蛍光色素標識EV-miRNAによる細胞のトランスフェクション

1. 200,000〜400,000個の細胞を、適切な培地の6ウェルプレートの3重ウェルに播種します。プレートを静かに旋回させて、細胞の分布を均一にします。細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、約24〜48時間インキュベートします。
2. トランスフェクションするウェルごとに、製造元の指示に従って、トランスフェクション試薬を微量遠心チューブ内の無血清培地100 μLで希釈します。
   注:脂質の最適濃度は、このセットアップの前に、目的の細胞株について決定する必要があります。
3. トランスフェクションする各ウェルについて、蛍光色素標識EV-miRNA(2 nM)と細胞-miRNA(2 nM)を微量遠心チューブ内で100 μLの無血清培地で別々に希釈します。
   注:総容量は、トランスフェクションされたウェルの総数に対して計算する必要があります。このプロトコルでは、蛍光を7つの時点で評価しました。したがって、全容量は、ステップ1.2で700μL、ステップ1.3で700μLであった。さらに、細胞の陽性蛍光集団を確実に捕捉するには、非蛍光スクランブルmiRNAを細胞にトランスフェクションし、これらの細胞を除外するゲートを設定する必要があります。
4. 希釈したRNAミックス(ステップ1.3)を希釈トランスフェクション試薬(ステップ1.2)に加え、チューブを3〜4回反転させて穏やかに混合します。脂質とRNAを組み合わせたミックス液を室温(RT)で30分間インキュベートします。
5. 細胞から通常の培地を取り除き、各ウェルに800 μLの無血清培地を加えます。200 μLの脂質-RNAミックス液(ステップ1.4から)を細胞に静かに滴下します。
   注:Opti-MEM培地は、目的の細胞株(Calu6細胞)のトランスフェクションに使用しました。脂質-RNAミックスを培地に直接添加し、プレートの側面に添加しないようにしてください。

2. 蛍光解析のための様々な時点でのトランスフェクション細胞の回収

1. トランスフェクションした細胞を37°Cで7時間インキュベートします。
   注:両方のmiRNA(EV-miRNAおよび細胞-miRNA)の一貫したトランスフェクションを検証するために、トランスフェクションの3時間後に1つのウェルから細胞を採取し、フローサイトメーターを使用して蛍光を分析します。
2. 7時間のインキュベーション期間後、トランスフェクション複合体をウェルから取り出し、完全培地と交換します。
3. 7時間の時点を評価するには、細胞を回収し、1x PBSで細胞を3回洗浄します。
   1. 接着細胞を扱う場合は、1つのウェルに200 μLのトリプシンを添加し、細胞がプレートから剥離するのを待ちます。剥離した細胞を微量遠心チューブに移し、200xgで5分間遠心分離してペレット化します。
   2. 上清は、細胞ペレットを破壊しないように慎重に廃棄してください。最初のPBS洗浄では、ペレットを~500 μLの1x PBSに再懸濁し、上記の遠心分離ステップを使用してペレット化を繰り返します。PBS洗浄をさらに2回繰り返します。
   3. 細胞ペレットを200 μLの2%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に再懸濁し、蛍光を評価します。
      注:2%PFAを添加した後、細胞ペレットは4°Cで3〜4日間保存できます。
4. セクション 2.3 の手順に従って、残りの時点を収集します。保存されているすべての細胞ペレットを収集し、セクション3の手順に進みます。

