プレートリーダーベースの蛍光アッセイを使用したミトコンドリア酸素消費量の評価

Summary

酸素消費量の評価は、ミトコンドリアの機能に関する重要な情報を提供します。蛍光プレートリーダー付きの蓄光プローブを使用すると、特殊な機器なしで正確で再現性のあるデータを簡単に取得できます。このアッセイにより、どのラボでも単離されたミトコンドリアの酸素消費量を測定し、呼吸制御比を計算できます。

Abstract

ミトコンドリアは、細胞呼吸、ATP産生、アポトーシスの制御、代謝経路の中心的なハブとしての機能など、多くの重要な機能を果たしています。したがって、ミトコンドリアの機能を実験的に評価することで、異なる集団や疾患状態の違いについての洞察を得ることができます。さらに、単離されたミトコンドリアが実験を進めるのに十分な健康状態にあるかどうかを評価することも重要です。異なるサンプルのミトコンドリア機能を比較するためによく使用される特性の1つは、酸素消費量です。無傷の細胞または組織から単離されたミトコンドリアのいずれかにおける酸素消費量とその後の呼吸制御比の計算は、3つの目的すべてに役立ちます。ブラシトカゲの肝臓から分離したミトコンドリアと、溶液中の酸素濃度の変動に敏感な燐光プローブを併用し、蛍光プレートリーダーを用いて酸素消費量を測定しました。この方法は、迅速かつ効率的であるだけでなく、少量のミトコンドリアで、特殊な機器を必要とせずに実施できます。ここで説明する段階的なプロトコルにより、研究者はミトコンドリアの機能評価にアクセスできるようになります。

Introduction

ミトコンドリアは、真核細胞に見られる、細菌とほぼ同じ大きさの細胞小器官です。それらはDNAを含み、外側と内側の2つの膜を持っているため、ユニークな細胞小器官です。ミトコンドリアの外膜と内膜は膜間空間によって分離されており、内膜はマトリックスと呼ばれる最も内側のコンパートメントの周りにクリステと呼ばれる構造に折り畳まれています。これらのクリステは、内膜の表面積を増加させるため、クリステを使用する複数のプロセスが同時に発生する可能性があります。ミトコンドリアは、アポトーシスの制御や複数の代謝経路の収容など、多くの細胞機能に関与していますが、ATPの産生におけるミトコンドリアの重要な役割は、細胞の生存に不可欠です。実際、細胞のエネルギーの90%はミトコンドリア¹に由来しています。ATPの産生には、ミトコンドリア膜電位(Δψ)と呼ばれる外膜と内膜の電気化学的な差が生じ、これはH⁺ イオンがマトリックスから膜間空間に送り込まれるときに発生します。ATP産生は、最終的にミトコンドリア呼吸鎖(ETC)を通る電子移動による還元当量の酸化中に利用されます。最終的な電子受容体は酸素分子(O₂)です。酸素が消費されると、H⁺ の濃度差は最大まで蓄積され、その時点でH⁺ イオンはATP合成酵素複合体を通過して膜間空間からマトリックスへの濃度勾配を下ります。H⁺ イオンの移動により、ATP合成酵素の立体配座が変化し、ADPは無機リン酸塩と近接して反応してATPを生成します。最後に、ATPはミトコンドリアマトリックスからサイトゾルに移され、リン酸の加水分解中に放出される大量の自由エネルギーにより、保存または反応を促進するために使用できます。この全過程を酸化的リン酸化といい、酸素を消費するため、ミトコンドリアは呼吸する^{と言われています2}。

Δψの蓄積と強度、_O2 の減少量(酸素消費量と呼ばれる)、およびATPの生成はすべて、細胞の健康状態の指標として使用できます。Δψ、総ATP含有量と総産生、酸素消費量の測定などのミトコンドリア機能研究は、従来の生化学的方法、またはプレートベースのアッセイでの蛍光と発光のいずれかで定量化できます。例えば、ミトコンドリアに特異的に結合するテトラメチルローダミンエチルエステルなどの蛍光色素を用いて、ミトコンドリア膜電位を異なるサンプル間で比較することができます。ATPの生成は、ATP濃度と相関する変化を持つ反応に発光タンパク質を添加することでモニターできます。OXPHOS中の酸素消費率、つまり絶対呼吸速度を定量化することで、ミトコンドリア機能とエネルギー代謝の格差の原因を解明することができます。酸素消費量の評価は、呼吸制御比(RCR)を計算するために使用できます。RCR値は、ミトコンドリアの主要な機能であるADPの流入に応答してミトコンドリアがATPを作る能力を表しています。RCR値は、単離されたミトコンドリアの全体的な状態を示し、さまざまな実験的治療に対する反応の比較を可能にします。RCR値の差は、ミトコンドリアの機能不全を表している場合もあれば、2つ以上の供給源から分離された異なるミトコンドリア間の生物学的な違いを示している場合もあります。単離されたミトコンドリアの機能の別の重要な尺度は、O₂のモルあたりに合成されるATPのモル、またはP / O比³として定義されるミトコンドリア効率です。

ミトコンドリアのパラメータを測定することで収集できる情報量や、その情報を活用できるさまざまな事例を考えると、機能データを効率的に収集する能力は、さまざまな研究分野で役立つと考えられます。ミトコンドリアの酸素消費量の測定は、測定に必要なサンプルサイズによって制限されるクラーク電極や、最近ではミトコンドリアの呼吸やその他の複数のパラメータを測定できる洗練された機器など、非常に特殊な機器を使用して何十年にもわたって行われてきましたが、コストがかかりすぎる可能性があります。このプロトコルは、酸素感受性燐光プローブ(MitoXpress)^4,5を使用した適応された代替アプローチです。プローブ信号は、時間分解蛍光モードのプレートリーダーで検出され、経時的な連続測定が行われます。燐光は、蛍光と比較して、吸収された光子と放出された光子の間のエネルギー差が大きいため、信号の変化を継続的に監視するのに適しています。これにより、ミトコンドリアの代謝に焦点を当てた研究室や、高度に専門化された機器を購入できる研究室だけでなく、ほぼすべての研究室でこれらの測定を行うことができます。私たちが利用するモデルシステムは、3つのツリートカゲ、2つの親種、および1つの侵入種(1つの親種からの核DNAと他の親種のミトコンドリアを含む)から分離されたミトコンドリアです。これらのトカゲが選ばれたのは、異なる核DNA源とミトコンドリアDNA源を持つ雑種には代謝とエネルギーの影響があるという仮説を立てたためです。私たちは、より多くの研究者や研究分野がこのタイプのアッセイへのアクセスを増やすことができるマルチモードプレートリーダーを備えた市販のアッセイキットを利用しました。

Protocol

トカゲは、動物実験福祉局とイーロンの施設動物管理および使用委員会のガイドラインに概説された方針に従って、_CO2 窒息によって安楽死させられ、その後直ちに斬首されました。

1. ミトコンドリアの単離⁶

注:これらのステップ全体を通して、すべての溶液(表1)を冷たく保ち、サンプルを氷の上に置いてください。

1. 肝臓を取り出して重量を量り、~3 mL の氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (1x、-/-) ですすいでください。
2. 新鮮なかみそりの刃で1mLのL-MIBで肝臓をミンチにします。
3. 組織とL-MIBの総量を2 mLにし、Dounceホモジナイザーで肝細胞を4回機械的に破壊します。
4. ホモジネートを300 × g (37°C、10分)で遠心します。
5. 上清を新しいチューブに移し、氷の上に置きます。
6. ペレットを2mLのL-MIBに再懸濁し、再ホモジナイズし、300 × g (37°C、10分)で再度遠心します。
7. 両方のスピンからの上清を混合し、10,000 × g (37°C、10分)で遠心分離します。
8. ペレットを~0.350 mLのL-MIBに再懸濁します。
9. ミトコンドリア含有量の近似値として使用する総タンパク質の量(ミトコンドリアmg/L-MIB1mL)を決定します^4,5,6。