3. 細胞内の細胞-miRNAおよびEV-miRNAシグナルのフローサイトメトリー解析

1. フローサイトメトリー解析用の細胞を調製します。セクション2の細胞懸濁液を丸底ポリスチレンFACSチューブの一部である35 μmのストレーナキャップでろ過し、蛍光色素分析を妨げる可能性のある破片や細胞凝集体を除去できるようにします。
2. 校正手順に従って機器をセットアップします。フローサイトメーターの電源を入れ、少なくとも30分間ウォームアップしてから使用してください。流路系をシース液でプライミングし、レーザーアライメントを確認および調整します。
3. 品質管理を実行して、装置の流路系を確認します。超高純度ろ過水をフローサイトメーターにロードし、適切な流量で十分な取得時間を確保します。
   注:適切な流速と取り込み時間は、対象とする細胞の種類、サンプルの複雑さ、および必要なデータ品質によって異なります。
4. フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを開き、検出器とレーザーの性能を確認します。閾値と電圧のパラメータを設定して、目的の細胞株と選択した蛍光色素に基づいて検出します。
   注:すべての下流の実験では、Calu6細胞を使用しました。
   1. FSC 5000 で Calu6 細胞のシグナルを捕捉するための閾値を設定します。各実験リピートについて、1 x 10⁴ セルの解析を実行します。
   2. 異なる蛍光色素間のスペクトルの重複を考慮するには、トランスフェクションされていない細胞と、1つの蛍光色素のみを独立してトランスフェクションした細胞を使用して、代償コントロールを設定します。
   3. miRNAの輸送の検出には、Alexa-fluor 488に結合した候補EV-miRNA(miR-451aおよびmiR-150)と、Cy3に結合したコントロール細胞miRNA(cel-miR-67)を使用します。
   4. 各EV-miRNAについて、蛍光色素を5p鎖の5'末端に結合させます。トランスフェクションの前に、蛍光色素分子標識鎖を100%相補的な3p鎖にアニーリングします。
   5. トランスフェクションした細胞の発現解析では、FSC、SSC、FITC、およびPEチャンネルをそれぞれ258、192、269、および423電圧単位に設定してサンプルを解析します(図1A、B)。
5. ネガティブコントロールサンプルをフローサイトメーターに導入します。カスタムワークシートで前方散乱光(FSC)と側方散乱(SSC)の強度を定義した後、細胞シグナルをキャプチャします。
6. プロットで、X 軸に FSC、Y 軸に SSC、対象母集団の周囲に多角形を描画してゲートを選択します ( 図 1B の下部パネルを参照)。
7. ゲート付き母集団を使用して新しいプロットを作成します。
   1. 細胞-miRNA 検出では X 軸を蛍光シグナル 1(FS1)に、EV-miRNA 検出では Y 軸を蛍光シグナル 2(FS2)に設定します。蛍光タグ付けされた各miRNAを独立してトランスフェクションした細胞を使用して、個々の蛍光色素の補正パラメーターを設定します。新しいプロットで、関心のある母集団をゲートします。
   2. EV-miRNAの検出には、FITCチャネルを使用します。細胞-miRNAシグナルの評価には、PEチャネルを使用します。ソフトウェアで、X軸にFITCを選択し、Y軸にPEを選択した場合に、二重蛍光集団の周囲にポリゴンを描画して、FITCとPEの両方が陽性の細胞の周囲にゲートを作成します。
8. ゲーテッド母集団の統計量を記録します。
   1. FITCとPEの両方が陽性であるゲート集団内の細胞の割合、およびFITCまたはPEのいずれかが陽性である細胞の割合を記録します。
9. 実験の追加のサンプルまたはコントロールについて、上記の手順を繰り返します。

4. トランスフェクションした細胞からのEVの単離

1. 血清含有培地で培養した細胞の場合は、血清からEVを枯渇させ、クロスコンタミネーションを防ぎます。
   1. EV枯渇血清を生成するには、細胞培養培地で血清を50%に希釈して粘度を下げ、得られた50%血清を110,000 x g で18時間遠心分離します。
   2. 上清(EVフリー血清)を注意深く回収し、0.2 μmのフィルターアセンブリを使用してろ過します。得られた50%EVフリーの血清を使用して、完全な培地(この場合はRPMIと10%の血清)を生成します。
   3. EVを回収するには、EVを枯渇させた完全培地を細胞に添加し、インキュベーションの48時間後にEVを回収します。
      注:以下に概説するプロトコルは、Kowal et ^al.14から変更されています。
2. 15cmの組織培養皿で細胞を80%のコンフルエントに増殖させます。プロトコルのセクション1のトランスフェクションプロトコルに従って、10 mLのOpti-MEMにcell-miRNAおよびEV-miRNAを別々に細胞にトランスフェクションします。
   注:すべてのトランスフェクションプロトコルが直線的にスケールアップするわけではありません。まず、15 cmプレートのトランスフェクション条件を適応させ、評価することが不可欠である場合があります。
3. 7時間後、トランスフェクション培地を吸引し、EV枯渇培地(15 mL)と交換します。EV枯渇培地中で細胞を48時間増殖させます。
4. 馴化培地を細胞から取り出し、バイオセーフティキャビネット内の50 mL遠心チューブに分注します。馴化培地を2000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、死細胞および細胞破片を除去します。得られた上清を新しいチューブに移します。
5. 上清を10,000 x g で4°Cで40分間遠心分離します。 上清を除去し、0.2 μmのフィルターアセンブリでろ過します。
6. ろ過した細胞培養培地をバイオセーフティキャビネット内の滅菌超遠心チューブに移します。チューブの重量を量り、互いにバランスを取ります。サンプルを 110,000 x g で 4 °C で 90 分間遠心します。 上澄みを捨てます。
7. ペレットを適切な容量の1x PBSで再懸濁し、110,000 x g で4°Cで90分間洗浄および遠心分離します。
   注:この EV ペレットは、この研究で使用した固定角ローターチューブで許容される最大容量に基づいて、60 mL の 1x PBS に再懸濁しました。
8. PBSを吸引し、EVペレットを適切な容量(50〜100μL)の新鮮な1x PBSとボルテックスに懸濁します。EVは後で使用するために-80°Cで保管してください。

5. EVにおける細胞-miRNAおよびEV-miRNAシグナルのフローサイトメトリー解析

1. フローサイトメトリー分析用に EV 懸濁液を調製するには、適切な量の限外ろ過 1x PBS で EV を希釈します。
   注:EV のフローサイトメトリー解析の負荷量は、サンプル中の EV の数に基づいて決定する必要があります。大まかに言うと、EV 懸濁液に ~30,000 個の粒子がある場合、最終容量は 1x PBS で ~500-600 μL になります。クリーンなサンプルには、約35〜50個の粒子/μLが含まれています。
2. ナノフローサイトメーターまたはナノサイズの粒子を分析するのに十分な強力な代替装置を使用してください。
   注:ここでは、Attune NxT ナノフローサイトメーターを使用しました。
3. ソフトウェアを開き、推奨される校正手順に従って機器をセットアップします。高性能ナノビーズを使用して 性能試験 を実施します。ナノビーズが標準サイズ範囲で検出されれば、性能は最適です。EVパーティクルの検出に適した流量を決定します。
4. 超純度ろ過水を使用して品質管理を行い、装置の流路系と検出器とレーザーの性能を確認します。
5. 実験に適したキャリブレーションビーズを使用して、異なるサイズのビーズを正確に検出し、蛍光シグナルを測定するようにフローサイトメーターを設定します。
   注:フローサイトメトリーによる EV 解析のセットアップには、ApogeeMix ビーズを使用しました。これらのビーズには、80 nmから1300 nmのサイズの非蛍光シリカビーズと蛍光ポリスチレンビーズの混合物が含まれています。
   1. パラメーターを設定して、メーカーのプロトコルに従って、ビーズミックス中のさまざまな集団の感度と分離能を評価します。適切なゲーティングを使用して、装置のノイズからビーズ集団を分離します。
6. 分析のためにロードする前に、サンプルを完全にボルテックスしてEVを均等に分散させます。
7. フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを開き、限外ろ過PBSを導入します。ステップ5.5のビーズに基づいて、ゲートが適切な粒子サイズに対応することを確認しながら、限外ろ過PBSを使用してEV粒子のゲートを設定します。
8. ネガティブコントロールサンプルをロードして、フローサイトメーターを通過するEVを分析します。X 軸に FSC、Y 軸に SSC をプロットしながら EV 信号をキャプチャします。
   注:EVをキャプチャするためのSSCしきい値は300に設定されました。取得量は、合計145μLの吸引量から95μLに設定しました。流速は12.5μL/minとした。分析は、1 x 10⁶ EV粒子で行いました。EVの個体数は不均一であり、EVとともに一部の破片が分離されます。FSC 対 SSC プロットの全体的な粒子検出では、さまざまな範囲の粒子が強調表示されますが、これは粗 EV 調製物を使用する場合に期待されます。
9. ゲート付き母集団を使用して新しいプロットを作成します。
   1. 今回は、X軸の細胞miRNA検出に蛍光シグナル1(FS1)、Y軸のEV-miRNA検出に蛍光シグナル2(FS2)を選択します。
   2. 単一のmiRNAをトランスフェクションした細胞から単離したEVサンプルを使用して、蛍光色素の補正パラメーターを設定します。新しいプロットで、関心のあるEV人口をゲートします。
   3. トランスフェクションした細胞から単離したEVにおける蛍光色素標識miRNAの発現解析では、FSC、SSC、BL1、およびYL1チャンネルをそれぞれ370、370、400、および400電圧単位に設定してEVサンプルを分析します(図2A、B)。
   4. ゲート付き母集団の統計量を記録し、ヒストグラムとドットプロットを使用して可視化します。
10. 実験の追加のサンプルまたはコントロールについて、上記の手順を繰り返します。