2.酸素消費量

1. 次の手順で使用するすべての溶液(表1)をウォーターバスで30°Cに予温します。
2. ステップ1.9のタンパク質濃度アッセイの結果に基づいて、LEB中のミトコンドリアを6 mg/mLに希釈します。
3. アッセイを滅菌済みの96ウェル黒壁透明底板にセットアップします(表2)。
   1. サンプル(L-EBバッファーまたはミトコンドリアサンプル)50 μLを適切なウェルに加えます。
   2. 50 μLの処理剤(L-EB、グルタミン酸/リンゴ酸、またはグルタミン酸/リンゴ酸とADP付き)を加えます。
   3. プローブストックをL-EBで1:10に希釈し、蛍光プローブ100μLを各ウェルに加えます。
   4. すべてのウェルに50μLの重鉱物油を静かに加えて、周囲の酸素を排除します。
4. プレートの底面から380/650 nmの励起/発光で、1.5分ごとに45分間蛍光測定値を読み取ります。30,000 μsの時間遅延と100 μsの測定ウィンドウでキネティックモードを使用します。

3. データ分析

1. プレートリーダーのコンピュータから生データファイルを.xlsファイルとしてエクスポートします。
2. ファイルを開き、生データをコピーして新しいタブに貼り付け、行と列に適切なラベルを付けます。
3. L-EBバッファーのみをコントロールサンプルにプロットし、L-EB + G/Mを相対蛍光単位(RFU)対時間としてプロットします。
   注:ミトコンドリアが存在しないため、これらの線は比較的平坦でなければならず、したがって、酸素濃度の変化は検出されません。
4. L-EB + G/M サンプル値を RFU 対時間としてプロットします。
5. 読み取り値がより一貫性を持つ場所を決定し、コントロールに対して平坦化します。
   注:ここから実験サンプルのデータ解析を開始する必要があります( 図1Aの矢印でマークされています)。反応が平らになり、最大に達するまでに10〜15分かかる場合があります。
6. ステップ 3.5 で設定した時点以降のデータ (「トリミング済み」データと呼ばれます) のみを含む新しいプロットを作成し、分析する生データを視覚化するための最適な線を追加します。
7. トリミングされた制御バッファのみのデータ (黄色で強調表示) の平均 RFU 値を計算します。この値は、以下の酸素計算のベースラインとして最小RFU値として使用されます。
8. 酸素消費率の計算(μM O₂/min)
   1. ステップ3.6の生データの線形領域(つまり、トリミングされたデータ)をコピーして貼り付け、各時点^{7、8、9、10}でのG / M + ADP処理のミトコンドリアサンプル中の酸素濃度を決定します。
   2. 式(1)⁵ を使用して、各時点の酸素濃度を求めます。[O₂]_a は、空気飽和バッファー中の酸素濃度(30°Cで235mM)です。I(t)、Ia、およびIoは、時間 t (例:サンプル+ G / M + ADP)におけるサンプル+プローブの蛍光シグナル、ステップ3.7で計算された空気飽和バッファー中のプローブの平均シグナル、および脱酸素バッファー内の最大シグナル(達成可能な最大シグナルに設定)です。
      (1)
   3. ステップ 3.8.2 で計算した [O₂]_t 値と時間の関係をプロットし、線形近似曲線と最適近似線の方程式を追加します。
      注意: 各線の傾きを酸素消費率として使用します。任意のサンプルの重複または三重化を集約し、消費率の比較に使用できます。
9. ADPありのミトコンドリア呼吸とADPなしのミトコンドリア呼吸をそれぞれ状態3と2で割ってRCRを計算します。

Results

酸素消費率とミトコンドリアRCRは、燐光性酸素感知プローブと標準的な蛍光プレートリーダーを備えたアッセイキットを使用して、3つの異なるトカゲのミトコンドリアから決定されました。以前の研究では、このキットのプローブは酸素消費に直接相関しており、そこでは燐光が分子状酸素によって消光され、ミトコンドリア呼吸により酸素レベルが低下すると蛍光シグナルが増加することが立証されています^7,11。RFU値は、コントロールサンプルと実験サンプルの両方について経時的に記録され、その後分析されます。コントロールウェル(バッファーのみ、グルタミン酸/リンゴ酸で処理されたバッファー、およびグルタミン酸/リンゴ酸+ ADPで処理されたバッファー)のRFU測定値を時間に対してプロットし、実験サンプルウェルの蛍光の変化がミトコンドリアの存在によるものであることを確認しました。さらに、グルタミン酸/リンゴ酸+ ADP制御により、データ収集中の酸素のベースライン量が可能になります。単離されたミトコンドリアを含む実験サンプルも、対照群と同じグラフにプロットしました。

図1A は、単離されたミトコンドリアのサンプルからRFUが時間の経過とともに増加することを示しています。これは、対照群の比較的平坦なRFU値とは対照的にです。反応の平衡化には時間がかかるため、コントロールサンプルの読み取り値がノイズが多くなく、横ばいになるまで、最初の 10 回ほどの読み取り値はデータセットから削除されます(補足表 S1 および 補足図 S1)。次に、グルタミン酸/リンゴ酸 + ADPで処理したミトコンドリアサンプルの残りの値を、式(1)を使用して各時点の酸素濃度に変換し(プロトコルステップ3.2を参照)、時間に対してプロットします。 図1B は、 図1A に見られる実験サンプル(交差)の結果を示しており、R² 値が1に非常に近く、線の傾きを計算できます。線の傾きが負になるのは、酸素が消費されると、そのサンプル内の全酸素濃度が低下するためです。これと同じプロセスを、ADPを含まないグルタミン酸/リンゴ酸で処理した同じミトコンドリアサンプルに対して繰り返し、酸素消費率を求めます(補足表S2 および 補足図S2)。次に、ADPの有無にかかわらず、それぞれ状態3と2を表すミトコンドリア呼吸を使用して、各サンプルタイプのRCRを計算できます(補足図S2)。と並べて比較すると、3つの異なるタイプのツリートカゲの平均RCRは、ミトコンドリアが侵入したハイブリッドのRCRがどちらの親タイプよりも有意に低いことを示しています(図1C)。ハイブリッドトカゲのミトコンドリアは、2つの親タイプと中間の酸素消費率を持っていました(図2)。

図1:酸素消費アッセイ結果の例。 (A)緩衝液のみの対照反応、および単離されたミトコンドリアを含む反応をグルタミン酸とリンゴ酸(G/M)で処理した反応の生データ(ADPの添加の有無にかかわらず)。蛍光を経時的にモニターした。酸素が消費されると、蛍光が増加します。バッファーのみの反応(G/M、丸で示し、G/M+ADP、三角で表示)とG/M処理を施したミトコンドリア(四角で表示)では変化が見られませんでした。G/M + ADP(プラス記号で示す)で処理されたミトコンドリアは酸素を消費しました。(B) Aで示したG/M+ADPで処理したミトコンドリアの生データから算出した酸素濃度の経時変化。(C)室温で測定した3種類のトカゲのミトコンドリアのRCR値。このフィギュアはヘネル&デルガイゾ・ムーア¹²から再現しています。統計分析は、R.略語のANOVAを使用して実行されました:G =グルタミン酸;M =リンゴ酸;RCR = 呼吸制御比。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:3種類のトカゲのミトコンドリアの酸素消費率。箱ひげ図は、酸素消費率の中央値を棒で、平均を点で示しています。親のタイプであるウロサウルス・グラシオサスとウロサウルス・オルナトゥスは、互いに大きく異なっていました。導入型(ハイブリッド)は親型と中間であり、どちらとも有意差はありませんでした。このフィギュアはヘネル&デルガイゾ・ムーア¹²から再現しています。略語: Ug= Urosaurus graciosus; この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