6. qRT-PCRによるEVにおけるmiRNAの放出の検証

1. メーカーの指示に従って、miRVana RNA分離キットを使用してEVおよび親細胞からRNAを抽出します。
   注:EV から単離された RNA の総量は、通常、標準的なナノドロップの最小量しきい値を超えないため、EV から単離された RNA の定量は不可能です。これは、EVサンプルからのリボソームRNAの枯渇によるもので、Agilent Bioanalyzerを使用して検証できます。したがって、EV-RNA 定量の完全性スコアは通常信頼性がなく、EV-RNA 量の真の表現ではありません。したがって、EV-RNAおよび細胞RNAのqRT-PCR定量には、同数の細胞から単離した後、等量のRNA単離株を使用しました。qRT-PCRのノーマライゼーションには、以前に取得したRNAシーケンシングデータから決定された複数のサンプルに遍在するmiRNAを使用しました。
2. 抽出したRNAを、small RNAに特異的な逆転写酵素キットを用いてcDNAに変換します。
3. メーカーの指示に従って、cDNAテンプレートとmiRNA特異的プライマーを使用してqRT-PCR反応をセットアップします。
   注:バリデーション実験では、miRCURY LNA qRT PCRキットとメーカーの対応するプライマーを使用して、細胞miRNAおよびEV-miRNAの発現を評価しました。

Results

ここでは、細胞からEVへのmiRNAの放出を調べるための強力なツールとしてフローサイトメトリーを利用しています。このプロトコルを用いて、cell-miRNAおよびEV-miRNAをトランスフェクションした細胞のフローサイトメトリー解析により、EV-miRNAに対応する蛍光シグナルが連続的に減少し、細胞miRNAに対応するシグナルが細胞内に保持されることが明らかになりました。蛍光色素の結合が EV への miRNA 放出を妨げないようにするため、miR-451a を 2 つの別々の蛍光色素(Alexa fluor 488 と Alexa fluor 750)に結合させ、細胞の保持を評価しました。この結果は、トランスフェクション後の個別の蛍光色素シグナルの検出間のばらつきが最小限であることを示しており、このアプローチの信頼性が検証されています(図3A、B)。

蛍光タグ付きmiR-451aが細胞から失われるには、RNAの分解など、さまざまな理由が考えられるため、細胞の損失がEVの存在量と一致する...

Discussion

新たに確立されたプロトコルにより、EV-miRNAのトランスフェクション後のEVへのmiRNA放出の動態を捕捉することができます。このアプローチでは、サイトメーターの能力に応じて、複数のEV-miRNAと細胞miRNAの同時解析が可能になります。さらに、フローサイトメトリー解析はEV miRNAの生物学に関する貴重な洞察を提供することができますが、限界がないわけではありません。ただし、いくつかの制限は、より包括的な理解のために他の手法と組み合わせて使用すると克服できます。

EV生物学における新たな関心分野は、EVへのmiRNAの選択的輸送を理解することである^15,16。このプロトコールは、miRNAの選択的輸送を研究するための強力なツールを提供しますが、重要な課題の1つは、能動的および受動的輸送を区別することです。miRNA を高濃度で過剰発現させると、miRNA の輸送が変化し、不適切な受動的ローディングが発生する可能性があるため、注意が必要です。したがって、m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量遠心チューブ	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon チューブ	Corning	352097
6 ウェル透明平底処理組織培養プレート	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 &Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	粒子検出のゲートとパラメータを設定するには
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	EVの蛍光解析用
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	細胞の蛍光解析用
細胞培養インキュベーター	N/A	N/A	37°Cの維持 °Cおよび5% CO2
細胞培養培地	N/A	/A
対象細胞株に特異的 対象細胞株	N/A	N/A	関心のあるmiRNAのEVおよび細胞量について試験および評価された任意の細胞株。
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	目的の細胞株によって保持され、選択的にEVに輸出されないmiRNAs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs decided to be selectively sorted into EVs
蛍光顕微鏡	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA 逆転写酵素	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR グリーン PCR	Qiagen
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
ヌクレアーゼフリーウォーター	Fisher Scientific	4387936
パラホルムアルデヒド、PBS中4%	Fisher	AAJ61899AK
試薬リザーバー 非滅菌	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
トリプシン0.25%	フィッシャー
超遠心分離機	N/	A 該当なし