表1:プロトコルで使用される溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:酸素消費アッセイのプレートマップ。 各サンプルについて、少なくとも6つのウェル(3つのコントロールウェル:L-EBのみ、L / EBとG / M処理、L - EBとG / M + ADP処理、3つの実験ウェル/サンプル:L-EB処理、L-EB+ G / M、およびL-EB G / M + ADP処理のミトコンドリア)を確保します。可能であれば、各実験サンプルを重複または三重に分析します。略語:G =グルタミン酸;M =リンゴ酸;L-EB = トカゲ特異的実験バッファー。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:データプロット。 (A)サンプルとコントロールの比較のために、すべての生データをプロットします。(B) 補足表S1 の強調表示された列からの縁取りされた生データのプロットで、ミトコンドリアのサンプルを含むウェルのみがRFUがかなり増加したことを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:酸素消費量と呼吸制御比。 (A)補足表S1からの酸素消費データをプロットして、最適な線の方程式を見つけることにより、状態2と状態3の値を決定します。(イ)(A)の線の傾きを使用してRCR比を計算し、状態2と状態3を表しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S1: 生データの代表的な例。 強調表示された列は、図や計算に使用されるデータ(つまり、トリミングされたデータ)です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:トリミングされたデータとその後の酸素消費量の計算の代表的な例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ミトコンドリアの機能測定は、疾患状態と非疾患状態、同じ動物の異なる組織タイプ、または異なるサンプルタイプ間など、異なるサンプルを比較する場合に役立ちます。私たちは、ミトコンドリアを侵入させたハイブリッドツリートカゲに代謝的な結果があるという仮説を検証するために、後者の比較を使用しました。ミトコンドリアの機能を実験的に確認するには、Δψ、総ATP含有量、ATP産生、呼吸制御、酸素消費速度の定量化など、さまざまな方法があります。単離されたミトコンドリアの酸素消費量測定は、クラーク電極やより洗練されたタツノオトシゴXFなどの特殊な機器を使用して実行できます。ただし、これらの方法は、測定を実行するために必要なサンプルサイズによって制限される場合もあれば、法外なコストがかかる場合もあります。蛍光を読み取ることができるマルチモードプレートリーダーは、細胞生物学および生化学研究室の標準的な装置となっています。したがって、ミトコンドリアの酸素消費量を定量的に分析する別のアプローチは、蛍光プレートリーダーを備えた市販のキットを使用することです。このステップバイステップのプロトコルでは、酸素消費量の測定方法と計算の実行方法について説明します。そして経済的に孤立したミトコンドリアで。ADPが供給されたときにミトコンドリアがATPを生成する能力を正確に測定することは、状態3呼吸と呼ばれ、サンプル間のOXPHOSの直接比較を可能にし、その違いは機能的な違いを示すことができます。さらに、状態3の呼吸は、単離されたミトコンドリアの品質も示し、単離手順が機能したかどうか、および/またはサンプルが他のアッセイで使用するのに十分良好であるかどうかを判断することができます。RCR値は、状態2(グルタミン酸とリンゴ酸のみ、Δψを構築)と状態3の値(グルタミン酸とリンゴ酸にADPを加えて、ΔψをATP産生に使用できるように)を使用して計算され、比較および単離されたミトコンドリアの健康状態についてさらに別の情報を提供します。提示されたデータは、この論文で提供されている方法が、高度に専門化された機器を必要とせずに、異なるサンプルタイプ間のばらつきを解読し、酸素消費率とRCR値を測定するのに役立つことを示しています。

このプロトコルでは、トカゲからミトコンドリアを新たに単離し、酸素消費量は、製造元のプロトコルに従ってMitoXpress Xtra Hsアッセイを使用して決定され、Hynesら⁴ およびWillら⁵ に従って変更されましたトカゲは、総体重が3.3gから5.1gの範囲であり、平均0.170gの肝臓組織/トカゲでした。 その結果、~0.350 mLの濃縮された粗ミトコンドリアが得られました。単離されたミトコンドリアは、6 mg/mLタンパク質での酸素消費アッセイに使用されました。プロトコールステップ1.7で測定したミトコンドリアタンパク質濃度が低い場合は、サンプルを10,000 × g で再紡糸し、ペレットを少量のL-MIBに再懸濁することができます。また、少量の肝臓サンプルや肝臓全体が利用できない場合に、わずか4 mg/mLを成功裏に使用したことにも注意してください。

アッセイ開始時にサンプルのガスと温度の平衡を確保するために、プロトコルセクション2で使用するすべての溶液をウォーターバスで30°Cに予熱する必要があります。プロトコルセクション3では、溶存酸素の変化率(mM / min)は、各サンプルの減少する酸素濃度プロファイルの初期傾きから外挿されます(プロトコルステップ3.3; 補足表S1 および 補足図S1)。サンプル+G/M治療率は状態2のミトコンドリア呼吸を表し、G/M+ADP治療率のサンプルは状態3のミトコンドリア呼吸を表しています。したがって、RCRは、各サンプルの状態3の値を状態2の値で割ることによって、各サンプルについて計算されます(補足表S2)。

酸素消費量は、ここで示したように、固有のサンプル間で比較することも、1つのサンプル内の異なる処理間で比較することもできます。後者の場合、化学処理自体が燐光プローブと相互作用しない可能性を排除するために、ミトコンドリアの有無にかかわらず、ビヒクルのみの制御など、追加の制御が必要になる場合がある。さらに、収集された酸素消費量とRCRデータは、同じサンプルから収集された他のアッセイのデータと組み合わせて使用できます。ミトコンドリアが単離されると、ミトコンドリアを複数のアッセイで利用して、その機能のより完全な全体像を提供することができます¹²。Δψ、総ATP含有量、およびATP回転率の測定は、組み合わせられたアッセイの一部です。さらに、ETC、OXPHOS、およびATP合成酵素阻害剤をアッセイで使用することで、さまざまなミトコンドリアサンプルタイプについてさらに完全に理解することができ、生成されたデータから導き出される結論が強化されます。

単離されたミトコンドリアで測定できる別のパラメータはミトコンドリア効率であり、これはO₂³のモルあたりに合成されるATPのモルのP / O比として定義されます。P/O比は、このプロトコルの拡張で、状態3のミトコンドリアが反応で供給されるADPを排出できるようにし、次にADP基質のアリコートを添加し、続いてオリゴマイシンの添加によるATPシンターゼの阻害を添加することにより計算できます。これらの追加ステップにより、ミトコンドリアが酸素を消費し続け、強いΔψを維持して最大ATPを生成するときに発生する状態4の計算が可能になり、ミトコンドリアの漏れに関する情報が得られます(H ⁺イオンがATPシンターゼを使用せずにマトリックスに戻るため、Δψが散逸する場合)、最終的にミトコンドリアの機能不全を示します。さらに、状態4の測定では、新たに形成されたATPをマトリックスから移動させ、同時にADP基質を取り込むADP/ATPトランスロケーターが機能しているかどうか、および膜を越えるADPおよびATPの漏れが発生しているかどうかも明らかになります。ATP合成酵素を阻害するオリゴマイシンの添加は、実際の機能不全によりミトコンドリアが漏れているかどうかを判断するためのコントロールです。P/O比を計算するために状態4を測定することは、3つのミトコンドリアサンプルタイプ間で比較するために求めた情報の範囲を超えていましたが、ミトコンドリア機能に関する別のデータであり、このプロトコルの拡張として行うことができます。最後に、ミトコンドリアは、培養中の細胞や、マウスやラットのさまざまな組織(肝臓、心臓、脊髄など)から単離できることは注目に値します。MIBおよびEBの定式化、ならびに単離プロトコル^{の調整が必要な場合がある}4,13,14,15,16。さらに、製造元の指示に従って、このアッセイは、無傷の細胞全体で実施できます。したがって、提示された方法はトカゲや肝臓のミトコンドリアに限定されず、多くの異なる科学サブディシプリンにわたる幅広い実験モデルに適しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェルブラック/光学ボトムプレート	サーモフィッシャー	265301	底がクリアな未処理のブラックウォールプレート。
ADP	Sigma	A2754	希釈 100 & マイクロ;使用直前にEB入りのMストック。
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	タンパク質アッセイのために、水に2 mg/mLのストックを入れます。
ダルベッコス1x PBS(-/-)	シグマ	D8537PBS	にMg2 + < / sup>またはCa2 + < / sup>イオンがないことを確認してください。
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Σ	P3786
KH2PO4	Σ	P0662
L-グルタミン酸		ΣG1251
L-グルタミン酸 カリウム塩	Σ	S372226
L-リンゴ酸	Σ	M8304
L-リンゴ酸モノカリウム塩	シグマ	49601
MitoXpress酸素消費キット	Agilent	MX-200-4	キットには、プローブストックとHS鉱物油が含まれています。
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	任意のタンパク質アッセイで代用できます。
Rバージョン3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax microplate reader EnSpire Multi-mode Plate reader and software	PerkinElmer		Standard fluorescent plate-reader
Trisma base	Sigma	T6066	Trisベースの任意のバージョンが利用可能です。